膀胱癌细胞p16抑癌基因失活的研究

目的 探讨膀胱癌中p16基因失活情况。方法 采用PCR、PCR—SSCP和DNA甲基化分析技术等方法对25例膀胱癌组织中p16基因进行检测。结果 25例膀胱癌标本中有6例存在p16基因纯合性缺失，缺失率为24％；无1例出现点突变；16例出现异常甲基化，检出率为69．6％(16／23)。结论 外显子2的纯合性缺失在安徽区域发生的膀胱癌中可能不是一个较频繁发生的事件；通过CpG岛异常甲基化失活可能是膀胱癌p16基因失活的主要机制。     

膀胱移性细胞癌p16基因缺失、突变、甲基化及其蛋白表达的研究

目的对25例膀胱移性细胞癌(bladder transitional cell carcinoma,简称膀胱癌)患者的p16基因第一、第二外显子纯合性缺失,第二外显子的点突变,第一外显子区5＇CpG岛的甲基化情况及p16蛋白表达进行检测,探讨p16基因在膀胱癌中失活的方式及p16蛋白表达与膀胱癌之间的关系. 方法取患者膀胱癌组织,用酚/氯仿法提取癌组织基因组DNA,设计p16基因第一、二外显子引物,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、PCR-单链构象多态性 (PCR-single strand conformational polymorphism, PCR-SSCP)、甲基化敏感限制性内切酶-PCR分析方法,对25例膀胱癌患者的癌组织基因组DNA的p16基因第一、二外显子的纯合性缺失、第二外显子点突变及第一外显子区5＇CpG岛的甲基化情况进行分析.应用S-P免疫组织化学方法检测25例膀胱癌和6例正常膀胱黏膜组织中p16基因的表达情况,并分析其意义. 结果在这25例膀胱癌患者中,发现p16基因第二外显子缺失者有4例,第一外显子和第二外显子共同缺失者有1例,第一外显子缺失者1例,p16基因的缺失率为24%(6/25);未发现p16基因第二外显子的点突变; p16基因第一外显子区5＇CpG岛的甲基化率为69.6%(16/23).p16基因表达在膀胱癌组织中阳性率为52%(13/25),6例正常膀胱黏膜组织中均阳性,两者比较差异有显著性(P<0.01).随病理分级、临床分期的上升和预后的不良,p16基因的阳性表达率有下降趋势,但差异无显著性(P＞0.05).结论 p16基因的失活方式主要有三种:纯合性缺失、点突变和5＇CpG岛的甲基化,但外显子2的纯合性缺失在安徽区域发生的膀胱癌中可能不是一个较频繁发生的"事件";通过p16基因第一外显子区5＇CpG岛异常甲基化失活可能是膀胱癌p16基因失活的主要机制.在这25例膀胱癌患者中,未发现p16基因的点突变,但仍不能排除这种失活机制,我们将通过扩大样本,进一步研究p16基因的点突变情况.p16基因表达产物与膀胱癌的发生发展及预后可能有关系,也有待于扩大例数进一步研究.p16基因表达产物可作为诊断膀胱癌的指标之一.     

INK4系列抑癌基因(p16、p15、p18、p19)在白血病中的甲基化

目的 探讨p16基因家族失活与白血病发生、发展及预后的关系，进一步阐明白血病发病机制，监测发病过程。方法 采用甲基化敏感限制内切酶Hpa Ⅱ或Msp Ⅰ结合PCR技术研究白血病患者p16、p15、p18、p19基因甲基化状况：(1)研究不同类型、不同阶段白血病p16基因家族外显子1和／或外显子2纯合子缺失，(2)用REP-PCR分别对上述病例中无外显子1缺失的病例进行甲基化研究，探讨甲基化发生频率，分析与白血病发病关系。结果 p16、p15基因外显子1在急性白血病(AL组)甲基化率分别为35．29％，48．65％，急性非淋巴细胞白血病(ANLL组)为25％，37．5%，急性淋巴细胞白血病(ALL组)为60％，69．23％，初治AL组为29．09％，42．10％，复发AL组为61．54％，70．59％，慢性粒细胞白血病(CML)慢性期、急变期、白血病完全缓解(CR-AL)、对照组均无甲基化。p18、p19基因无论在AL组、ALL组、ANLL组、复发AL组、初治AL组，或是在CML的慢性期、急变期、CR-AL、对照组均无甲基化。结论 (1)在p16基因家族中，p16、p15基因甲基化在AL的发生频率较高，ALL甲基化率明显高于ANLL，以复发ALL组最高。p18、p19基因在AL组中未见甲基化。(2)在ALL中，p15甲基化率高于p16甲基化率，在ANLL中，p16、p15基因的甲基化率高于对照组。(3)p16、p15基因甲基化可作为AL病程进展、复发、预后的指标之一。(4)p16、p15基因甲基化在CML病程中(慢性期、急变期)意义不大。     

人原发性肝癌中p16基因表达及CpG岛甲基化状态的研究

目的：进一步探讨人原发性肝癌中p16基因mRNA转录水平变化与其基因启动子区CpG岛甲基化的关系，及其在肝癌发生中的意义。方法：采用狭缝印迹杂交检测20例人原发性肝癌及相应的癌旁、远癌组织及2例正常人肝组织中p16基因mRNA表达水平，以甲基化特异性PCR分析各组织中p16基因启动子区CpG岛的甲基化状况，并进行统计分析。结果：20例人原发性肝癌中14例（70％）p16 mRNA水平比远癌组织显著降低；13例（65％）显示p16基因启动子区CpG岛甲基化，其中84．6％（11例）伴p16 mRNA转录水平降低。结论：人原发性肝癌中存在高频率的p16基因表达失活，其主要机制可能是启动子区CpG岛甲基化抑制了基因的转录，在人原发性肝癌的发生发展中有重要作用。其临床诊断和治疗意义有待进一步深入研究。     

基因甲基化与急性淋巴细胞白血病的关系

目的：探讨p16基因甲基化在急性淋巴细胞白血病(ALL)发生机制中的作用。 方法：采用限制性内切酶酶切结合多聚酶链反应方法检测82例ALL患者白血病细胞p16基因部分启动子和外显子1 CpG岛甲基化的情况。 结果：31例ALL患者存在p16基因的甲基化,1例p16基因纯合缺失;p16存在甲基化与纯合缺失的患者初次化疗完全缓解率和平均生存时间低于p16基因正常表达者。 结论：p16基因甲基化在ALL发生机制中有一定的作用,可作为评估ALL预后的一个指标。     

卵巢癌组织中p16基因甲基化的研究

目的 探讨抑癌基因p16基因5’端CpG岛甲基化在卵巢癌癌变过程中的作用。方法 应用甲基化特异性PCR(MSP)分别检测17例卵巢癌样本中p16基因启动子区域(M1／U1)以及启动子和第—个外显子5’端部分(M2／U2)的甲基化状态。结果 在我们检测的17例卵巢癌样本中，有3例M1阳性，阳性率为17．65％(3／17)，这些病例恶性度较低。无1例M2阳性。结论 抑癌基因p16基因5’端CpG岛甲基化参与卵巢癌特别是恶性度低的卵巢癌的癌变过程，它可能与其它抑癌基因协同作用。     

原发性肝细胞癌中p16、p15、p53基因缺失、突变以及HBV DNA在肝细胞癌中整合的研究

目的构建人p16基因第二外显子cDNA克隆,制备其cDNA探针，建立p16基因第二外显子PCR-Southern Blot分析方法。研究原发性肝细胞癌(HCC)p16基因第一、二外显子、p15基因第二外显子纯合性缺失，p53基因第七外显子纯合性缺失、点突变以及HBV 前C区、S区、X区在HCC中整合情况。方法用RT-PCR获得p16基因第二外显子cDNA，将其插入质粒pGEM-T中，构建为重组质粒pGEM-pl6。经蓝白选择、限制性内切酶酶切图谱分析、DNA序列分析筛选获得重组质粒的阳性克隆，插入片段经限制性内切酶酶切、纯化后，用随机引物法标记地高辛，以此为探针，用Southern Blot方法分析p16第二外显子PCR产物。应用PCR、PCR-SSCP和PCR-RFLP等方法，对临床38例HCC手术后标本中的p16基因第一、二外显子、p15基因第二外显子、p53基因第七外显子纯合性缺失和点突变进行分析。应用PCR和3' 末端碱基特异性PCR分析肝细胞癌基因组HBV前C区野生型和突变型、PCR分析S区和X区整合的情况。同时检测了血清中HBV 前C区的阳性率。结果重组质粒的限制性内切酶酶切图谱分析表明其酶切位点与原设计相符，插入片段大小为307bp，与引物区间大小一致；地高辛标记探针可与p16 PCR产物杂交。发现在这38例HCC患者中，p16基因第二外显子的缺失率为34.2%，p16基因第一外显子和p15基因第二外显子未发现缺失；未发现p53基因第七外显子纯合性缺失，但4例存在p53基因249密码子点突变，且均为杂合型突变，突变率为10.53%。HBV前C区野生型阳性率为42.1%, 其中10例伴有突变型阳性(26.3%)。HBV X区阳性率为44.7%，HBV S区阳性率为50%。患者血清中，HBV 前C区野生型阳性率为15.8%, 突变型阳性率为18.4%。结论所获重组质粒为pGEM-pl6设计构建，并成功地获得p16第二外显子的cDNA探针和建立了p16 Southern Blot分析方法。所获结果提示在肝细胞癌中p16基因第二外显子的纯合性缺失是p16基因失活的一个重要方式，而纯合性缺失不是p15基因在肝细胞癌中的失活方式，但并不排除存在其它失活方式。p53基因第七外显子的杂合性突变提示有肿瘤遗传倾向。未发现纯合性点突变提示在肝细胞癌发生机制中p53基因第七外显子的点突变并不占据主导地位。HBV DNA 在原发性肝细胞癌基因组中可能存在整合,并在HCC发生过程中起一定作用。     

胃癌p16基因启动子CpG岛甲基化研究

目的：探讨p16基因启动子CpG岛甲基化在胃癌中的表达及意义．方法：采用特异性甲基化PCR（MSP）法检测p16基因启动子CpG岛甲基化水平．结果：对照组未检测到CpG岛甲基化,胃癌细胞株均检测到CpG岛甲基化,23例（74％）胃癌组织检测到CpG岛甲基化．此外,17例（74％）癌旁组织检测到CpG岛甲基化．胃癌组织p16基因CpG岛甲基化与分化程度及淋巴结转移之间无相关关系（P〉0．05）．结论：胃癌广泛存在p16基因启动子CpG岛甲基化,并且可能是胃癌发生的早期分子事件．     

大肠癌p16抑癌基因甲基化及与Dukes分期的关系

目的 检测大肠癌患者p16基因启动子CpG区甲基化的改变,探讨其与大肠癌发生、发展和临床资料的关系。方法 采用甲基化特异PCR技术（MSP法）研究58例大肠癌标本p16基因甲基化改变,分析临床病理资料。结果 25例标本（43．1％）呈p16 CpG区甲基化阳性;Dukes C、D期病人p16 CpG区甲基化发生率（75％）明显高于Dukes A、B期病人（13．3％）。结论 p16启动子区甲基化导致p16抑癌基因失活参与了大肠癌的发生和发展;p16甲基化可以作为估计大肠癌病人预后的一个指标。     

神经母细胞瘤p16基因甲基化研究

目的　明确在神经母细胞瘤中p16基因是否发生甲基化及其频率,阐明p16基因在神经母细胞瘤中的作用机制。方法　应用PCR技术结合限制性内切酶FnuDⅡ、SacⅡ、HpaⅡ为工具,对14例神经母细胞瘤患者的14个原发灶及其中5例肿瘤周围正常组织p16基因第1外显子CpG岛进行了甲基化修饰的研究。结果　5例正常组织的p16基因第1外显子CpG岛未发生甲基化,而4例原发灶在Ⅱ(1例)、Ⅲ(2例)、Ⅳ(1例)期有甲基化发生。结论　神经母细胞瘤瘤组织DNA中不存在p16基因的纯合性缺失,p16基因甲基化可能为其失活的一种形式,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期均有发生,可能是肿瘤发生的早期事件。同一患者的原发灶和转移灶,可有不同的甲基化模式,反映了肿瘤的异质性。     

无机砷对人支气管上皮细胞p16基因甲基化及表达的影响

目的 观察亚砷酸钠（NaAsO2)和胂酸肽（Na3AsO4)对人支气管上皮BEP2D细胞p16基因甲基化及表达的影响。方法 采用甲基化特异性PCR（MSP）及RT－PCR等技术观察分析BEP2D细胞p16基因甲基化和表达水平。结果 （1）NaAsO2(0.016-2μmol/L）和高浓度组Na3aSo4(80和160μmol/L）具有促进BEP2D细胞p16基因二核苷酸CpG岛甲基化作用;而低浓度组Na3AsO4(20和40μmol/L）不能使BEP2D细胞p16基因CpG岛发生甲基化。（2）无机砷可使BEP2D细胞p16基因表达下降,且NaAsO2较Na3AsO4更为明显。结论 无机砷可引起BEP2D细胞p16基因CpG岛甲基化程度增高和表达水平下降,提示p16基因高甲基化是无机砷致癌的可能途径之一。     

p16基因CpG位点甲基化在维吾尔族宫颈鳞癌及HPV16感染中的意义

目的:探讨p16 基因启动子区CpG 位点甲基化及HPV16 感染与新疆维吾尔族宫颈鳞癌的关系及其意义。方法:采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱方法(MALDI-TOF MS) 对20 例维吾尔族宫颈鳞癌及20 例对照组维吾尔族宫颈组织中的p16 基因启动子CpG 位点甲基化进行定量检测;采用聚合酶链反应(PCR) 的方法检测两组HPV16 的感染状况。结果:宫颈鳞癌及对照组中p16 基因启动子区16 个CpG 位点中CpG1-2, CpG6 为甲基化差异位点, 宫颈鳞癌组中CpG1-2, CpG6 位点甲基化水平明显高于对照组;宫颈鳞癌组的HPV16 感染率明显高于对照组, 差异有统计学意义(P<0.05);所检测的维吾尔族宫颈鳞癌组织中p16 基因启动子区CpG 位点甲基化与HPV16 感染无明显相关。结论:p16 基因启动子区CpG1-2, CpG6 位点高甲基化及HPV16 感染均与维吾尔族宫颈鳞癌的发生有关系, 但为两个独立事件。     

Relationship between alterations of p16INK4a and p14ARF genes of CDKN2A locus and gastric carcinogenesis

Objective To investigate the relationship between alterations of p16INK4a and p14ARF genes and gastric carcinogenesis. Methods The tumors and neighboring gastric tissues from 48 patients with gastric cancer were studied. The homozygous deletion, mutation, methylation of the CpG islands, and mRNA expression of p16INK4a and p14ARF genes were assessed by PCR, PCR-SSCP, PCR based methylation assay, and RT-PCR. Results ① The homozygous deletion rate of p16INK4a and p14ARF was 35.4% （17/48）, and no homozygous deletion was examined in any gastric tissue neighboring the tumor. ② There was no point mutation of p16INK4a and p14ARF in 31 gastric cancers without homozygous deletion or in the matched gastric tissues adjacent to the tumor. ③ Methylation of the CpG islands of p16INK4a and p14ARF was detected in 47.9% (23/48) of gastric cancers, while methylation was observed only in 2 of 48 gastric tissues neighboring the cancer with a significant difference (P&lt;0.01). ④ The loss rate of p16INK4a mRNA was 47.9% (23/48) in gastric cancer, and the patients of the combined methylation of exons 1α and 2 had a higher loss rate (100%, 6/6) of p16INK4a mRNA than those of the methylation of the other exons (11.8%, 2/17, P&lt;0.01); the loss rate of p14ARF mRNA was 45.8%(22/48) in gastric cancer, and patients with the combined methylation of exons 1β and 2 had a higher loss rate (100%, 3/3) of p14ARF mRNA than those of the methylation of the other exons (15%, 3/20, P&lt;0.05). ⑤ The combined loss of p16INK4a and p14ARF mRNAs was examined in 1 (5.6%) of 18 patients of well and moderately-differentiated carcinomas, and 11 (36.7%) of 30 patients of poorly and not-differentiated carcinomas with a significant difference (P&lt;0.05). Conclusion p16INK4a and p14ARF genes are frequently inactivated by homozygous deletion and methylation of the 5’CpG islands in gastric cancer, which may play an important role in the carcinogenesis of gastric cancer.     

人原发性肝癌中p16基因表达及CpG岛甲基化状态的研究

目的　进一步探讨人原发性肝癌中 p16基因 m RNA转录水平变化与其基因启动子区 Cp G岛甲基化的关系 ,及其在肝癌发生中的意义。方法　采用狭缝印迹杂交检测 2 0例人原发性肝癌及相应的癌旁、远癌组织及 2例正常人肝组织中 p16基因 m RNA表达水平 ,以甲基化特异性 PCR分析各组织中 p16基因启动子区 Cp G岛的甲基化状况 ,并进行统计分析。结果　 2 0例人原发性肝癌中 14例 (70 % ) p16 m RNA水平比远癌组织显著降低 ;13例 (6 5 % )显示 p16基因启动子区 Cp G岛甲基化 ,其中 84 .6 % (11例 )伴 p16 m RNA转录水平降低。结论　人原发性肝癌中存在高频率的 p16基因表达失活 ,其主要机制可能是启动子区 Cp G岛甲基化抑制了基因的转录 ,在人原发性肝癌的发生发展中有重要作用。其临床诊断和治疗意义有待进一步深入研究。     

γ射线诱发小鼠白血病模型中p16基因的改变

目的：研究γ射线诱发小鼠白血病模型中p16基因的失活机制。方法：应用聚合酶链反应(PcR)扩增39例γ射线诱发的白血病和对照小鼠胸腺组织中p16基因第1、第2外显子，检测等位基因纯合性缺失；用限制性内切酶-PCR法检测p16基因的甲基化发生情况；并应用PCR-单链构象多态性分析银染方法检测p16基因碱基突变的发生。结果：在白血病模型中，外显子2的缺失率为33．3％，甲基化的发生率为23．1％。结论：γ射线诱发的小鼠白血病模型发生、发展过程中伴有p16基因的改变，其失活以纯合性缺失和甲基化为主。     

喉鳞癌蛋白酪氨酸磷酸酶基因突变及甲基化研究

目的研究喉鳞状细胞癌(简称鳞癌)蛋白酪氨酸磷酸酶(PTEN)基因突变和启动子甲基化状况。方法应用聚合酶链反应-单链构像多态性方法(PCR-SSCP)分析银染系统,检测喉鳞状细胞癌新鲜或冰冻组织中PTEN基因第5、第8外显子的突变,采用甲基化敏感聚合酶链反应方法(MSP)分析喉癌及正常喉组织PTEN基因启动子过甲基化。结果PTEN基因突变均发生在喉鳞癌中,占17.5%(7/40),其中第5外显子有6例发生突变,突变率15.0%(6/40),这6例中有低分化3例,中分化3例,无高分化;淋巴结转移占83.3%(5/6)。第8外显子仅有1例发生突变,突变率为2.5%(1/40),该病例虽无淋巴结转移,但病理为低分化。40例喉鳞癌组织中,有40.0%(16/40)例PTEN基因启动子区甲基化,9例喉正常组织中未发现甲基化,喉癌中有2例既有第5外显子突变发生,又有启动子甲基化,占5.0%;有1例既有第8外显子突变,又有启动子甲基化,占2.5%。结论PTEN基因启动子甲基化及基因突变是其在喉鳞癌中失活的原因,并且该基因失活可能与喉鳞癌演进有关。     

白血病细胞雄激素受体基因启动子甲基化状态的研究

目的 检测白血病细胞雄激素受体基因启动子区CpG岛甲基化状态情况,初步探讨雄激素受体基因启动子区甲基化与白血病发病机制的可能联系.方法 应用甲基化特异性PCR技术(methylation specific PCR, MSP)检测3种白血病细胞株及15例患者骨髓标本雄激素受体基因甲基化状态.结果 白血病细胞株均出现甲基化和非甲基化带,呈部分甲基化状态,而作为对照的正常人白细胞均只出现非甲基化带.15例白血病患者全部检出甲基化状态. 结论 白血病细胞的雄激素受体基因启动子区存在高甲基化现象,可能为白血病的致病机制分析提供了一个新的方向,提示AR基因启动子CPG岛的甲基化有可能成为白血病的新的参考标记物.     

p73基因在成人急性淋巴细胞白血病中表达的研究

目的:研究p73基因在急性淋巴细胞性白血病(ALL)发病机制中的作用及临床意义。方法:收集32例ALL患者及30例正常对照组骨髓样本,DNA和RNA抽提后用RT-PCR检测p73基因的表达、甲基化特异性PCR(MSP)检测p73基因第一外显子甲基化状态,并结合临床资料进行分析。结果:11例p73基因阴性表达,阴性表达率为34.38%,其中9例第一外显子区域均发生甲基化(81.82%);21例p73基因阳性表达,32例ALL患者中,仅1例发生甲基化(4.76%);正常对照组30例,均为p73基因阳性表达,阳性表达率为100%。p73基因的阴性表达与ALL患者的高年龄(≥60岁)、高白细胞数(≥30×109/L)及对治疗时间延长(4周取得完全缓解)有关。结论:p73基因异常表达与成人ALL的发病机制有关,具有一定的诊断及判断预后的价值;其甲基化可能是p73基因在ALL中表达沉默的主要机制。     

急性白血病死亡相关蛋白激酶基因启动子的甲基化

目的 研究死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因启动子甲基化和基因表达在初治急性白血病患者中的临床意义.方法 采用MSP方法和RT-PCR方法分别检测60例急性髓系白血病患者、55例急性淋巴细胞白血病患者和17例正常人DAPK基因的甲基化状态及其mRNA的表达,统计学分析各组之间的表达差异.结果 急性淋巴细胞白血病组的DAPK甲基化阳性率(29.1％)高于急性髓细胞白血病组(5％)和正常组(0％)(P＜0.0l25),但甲基化与急性淋巴细胞白血病组患者临床特征无关(P＞0.05).DAPK基因mRNA的表达水平以正常组最高,急性髓细胞白血病组次之,急性淋巴细胞白血病组最低(P=0.000).急性淋巴细胞白血病组患者DAPK mRNA表达与其启动子甲基化呈显著负相关(P＜0.05).结论 DAPK基因启动子在初治急性淋巴细胞白血病患者中甲基化率高于初治急性髓细胞白血病患者和正常人,但与患者临床特征无关.急性淋巴细胞白血病患者DAPK基因表达水平低或不表达可能与其甲基化有关.     

原发性肝细胞性肝癌中p16基因的失活与P16蛋白表达的研究

为探讨ｐ１６基因与原发性肝细胞性肝癌（ＨＣＣ）的关系,作者分别采用多重ＰＣＲ、ＳＳＣＰ以及以ＰＣＲ为基础的甲基化分析法,对２５例原发性ＨＣＣ标本及其相应的非肿瘤肝组织标本中ｐ１６基因的缺失,点突变及甲基化情况进行了检测。另用免疫组化ＳＬＡＢ法对３５例（包括前述已作基因检测的２５例）原发性ＨＣＣ肿瘤标本及其相应的非肿瘤组织标本中Ｐ１６蛋白的表达情况进行了检测。结果：２５例原发性ＨＣＣ肿瘤标本中,３例