NF-κB参与脂多糖致永生化小鼠脑血管内皮细胞通透性增高的调控

目的:探讨脂多糖(LPS)对永生化小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3通透性的影响及可能的机制。方法:实验分3组:bEnd.3细胞组、bEnd.3/vector细胞组和bEnd.3/muIκBα细胞组,后2组中分别转染空载pcDNA3.1hygro质粒和IκBα显性负性突变体DNMu-IκBα质粒。利用报告基因法、跨内皮细胞电阻抗(TEER)法、直接荧光染色法和免疫印迹(Westernblotting)法分别检测LPS对细胞的NF-κB活性、细胞通透性、骨架蛋白F-actin分布、紧密连接蛋白(ZO-1和claudin-5)表达以及肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化水平的影响。结果:bEnd.3组和bEnd.3/vector组细胞中,LPS作用0.5h可引起NF-κB活化(P<0.05);3h时细胞TEER开始下降(P<0.05),并伴随细胞F-actin重构,ZO-1表达下调;12h时,LPS对细胞的TEER、F-actin、ZO-1和claudin-5的破坏程度均达到最高。LPS对bEnd.3组和bEnd.3/vector组细胞早期损害伴有MLC磷酸化增加。而bEnd.3/muIκBα组细胞的NF-κB活性被明显抑制;相应时点,LPS对细胞的TEER、F-actin、ZO-1和claudin-5的损害作用也被减轻。同时LPS引起细胞MLC磷酸化增加的作用被明显抑制。结论:LPS通过破坏紧密连接增加脑微血管内皮细胞的通透性,该过程受NF-κB调控。     

NF-κB在动脉粥样硬化疾病中的研究进展

核因子-κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)是炎症反应中重要的转录因子,参与了炎症因子的表达。动脉粥样硬化一般在大动脉内发生,其主要特征是内膜发生了炎症反应,并涉及了血浆分子之间的相互作用。动脉粥样硬化斑块不稳定,常伴有炎症浸润。因此,本文针对NF-κB在动脉粥样硬化疾病中的现有可能机制作一综述。     

CCK-8抑制LPS诱导大鼠肺间质巨噬细胞TNF-α转录及NF-κB活性

目的:观察硫酸化八肽胆囊收缩素(CCK-8)对体外脂多糖(LPS)诱导大鼠肺间质巨噬细胞(PIMs)TNF-α基因表达的影响,探讨核因子κB(NF-κB)是否参与这一过程,以揭示CCK-8抗炎作用的信号转导机制。方法:分离大鼠肺PIMs,经LPS、CCK-8、CCK受体拮抗剂丙谷胺及溶剂单独或联合应用孵育3h,用RT-PCR技术检测细胞TNF-αmRNA的表达,孵育1h,用电泳迁移率改变分析方法检测NF-κB活性,孵育30min,用Westernblot技术检测胞浆IκBα蛋白表达情况。结果:CCK-8(10^-8-10^-6mol·L^-1)明显降低了LPS诱导的TNF-αmRNA表达及NF-κB活性,增加了胞浆中IκBα蛋白水平,呈剂量依赖性,并可被丙谷胺所拮抗。结论:对LPS激活的肺PIMs,CCK-8通过抑制NF-κB活性而抑制其TNF-αmRNA表达,该作用由CCK受体介导,并与CCK-8减少IκBα蛋白降解有关,此为CCK-8抗炎作用的机制之一。     

辣椒素对脂多糖诱导血管内皮细胞活化的影响及机制

目的:探讨辣椒素对脂多糖（LPS）刺激后小鼠主动脉内皮细胞活化的影响,并探讨其可能机制。方法:（1）体外分离培养小鼠主动脉内皮细胞,免疫荧光鉴定内皮细胞特异性标志。（2）以100μg/LLPS作用于血管内皮细胞后,以不同浓度的辣椒素（50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L）进行干预,分别于12、24和48h收集主动脉血管内皮细胞及细胞上清液。采用ELISA法检测各组细胞上清液中的可溶性细胞间黏附分子1（sICAM-1）、可溶性血管细胞黏附分子1（sVCAM-1）和可溶性P-选择素(sP-selectin)水平,Westernblotting法检测各组主动脉血管内皮细胞核内NF-κBp65水平和胞浆p-IκBα、IκBα水平。结果:与对照组相比,LPS组细胞上清液中sP-selectin、sICAM-1和sVCAM-1含量显著升高（P<0.05）,LPS能够时间依赖性上调sICAM-1和sVCAM-1的含量。与同时点的LPS组相比,辣椒素能够剂量依赖性下调sP-selectin、sICAM-1和sVCAM-1水平。与对照组相比,LPS作用24h后,细胞核内NF-κBp65和胞浆p-IκBα蛋白水平显著升高（P<0.05）,胞浆IκBα蛋白水平显著降低（P<0.05）。与同时点LPS组相比,辣椒素能够剂量依赖性下调细胞核内NF-κBp65和胞浆p-IκBα蛋白的水平（P<0.05）,剂量依赖性上调胞浆IκBα蛋白水平（P<0.05）。结论:辣椒素能够显著抑制LPS作用后血管内皮细胞活化水平,该效应可能是通过下调IκBα降解和NF-κBp65胞核内转位而实现的。     

Fas、NF-κB及Caspases在TNFα介导的微血管内皮细胞凋亡中的作用

目的:研究肿瘤坏死因子α(TNFα)引起微血管内皮细胞凋亡的特点及Fas(即CD95抗原 )、NF-κB和caspases在此种凋亡中的作用。方法:用TUNEL、流式细胞仪等方法测定TNFα引起体外培养的大鼠肺微血管内皮细胞(下称内皮细胞 )凋亡。用Northernblot、Fas抗体测定TNFα对内皮细胞Fas表达的影响及Fas在内皮细胞凋亡中的作用。用Westernblot、免疫组化测定TNFα作用后凋亡蛋白酶caspase-8、caspase-3的活化与表达。结果:细胞生长曲线显示TNFα抑制内皮细胞增殖,并呈剂量依赖关系。TUNEL法测凋亡百分率为 14.0 %± 3.1%,流式细胞仪测凋亡百分率为 13.1%。NF-κB抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸盐(APDC)与TNFα共同作用后,细胞凋亡增加。TNFα作用后内皮细胞的Fas表达增高,用Fas抗体与TNFα共同作用,细胞凋亡增加。TNFα作用下caspase-8活化显著增加,caspase-3表达增多。caspase-3抑制剂与TNFα共同作用,细胞凋亡减少。结论:大剂量TNFα(5× 10⁶U/L)能够引起一定量的体外培养的内皮细胞发生凋亡。NF-κB有抗内皮细胞凋亡的作用。TNFα上调内皮细胞Fas表达,后者参与内皮细胞凋亡。TNFα所引起的内皮细胞凋亡与caspase-8及caspase-3的作用有关.     

顺式调控元件NF-κB在尼古丁诱导ICAM-1表达中的作用

目的: 研究5' 上游序列在尼古丁诱导细胞间粘附分子-1(ICAM-1)基因转录调控中的作用。 方法: 首先采用分子克隆技术构建实验所需的DNA片段,然后采用真核细胞转染技术将重组DNA片段与内参照质粒一起转染体外培养的内皮细胞并检测尼古丁刺激的转染细胞荧光素酶的相对活性。 结果: 成功构建了6种含有不同长度ICAM-1基因启动子序列以及启动子中NF-κB 和 Sp-1 位点突变序列的荧光素酶报告基因质粒。与对照组相比尼古丁可促进含有启动子序列-579 bp(pGL3E-579/+36)(P＜0.05), -230 bp (pGL3E-230/+36) (P＜0.05) 以及启动子 Sp-1 位点突变体(pGL3E-Sp-1-MU) (P＜0.05)的荧光素酶基因表达,而下游NF-κB位点的删切重组体(pGL3E-134/+36)和含有NF-κB位点突变体(pGL3E- NF-κB -MU)的重组荧光素酶报告基因质粒在尼古丁诱导下与对照组相比荧光素酶表达量无明显差异。结论: ICAM-1基因启动子顺式作用元件下游NF-κB位点在尼古丁诱导ICAM-1基因表达机制中可能起重要作用。     

去甲肾上腺素对心肌细胞NF-κB活性的影响

目的:探讨去甲肾上腺素(NE)对心肌细胞核因子-κB(NF-κB)活性的影响及机制。方法:采用乳鼠心肌细胞培养模型,分别加入NE和哌唑嗪、普萘洛尔及维生素E等刺激,观察心肌细胞内活性氧水平和NF-κB核结合活性的改变。结果:NE刺激后,心肌细胞活性氧生成明显增加、NF-κB活性增强,维生素E、哌唑嗪和普萘洛尔可不同程度减少心肌细胞活性氧含量、降低NF-κB活性。结论:NE对心肌细胞的作用部分通过激活NF-κB实现,这与NE通过肾上腺素能受体介导活性氧过量产生有关。     

硫化氢通过调控NF-κB通路抑制阿霉素引起的心肌细胞炎症与细胞毒性

 目的：探讨硫化氢（H2S）是否通过调控核因子κB(NF-κB)通路抑制阿霉素（DOX）引起的心肌细胞炎症反应与细胞毒性。方法：应用Western blotting法测定NF-κB p65表达;酶联免疫吸附试验（ELISA）测定白细胞介素（IL）-1β、IL-6及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的分泌水平;细胞计数盒（CCK-8）检测细胞存活率,Hoechst 33258核染色法检测凋亡细胞的形态学及数量的变化。结果：应用5 μmol/L DOX处理H9c2心肌细胞明显上调磷酸化NF-κB p65（p-p65）表达水平,并引起炎症反应和细胞毒性,表现为IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平升高、凋亡细胞数量增多及细胞存活率降低。400 μmol/L NaHS（H2S供体）预处理30 min能显著抑制DOX对心肌细胞p-p65表达的上调作用,并减轻DOX引起的炎症反应和细胞损伤,使IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平下降、凋亡细胞数量降低及细胞存活率升高。与NaHS的作用相似,NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC,100 μmol/L）预处理也能阻断DOX引起的心肌炎症反应和细胞毒性。IL-1受体拮抗剂（IL-1Ra, 20 μg/L）与DOX共处理能拮抗DOX对心肌细胞NF-κB p65的激活作用及细胞毒性作用。结论：在DOX引起的心肌细胞炎症中,NF-κB通路与IL-1β之间存在正的相互作用;H2S可通过抑制NF-κB通路保护心肌细胞对抗DOX引起的炎症反应与细胞毒性。     

RXR/VDR激动剂对糖尿病ApoE-/-小鼠胸主动脉硬化及NF-κB表达的调控

 目的：探讨视黄醇X受体（RXR）激动剂贝沙罗汀（Bex）和维生素D受体（VDR）激动剂骨化三醇（Cal）对链脲佐菌素（STZ）诱导的载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠胸主动脉硬化及NF-κB表达的影响。方法: 动物分6组：C57组、ApoE-/-组、STZ-ApoE-/-组、STZ-ApoE-/-+Bex（10 mg·kg-1·d-1）组、STZ-ApoE-/-+Cal（10 μg/kg）组和STZ-ApoE-/-+Bex+Cal组。STZ腹腔注射复制糖尿病动物模型,Western blotting法及免疫组化法测定小鼠胸主动脉中NF-κB的表达,HE染色观察小鼠胸主动脉斑块的面积。结果：与C57组相比,ApoE-/-组的血糖水平无明显差别,血清总胆固醇（TC）及低密度脂蛋白（LDL）水平升高（P<005）;STZ-ApoE-/-组的血糖及血清TC和LDL水平较ApoE-/-组明显增高（P<005）,Bex和Cal对小鼠的血糖及血清TC、LDL无影响。与C57组相比,ApoE-/-和STZ-ApoE-/-小鼠胸主动脉的NF-κB蛋白表达显著增加;与STZ-ApoE-/-组相比,Bex和Cal均显著降低NF-κB的水平（P<0.05）,联合用药降低更明显（P<001）。与STZ-ApoE-/-组相比,Bex和Cal可缩小STZ-ApoE-/-小鼠的胸主动脉斑块面积（均P<005）;与Bex组相比,联合组斑块面积缩小的程度有显著差异（P<005）。结论：Bex和Cal可降低STZ-ApoE-/-小鼠胸主动脉粥样硬化斑块面积及NF-κB的表达,联合有协同作用,由此推论Bex和Cal的抗动脉粥样硬化机制可能与其对NF-κB的调节有关。     

NF-κB在脓毒症血浆诱导的内皮细胞损伤和凋亡中的作用

 目的：探讨核因子κB（NF-κB）在脓毒症血浆诱导的内皮细胞损伤和凋亡中的作用。方法：应用脓毒症患者血浆刺激人脐静脉内皮细胞（HUVECs）,健康对照者血浆作为阴性对照。用酶联免疫吸附法（ELISA）和免疫荧光法检测NF-κB的核移位,流式细胞术检测内皮细胞凋亡。结果：脓毒症患者血中肿瘤坏死因子α（TNF-α）和von Willebrand因子(vWF)明显高于正常人。在一定范围和时间内,脓毒症血浆刺激HUVECs释放vWF呈时间、剂量依赖关系,应用NF-κB拮抗剂二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）阻断后,vWF降低。脓毒症血浆刺激HUVECs时,NF-κB活化,从胞浆移位入胞核。脓毒症血浆引起内皮细胞凋亡增加,加入NF-κB拮抗剂PDTC后HUVECs凋亡明显增加。结论: NF-κB参与了脓毒症引起的内皮细胞损伤,抑制了内皮细胞凋亡。     

硫化氢在雌激素促血管内皮细胞增殖中的作用研究

目的研究硫化氢（H2S）在雌激素促进血管内皮细胞增殖中的作用。方法利用培养的脐静脉血管内皮细胞,以雌激素处理后,Western blot检测H2S产生关键酶CSE（胱硫醚-γ-裂解酶）的蛋白表达情况;亚甲基蓝法测定血管内皮细胞释放H2S含量;MTT法检测血管内皮细胞增殖情况。结果不同浓度（1nmo1／L～1μmol／L）的雌激素处理血管内皮细胞48h后．均可促进CSE蛋白表达和内皮H2S释放。不同浓度的雌激素均能明显促进血管内皮细胞增殖。以CSE特异性抑制剂PPG抑制H2S产生后,雌激素促进血管内皮增殖的能力受到显著抑制。结论雌激素可通过促进CSE蛋白表达促进血管内皮细胞释放H2S,进而促进血管内皮细胞增殖。     

SUMO化修饰对高糖诱导的大鼠肾系膜细胞IKKγ/NF-κB信号的影响

 目的：探讨小泛素相关修饰物（SUMO）化修饰对高糖诱导的肾系膜细胞IκB激酶γ(IKKγ)/NF-κB信号的影响。方法：体外培养大鼠肾小球系膜细胞,设正常对照组、高糖干预组和渗透压对照组：用免疫印迹和RT-PCR法检测各组细胞SUMO1、SUMO2/3、IKKγ和NF-κB p65的表达;用免疫共沉淀检测SUMO与IKKγ蛋白间的相互作用。结果：高糖呈浓度和时间依赖性上调系膜细胞SUMO和NF-κB p65表达（均P<0.01）。各组细胞IKKγ 的蛋白与mRNA表达差异无统计学意义（均P<0.05）;高糖组SUMO与IKKγ蛋白间的相互作用减弱（均P<0.01）。结论:高糖影响IKKγ 的SUMO化修饰,可能参与了高糖诱导的肾系膜细胞NF-κB信号激活的调控。     

Vascular O-GlcNAcylation augments reactivity to constrictor stimuli by prolonging phosphorylated levels of the myosin light chain

O-GlcNAcylation is a modification that alters the function of numerous proteins. Wehypothesized that augmented O-GlcNAcylation levels enhance myosin light chain kinase(MLCK) and reduce myosin light chain phosphatase (MLCP) activity, leading toincreased vascular contractile responsiveness. The vascular responses were measuredby isometric force displacement. Thoracic aorta and vascular smooth muscle cells(VSMCs) from rats were incubated with vehicle or with PugNAc, which increasesO-GlcNAcylation. In addition, we determined whether proteins that play an importantrole in the regulation of MLCK and MLCP activity are directly affected byO-GlcNAcylation. PugNAc enhanced phenylephrine (PE) responses in rat aortas (maximaleffect, 14.2±2 vs 7.9±1 mN for vehicle, n=7). Treatment with an MLCPinhibitor (calyculin A) augmented vascular responses to PE (13.4±2 mN) and abolishedthe differences in PE-response between the groups. The effect of PugNAc was notobserved when vessels were preincubated with ML-9, an MLCK inhibitor (7.3±2vs 7.5±2 mN for vehicle, n=5). Furthermore, our data showed thatdifferences in the PE-induced contractile response between the groups were abolishedby the activator of AMP-activated protein kinase (AICAR; 6.1±2 vs7.4±2 mN for vehicle, n=5). PugNAc increased phosphorylation of myosin phosphatasetarget subunit 1 (MYPT-1) and protein kinase C-potentiated inhibitor protein of 17kDa (CPI-17), which are involved in RhoA/Rho-kinase-mediated inhibition of myosinphosphatase activity. PugNAc incubation produced a time-dependent increase invascular phosphorylation of myosin light chain and decreased phosphorylation levelsof AMP-activated protein kinase, which decreased the affinity of MLCK forCa²⁺/calmodulin. Our data suggest that proteins that play an importantrole in the regulation of MLCK and MLCP activity are directly affected byO-GlcNAcylation, favoring vascular contraction.     

Rho GTP酶介导剪切力引起的血管内皮细胞通透性变化

血管内皮细胞通透性的变化与人类的许多疾病有关,如动脉粥样硬化、高血压、中风、炎症反应、肿瘤、糖尿病引起的视网膜病变和黄斑水肿等。剪切力是作用于血管内皮细胞的主要力学因素并对血管内皮细胞通透性起重要作用。RhoGTP酶家族是细胞信号转导通路中的一类重要蛋白,参与血管内皮细胞通透性的调控。研究表明,RhoGTP酶在介导剪切力引起血管内皮细胞通透性变化的过程中起重要的信号传导作用。就剪切力对血管内皮细胞通透性的影响以及RhoGTP酶在其分子机制上的作用进行综述。     

Adrenomedullin-induced relaxation of rat brain pericytes is related to the reduced phosphorylation of myosin light chain through the cAMP/PKA signaling pathway

Brain pericytes are known to embrace the abluminal endothelial surfaces of cerebral microvessels. The rich expression of contractile proteins in these cells suggests pericytal regulation of cerebral blood flow. Here, we investigated the molecular mechanisms by which an endothelium-derived relaxing factor, adrenomedullin, was able to induce the relaxation of rat primary cultured brain pericytes. Adrenomedullin increased the relative proportion of pericytes that were relaxed, as shown by an increased cell surface area. A smaller fragment of adrenomedullin (adrenomedullin(22-52)) blocked the adrenomedullin-induced relaxation. Adrenomedullin increased intracellular cAMP concentrations and decreased the phosphorylation of myosin light chain (MLC). H89 (a PKA inhibitor) inhibited the adrenomedullin-induced increase in the number of relaxed pericytes, and returned the level of phosphorylation of MLC to the control level. The results of the present study suggest that adrenomedullin-induced relaxation of brain pericytes is related to the reduced phosphorylation of MLC through cAMP/PKA.     

Syk基因对乳腺癌血管内皮生长因子-C表达的调控作用

目的 研究Syk基因对乳腺癌血管内皮生长因子(VEGF)-C表达的调控机制.方法 采用免疫组织化学(EnVision法)检测乳腺癌组织中Syk、NFκB与VEGF-C的蛋白表达情况,分析三者的相关性及与淋巴转移的关系.转染pcDNA3.1(-)-Syk至乳腺癌MDA-MB-231细胞,检测对VEGF-C和NFκB表达的影响.结果 在淋巴转移组中,Syk蛋白阳性率低于非淋巴转移组,VEGF-C与NFκB阳性率在淋巴转移组高于非淋巴转移组.Syk蛋白表达与NFκB(r=-0.448,P=0.002)、VEGF-C(r=-0.620,P=0.000)蛋白表达呈负相关,VEGF-C与NFκB呈正相关(r =0.310,P=0.036).转染pcDNA3.1(-)-Syk重组质粒的乳腺癌细胞中VEGF-C的mRNA及蛋白表达水平均低于空白对照组,细胞核NFκB蛋白表达低于空白对照组(均P＜0.05).结论 Syk基因与乳腺癌转移相关,可能是通过抑制NFκB的活性而下调VEGF-C的表达,从而抑制乳腺癌的淋巴转移.     

Effects of vascular endothelial growth factor released from cultured dermal substitute on proliferation of vascular endothelial cells in vitro

Allogeneic cultured dermal substitute (CDS) was prepared by culturing fibroblasts on a two-layered spongy matrix of hyaluronic acid and atelocollagen. CDS can be cryopreserved and transported to other hospitals in a frozen state. The present study was designed to analyze the amounts of vascular endothelial growth factor (VEGF) released from fibroblasts in fresh and cryopreserved CDS and to investigate the effects of this VEGF on proliferation of vascular endothelial cells in vitro. The culture medium used in preparing CDS (fresh CDS culture medium sample) was collected and stored at –30°C for the quantitative analysis of VEGF. After thawing cryopreserved CDS, it was recultured in a culture medium for 1 week. The culture medium used was collected and stored at –30°C for quantitative analysis of VEGF. The amounts of VEGF released from the fresh and cryopreserved CDS into the culture medium were about 610pg/ml and 640pg/ml, respectively. This finding suggests that the cryopreserved CDS retains its ability to release VEGF. Immunohistological analysis indicated that some of the VEGF adhered to the matrix. Human vascular endothelial cells were cultured in medium mixed with the fresh or cryopreserved CDS culture medium sample. Proliferation of vascular endothelial cells was enhanced by increasing the concentration of both CDS culture medium samples. When antihuman VEGF antibody was added to the culture medium, the proliferative activity of vascular endothelial cells was reduced. These findings confirm that VEGF released from CDS promotes proliferation of vascular endothelial cells.     

RNAi沉默NF-κB p65对小鼠巨噬细胞细胞因子表达的影响

目的: 探讨RNA干扰(RNAi)技术在抑制NF-κB p65表达、调控LPS活化后巨噬细胞细胞因子表达中的应用。方法: 利用阳离子脂质体将NF-κB p65小干扰RNA(siRNA)瞬时转染入Ana-1细胞,RT-PCR及Western blotting法检测其沉默效率,ELISA法检测LPS(1 mg/L)刺激下0 h、4 h、12 h和24 h Ana-1细胞培养上清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10浓度。结果: NF-κB p65 siRNA转染24 h后,NF-κB p65在基因水平及蛋白水平表达均被明显抑制(P<0.05)。RNA干扰组Ana-1细胞培养上清中细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达在相应时点内均较对照组明显降低(P<0.05),IL-10表达显著升高,在12 h和24 h差异显著(P<0.05)。结论: 体外实验初步证实RNAi技术能有效沉默小鼠巨噬细胞NF-κB p65 基因的表达,下调其下游调控的促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及上调抑炎症细胞因子IL-10的表达,从而抑制过度的炎症反应。