应用酵母双杂交方法筛选LRP16相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交技术筛选人乳腺癌细胞MCF-7中可与LRP16相互作用的蛋白。方法:将诱饵质粒pGBKT7-LRP16、MCF-7双链cDNA文库片段及线性化质粒pGADT7-Rec共转化AH109酵母菌,营养缺陷型培养基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)筛选阳性菌落。提取阳性克隆质粒进行PCR,将PCR产物测序,并将酵母质粒转化感受态大肠杆菌Top10获得与诱饵质粒有相互作用的单个文库质粒,测序后回复验证其在酵母中的相互作用。结果:获得8个与LRP16相互作用的候选蛋白,选取4个在酵母中进行回复验证,其中有3个可生长出阳性克隆。结论:应用酵母双杂交技术筛选出一族功能基本明确的可与LRP16相互作用的候选蛋白,为研究LRP16的病理生理功能和分子机制奠定了基础。     

用同源重组法构建小鼠卵母细胞cDNA酵母双杂交文库的探索

目的探索卵巢成熟及明确早胚发育过程中,构建小鼠卵母细胞cDNA文库筛选所涉及的相互作用蛋白。方法利用SMART技术,构建酵母双杂交筛选卵母细胞中与输卵管蛋白相互作用的靶分子成分为目的,构建小鼠卵母细胞cDNA酵母双杂交文库。采用Stratagene RNA prepkit抽提500枚卵母细胞总RNA,应用线性化载体pGADT7-Rec在体构建小鼠卵母细胞cDNA酵母双杂交文库。结果文库的滴度为3.7×106,重组片段大小主要集中在0.6-0.9kb,重组率为60%。结论所构建的小鼠卵母细胞cDNA文库可用于酵母双杂交筛选。     

利用酵母双杂交系统筛选Pak4相互作用蛋白质

目的 利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选信号转导分子Pak4相互作用蛋白.方法 将Pak4激酶域序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒.质粒转化到酵母感受态AH109和Y187中验证蛋白表达.将人胎脑cDNA文库转化酵母Y187,与已转化诱饵质粒的AH109酵母进行交配实验.交配子在SD/-Leu/-Trp/-His和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal平板上筛选,阳性克隆质粒酶切鉴定.结果 成功构建了pGBKT7-Pak4 KD诱饵质粒,Western blot证实其在酵母菌AH109和Y187中表达,筛选了多个与Pak4相互作用的阳性转化子.结论 利用酵母双杂交系统筛选出Pak4相互作用蛋白质.     

利用双杂交系统筛选并鉴定与GPR30相互作用的蛋白

目的 筛选并鉴定与GPR30相互作用的蛋白,为GPR30蛋白亚细胞定位和功能研究提供线索.方法 应用酵母双杂交技术,构建诱饵表达载体Pgbk/GPR30,与人卵巢互补DNA(complementary DNA,cDNA)文库共转化酵母菌AH109,筛选阳性克隆并测序.利用哺乳动物双杂交系统验证GPR30与候选蛋白的相互作用.结果 从人卵巢cDNA文库中筛选出4个与GPR30结合的蛋白基因,分别是小G蛋白Rab8a、Rab40a、NM23-H2和TACC3.其中,小G蛋白Rab8a、Rab40a与GPR30的相互作用在哺乳动物双杂交系统中得到验证.结论 小G蛋白Rab8a和Rab40a可能参与了GPR30细胞内转运或与GPR30参与的信号转导有关.     

与人巨细胞病毒UL132编码蛋白相互作用蛋白的初步筛选和鉴定

目的：探讨应用酵母双杂交系统筛选出与人巨细胞病毒（HCMV）UL132编码蛋白相互作用的人胎脑cDNA文库组织蛋白,阐明其在先天性巨细胞病毒感染中可能的致病机制。方法：采用聚合酶链式反应扩增HCMV UL132片段,酶切、纯化扩增的目的片段及酵母诱饵表达载体pGBKT7,连接HCMV UL132片段到载体pGBKT7上,将连接后的重组体pGBKT7-UL132转化到酵母菌AH109中,再将人胎脑文库DNA也转化到酵母AH109中,筛选与HCMVUL132编码蛋白相互作用的人胎脑文库蛋白,并对阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果：成功构建诱饵表达载体pGBKT7-UL132,双酶切鉴定可见800及7500bp2条目的条带;转化文库质粒后计算转化效率为6.6×10³ cfu·μg^-1,显色反应显示有95个菌落呈蓝色,最终确认10个克隆与HCMV UL132编码蛋白相互作用,Blast结果显示7个克隆与CAML高度同源。结论：利用酵母双杂交系统成功筛选出与HCMVUL132编码蛋白相互作用的人胎脑cDNA文库蛋白CAML,推测该目的蛋白可能在HCMV感染所致神经系统损伤、病毒的入侵和增殖过程中发挥重要作用。     

曲古霉素A诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡反义cDNA文库的构建和效应基因的初步筛选

目的 构建曲古霉素A诱导人乳腺癌细胞凋亡反义cDNA文库,以筛选曲古霉素A抗肿瘤的效应基因.方法 收集经曲古霉素A处理不同时间点的人乳腺癌细胞MCF-7,提取poly(A)+RNA,将逆转录合成的cDNA反向插入载体PCEP 4中以构建反义cDNA文库.文库DNA随机转入人宫颈癌细胞HeLa中,以转染PCEP 4卒载体细胞为对照组,用200 nmol/L曲古霉素A和200μg/ml潮霉素同时筛选,至对照组细胞全部死亡,文库组仍有存活细胞时停止曲古霉素A筛选.存活克隆扩增后提取Hirt DNA并转化感受态细胞,获得的转化克降扩增后进行酶切鉴定并测序,得到多个EST片段,经生物信息学分析后选择感兴趣的EST片段进行初步功能验证.结果 构建的反义cDNA文库含有2 × 106重组子,重组效率>90%;经DNA测序和生物信息学分析提示第27号存活克隆是锌转运蛋白LIV1,该克隆在功能验证时表现出对曲古霉素A非常显著的抵抗效应.结论构建的反cDNA文库容量较大,质量较高;基因LIV1可能是曲古霉素A抗肿瘤的效应基因之一.     

原发型肝癌组织cDNA文库的构建及抗原基因的筛选

目的 构建人原发型肝癌组织cDNA文库,以SEREX方法从cDNA文库中筛选肝癌抗原基因.方法 采用确诊的原发型肝癌患者新鲜手术切除癌组织构建cDNA文库,测定原始文库滴度,进行蓝白筛选以确定文库的重组率.以肝癌患者的血清,采用血清学方法筛选所构建的cDNA文库,阳性克隆经PCR检测鉴定后进行序列分析.结果 成功构建了混合原发型肝癌cDNA文库经测定原始文库滴度为7.42X106pfu/mL,含3.96×106个重组子,重组率为93%,扩增文库滴度为3.92×109pfu/mL,cDNA插入片段大小在0.5～3.0 kb之间.文库经3轮血清学筛选共获得31个阳性克隆,分别代表了24个独立的cDNA插入片段(抗原基因).其中17个与已知基因高度同源,另外7个基因与GenBank中已知基因的部分同源,其中有3个是新基因.利用SMART技术构建了高质量的人原发型肝癌组织cDNA表达文库,有利于以cDNA文库为基础的进一步的实验研究.结论 应用SEREX技术初步筛选原发型肝癌组织cDNA文库,共得到17个原发型肝癌相关抗原基因,其中有3个是新基因,可能为原发型肝癌的免疫学研究提供新的研究分子.     

人巨细胞病毒UL135蛋白结合蛋白的酵母双杂交筛选

目的 利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与人巨细胞病毒(HCMV)UL135编码蛋白相互作用的蛋白.方法 将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-UL135转化到酵母菌AH109中,再将人胎脑文库DNA转化到含有pGBKT7-UL135的酵母细胞中,筛选与HCMV UL135编码蛋白相互作用的细胞蛋白,并对阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果 最终确认60个克隆与HCMV UL135编码蛋白相互作用,其中2个克隆与Thy-1高度同源.结论 成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMV UL135编码蛋白相互作用的蛋白,其中Thy-1在HCMV感染致病过程中可能起重要作用.     

Screening of FOXP3-interacted proteins by yeast two-hybrid technique

Objective： To screen the proteins interacting with the Treg specification factor forkhead box protein P3 （FOXP3） by yeast two-hybrid system, Methods： Human FOXP3 gene was amplified by nest RT-PCR from peripheral blood mononuclear cells （PBMC） and inserted into plasmid pGBKT7 to construct the bait vector, then the self-activation and toxicity of the bait vector in host yeast strain AH109 were observed. Thereafter, a human liver cDNA library was screened by the bait vector. The positive clones were selected out by nutrient-deficient culture and back-hybridizing. The sequences from the candidate positive clones were blasted and analyzed by bioinformatics methods. Results： The constructed bait vector encoding FOXP3 was found no self-activation and toxicity in yeast AH109. Three proteins which interacted with FOXP3, including tumor protein D52, splicing factor 3b subunit 1 and hypothetical protein, were identified. Conclusion： Three new candidate proteins interacting with FOXP3 are selected out by this yeast two-hybrid system and library, which may facilitate the further study of FOXP3 in Treg.     

HBV表面抗原大蛋白与人胰腺CDK5RAP3蛋白的亚细胞定位研究

目的 运用激光共聚焦显微技术对CDK5RAP3与LHBs进行亚细胞定位研究,为进一步研究HBV影响糖、脂类代谢的分子生物学机制提供一定的思路和方向.方法 应用酵母双杂交系统筛选人胰腺cDNA文库中的LHBs结合蛋白基因,构建真核表达质粒pDsRed1-N1-CDK5RAP3,应用激光共聚焦显微技术对CDK5RAP3与LHBs进行亚细胞定位研究.结果 成功构建真核表达质粒pDsRed1-N1-CDK5RAP3,转染了pDsRed1-N1-CDK5RAP3质粒的细胞,红色荧光信号较集中分布于细胞浆中,与经DAPI染色的细胞核无重叠.结论 证实LHBs基因和CDK5RAP3基因在体内可以表达蛋白,并提示LHBs蛋白和CDK5RAP3蛋白均主要定位在细胞浆内.     

顺序转化法进行酵母双杂交筛选相互作用蛋白质

目的：利用顺序转化法进行酵母双杂交从人胎脑cDNA文库中筛选PAK4新的相互作用蛋白。方法：将PAK4激酶域序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒。提取质粒并转化酵母菌AH109,验证蛋白表达。用顺序转化法将质粒和人胎脑cDNA文库转化酵母菌AH109,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/x-α-gal平板上筛选,对阳性克隆质粒进行酶切鉴定。结果：利用顺序转化酵母双杂交方法筛选出了多个与PAK4蛋白质相互作用的Ade＋/His＋/LacZ＋阳性转化子。结论：利用顺序转化酵母双杂交方法成功筛选了与PAK4相互作用的蛋白质。     

利用酵母双杂交系统筛选与FXR1P相互作用的蛋白

目的筛选FXR1P相互作用蛋白,探讨FXR1P生物学功能。方法应用酵母双杂交技术,构建诱饵表达载体pGBKT7/FXR1,转化酵母菌AH109,与转化了人胎脑cDNA文库的酵母菌Y187交配筛选阳性克隆并测序。结果重组表达载体pGBKT7/FXR1构建成功;从人胎脑cDNA文库中筛选出5个与FXR1P结合的蛋白基因,分别与5种已知的编码蛋白基因序列同源：胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸合成酶（CMAS）、铁蛋白重链多肽1（FTH1）、高尔基体自身抗原golgina亚类4（GOLGA4）、17-β羟类固醇脱氢酶1（HSD17B1）、绒毛膜生长催乳激素1（CSH1）。结论为进一步研究FXR1P的功能及脆性X综合征发病机制提供新的线索。     

促凋亡因子Smac/DIABLO与核受体NR4A1相互作用的筛选和鉴定

目的 利用酵母双杂交技术筛选线粒体促凋亡因子野生型Smac/DIABLO的相互作用蛋白.方法 ①设计促凋亡因子野生型Smac/DIABLO引物,利用PCR在成人肝cDNA文库中扩增野生型Smac/DIABLO基因片段,构建酵母真核表达载体pDBLeu-Smac/DIABLO.②pDBLeu-Smac/DIABLO诱饵质粒转化酵母MaV203,Western blot检测融合蛋白在酵母中的正确表达,自激活作用的检测并确定抑制His基础表达的3AT浓度.③对成人肝cDNA文库的筛选.选择能同时激活His、Ura、LacZ 3个报告基因的克隆为阳性,利用回转实验和GST-pull down对阳性克隆进行鉴定.结果 成功构建pDBLeu-Smac/DIABLO载体,转化酵母细胞MaV203,无细胞毒性,无自激活作用,3AT浓度为25 mmol/L.经回转实验和GST-pull down证实了线粒体促凋亡因子Smac/DIABLO与核受体NR4A1之间具有相互作用.结论 Smac/DIABLO可能通过与核受体NR4A1的相互作用来影响核受体NR4A1对细胞生存或者凋亡的调控.     

酵母双杂交系统筛选Mps1相互作用蛋白

目的：对前期筛出的与Mps1可能有相互作用的两种蛋白用酵母双杂交回转,验证与Mps1有相互作用的蛋白,为染色体分离机制研究提供线索,并为蛋门质相互作用网络提供资料。方法：应用酵母双杂交技术,将前期以pDBLeu—Mps1为诱饵质粒筛选成人肝脏cDNA文库,得到的Leu＋LacZ＋阳性克隆进一步回转酵母进行验证,即将文库质粒与诱饵质粒一对一重新转入酵母体内对相互作用进行验证。并对验证后的阳性克隆的外源片段进行测序及同源性分析。结果：用同源性分析,从人胚胎cDNA文库筛选到的与Mps1有相互作用的两个蛋白在酵母双杂交回转实验中仅有一个为阳性,另一个相互作用为阴性。结论：应用酵母双杂交系统从人胚胎cDNA文库中筛选并初步验证了与Mps1有相互作用的蛋白,为Mps1蛋白的功能研究奠定了基础．     

骨形态发生蛋白的可溶性表达、纯化及抗体制备

目的用RT-PCR技术优化表达条件获得表达量比较高的BMP-2ω蛋白,获得纯度较高的蛋白。方法用RT-PCR技术从SAOS-2细胞的总RNA中扩增出BMP-2基因片段BMP-2ω(606-846bp),并插入到原核表达载体pET-28a( )上;转化大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达研究,使其在大肠杆菌中能够可溶性表达,用镍离子螯和柱(Ni-NTA)纯化BMP-2ω蛋白,获得纯度较高的蛋白,用纯蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果ELISA结果显示效价可达到1∶6400;Western印迹结果表明该抗体可以与BMP-2蛋白特异结合。结论为BMP-2在骨肉瘤发生、发展中的作用的研究奠定了基础。