CD4~+CD25~+调节性T细胞移植对自身免疫性脑脊髓膜炎大鼠的保护作用

目的观察输注CD4~+CD25~+调节性T细胞对实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)模型大鼠后脑和脊髓组织的保护作用及相关机制。方法取SD大鼠30只,随机均分为空白对照组、模型组(实验性自身免疫性脑脊髓炎模型)和实验组(CD4~+CD25~+调节性T细胞输注),对EAE大鼠进行神经功能评分及体质量测量,通过病理学HE染色和免疫组化观察脑和脊髓炎症浸润,实时荧光定量PCR(qPCR)检测鼠脑和脊髓IFN-γ、IL-17、IL-23和Foxp3 m RNA水平表达。结果实验组SD大鼠神经功能评分明显改善,体质量明显增加;与模型组比较,实验组神经症状和病理改变减轻,鼠脑和脊髓IFN-γ、IL-17、IL-23 mRNA表达下降,而Foxp3 mRNA表达增加(P0.05)。结论 CD4~+CD25~+调节性T细胞通过调节免疫系统的脑和脊髓IFN-γ、IL-17、IL-23和Foxp3 mRNA水平的表达对EAE起保护作用。     

霉酚酸酯对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠症状及血CD4+CD45RA+T淋巴细胞的影响

目的： 研究霉酚酸酯(MMF)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠症状及血CD4+CD45RA+T淋巴细胞的影响。方法: 用豚鼠全脊髓匀浆和完全弗氏佐剂制成的完全抗原免疫Wistar大鼠制备EAE大鼠模型,以生理盐水和完全弗氏佐剂注射Wistar大鼠作为对照。造模成功且存活的大鼠为25只。随机分为4组：MMF大剂量组（30 mg·kg-1·d-1）、MMF小剂量组（20 mg·kg-1·d-1）、 甲基强的松龙组（30 mg·kg-1·d-1）、EAE组（生理盐水）,并给予相应的药物治疗14 d。每天进行神经功能评分,14d后流式细胞术观察各组血CD4+CD45RA+T淋巴细胞百分率,HE染色观察脑、脊髓组织病理变化。结果: 与对照组相比EAE模型大鼠脑脊髓组织血管周围有大量炎细胞浸润,神经功能评分明显增加,血CD4+CD45RA+T淋巴细胞百分数明显减少(均P<0.01);与EAE组相比,经MMF及甲基强的松龙治疗的各组大鼠神经功能评分下降,病理改变程度减轻,血CD4+CD45RA+T淋巴细胞百分数增加(均P<0.01);且大剂量MMF组疗效优于小剂量MMF组和甲基强的松龙组(均P<0.01);小剂量MMF组和甲基强的松龙组疗效差异无显著。结论: MMF通过上调CD4+CD45RA+T淋巴细胞比例发挥免疫抑制作用,不同剂量间疗效差异显著。     

MOG诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中枢及外周神经系统CD4~+ T及CD8~+ T调节性细胞变化

目的:观察实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中枢及外周CD4+ CD25+调节性T细胞(CD4+ CD25+ Treg),CD8+ CD28-调节性T细胞(CD8+ CD28- Treg)表达的变化情况,并探讨相关的细胞免疫学机制。方法:雌性C57BL/6小鼠随机分为未使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MEVGWYR-SPFSRVVHLYRNGK)(MOG35-55)免疫的对照组和使用MOG35-55免疫诱导的EAE小鼠模型组,采用临床症状评分记录小鼠行为学变化、HE染色观察CNS炎症细胞浸润及病理改变,使用流式细胞术(FCM)检测小鼠中枢及外周CD8+ CD28- Treg,CD4+ CD25+ Treg细胞表达水平。结果:MOG35-55诱导的EAE模型组动物出现典型的EAE临床行为学及病理学表现,FCM检测EAE模型组小鼠脾细胞CD4+ CD25+ Treg较对照组升高但无统计学差异,CD8+ CD28- Treg表达水平明显低于对照组(P0.01),EAE模型组中枢有CD4+ CD25+ Treg,CD8+CD28-Treg淋巴细胞的浸润,且CD4+ CD25+ Treg,CD8+ CD28- Treg在中枢的表达均高于外周,对照组中枢神经系统未检测到淋巴细胞浸润。结论:CD4+ CD25+ Treg,CD8+ CD28- Treg均参与调控EAE的病理过程,CD4+ CD25+ Treg,CD8+ CD28- Treg在EAE小鼠中枢及外周分布及变化的不同,提示其进入中枢神经系统(CNS)并参与调节中枢局部炎症。     

髓鞘碱性蛋白(MBP)特异的Wistar大鼠T细胞系的建立

目的：建立特异的大鼠T细胞系，为T细胞疫苗的研制打下基础。方法：采用足垫皮内注射豚鼠全脊髓匀浆（GPSCH）－福氏完全佐剂（CFA) 合乳剂和百日咳疫苗，诱导Wistar大鼠EAE模型。腹股沟淋巴结细胞经豚鼠髓鞘碱性蛋白（GPMBP）反复刺激，^3H-TdR掺入法筛选针对GPMBP特异增殖的T细胞。FACS检测T细胞表型。RT－PCR测定T细胞的细胞因子格局。结果：一次性足垫皮内注射GPSCH－CFA混合乳剂可诱导Wistar大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型，并证实了同时注射百日咳疫苗能提高发病率和发病程度。EAE大鼠脑、脊髓组织HE染色见大量淋巴细胞浸润，在血管周围形成淋巴鞘、但未见脱髓鞘改变。T细胞对GPMBP呈特异性增殖，为CD4^ 表型。RT－PCR结果显示T细胞IL－2和IFN－γmRNA表达水平较高，TNF-α亦低水平表达。结论：Wistar大鼠可用于制备EAE动物模型。GPMBP特异性T细胞系为CD4^ 表型，呈TH1类细胞因子格局。     

不同年龄大鼠脑组织中MHC、CD4及CD8分子的表达及其意义

目的：探讨MHC、CD4及CD8分子在不同年龄的大鼠脑组织中的表达及其意义.方法：将实验大鼠按胎龄和日龄分为7组：E15、E19、P0、P7、P14、P28及老年组（24月龄）;采用免疫组化方法,检测MHC、CD4和CD8分子在大鼠脑组织中海马区、脉络丛、大脑皮质及结缔组织的表达.结果：（1）E15d大鼠脑组织未见MHC Ⅰ类分子的表达;其他年龄组在结缔组织和脉络丛有MHC Ⅰ类分子的表达.其中从P0 d组～P14 d组大鼠的海马和部分大脑皮质神经元上MHCⅠ类分子的表达逐渐升高,P14 d组的表达最高（P＜0.05）;P28 d组的表达明显下降（P＜0.05）;老年组大鼠海马神经元上的表达再次升高（P＜0.05）.（2）E15 d组大鼠脑组织中未见MHC Ⅱ、CD4和CD8分子的表达;其他年龄组MHC Ⅱ、CD4和CD8除在结缔组织和脉络丛脉络膜表达外,在神经元上未见表达.（3）各年龄组在小脑皮质神经元上未见MHC Ⅰ、Ⅱ、CD4和CD8分子的表达.结论：胚胎后期脑内开始有MHC、CD4和CD8分子的表达,表明此时脑内已有可能出现免疫反应.在新生鼠及出生早期,部分皮质和海马神经元上有MHC Ⅰ类分子的表达,可能与调节神经元活动和突触可塑性连接有关.老年组大鼠MHC Ⅰ类分子在海马神经元上的表达升高,可能与神经元的功能衰退和记忆识别能力下降有关.     

急性髓细胞性白血病患者外周血单个核细胞CD28 mRNA的表达

背景：大量研究显示,肿瘤患者外周血T细胞表面共刺激分子CD28蛋白表达存在差异,提示共刺激通路异常可能与恶性肿瘤的发生进展有关。 目的：观察急性髓细胞性白血病外周血单个核细胞共刺激信号分子CD28 mRNA在中的表达。 方法：急性髓细胞性白血病患者80例,其中M0型7例,M1型6例,M2型18例,M3型15例,M4型17例,M5型9例,M6型8例。并根据急性白血病疗效标准将80例患者分为完全治愈组、缓解组、未缓解组。采用Taqman探针实时荧光定量PCR检测80例患者及76名健康人群外周血单个核细胞CD28 mRNA的表达。 结果与结论：急性髓细胞性白血病外周血单个核细胞M1,M3和M4亚型中的CD28 mRNA表达量低于健康人群 (P< 0.05);急性髓细胞性白血病未缓解组中CD28 mRNA低于健康人群 (P < 0.05),完全治愈组和缓解组中CD28 mRNA表达与健康人群差异无显著性意义。说明急性髓细胞白血病患者外周血单个核细胞存在CD28 mRNA表达缺陷,并与临床分期、病情进展及预后有关。     

促红细胞生成素模拟肽对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的治疗作用及机制

目的研究促红细胞生成素模拟肽(erythropoietin mimetic peptide,EPO-P)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)大鼠的治疗作用及机制。方法将Lewis大鼠共12只随机分为EPO-P治疗组6只和PBS对照组6只,使用合成肽段MBP68-84诱发大鼠急性EAE模型,每天测量神经功能评分至实验结束,免疫后第7天开始进行EPO-P治疗。在第13天(高峰期),取大鼠脊髓腰段,用HE染色观察单个核细胞炎症浸润;用流式细胞术分析CD4+T细胞在外周血中的数目;取淋巴结,用荧光定量PCR方法检测IFN-γ、IL-4、IL-17和Foxp3的相对表达。使用放射性3H-TdR掺入法检测淋巴细胞增殖实验中EPO-P的抑制作用。结果 EPO-P治疗后大鼠EAE严重程度显著降低;HE染色显示治疗组脊髓腰段单个核细胞炎症浸润减少;细胞流式分析显示治疗组外周血CD4+T细胞减少;荧光定量PCR结果显示治疗组淋巴结中IFN-γ和IL-17表达减少,而IL-4和Foxp3表达增加;淋巴细胞增殖实验表明EPO-P剂量依赖性抑制淋巴细胞增殖。结论 EPO-P对EAE有明显治疗作用,这种治疗作用可能与EPO-P抑制T细胞的炎症浸润和增殖反应,抑制Th1/Th17类细胞因子炎症损伤,促进Th2/Treg类细胞因子免疫抑制作用有关。     

Foxp3转染对大鼠CD4~+T淋巴细胞体外增殖能力的影响

目的 探讨Foxp3基凶转染对大鼠CD4+CD25-T淋巴细胞体外增殖能力的影响.方法 以逆转录病毒载体介导roxp3基凶进入大鼠CD4+CD25-T淋巴细胞,以TGFβ诱导Foxp3基因表达.通过观察报告基因的表达水平及流式细胞仪检测评价转染效率,将转染Foxp3基因的大鼠CD4+CD25-T淋巴细胞、CD4+CD25+T淋巴细胞、大鼠脾脏单个核细胞分别与同系大鼠单个核细胞混合培养,液体闪烁法测定各组细胞增殖水平.结果 Foxp3组增殖水平(3 354.18±203.73)略高于调节性T细胞组(2 919.25 ±137.91),但明显低于空白对照组(12 706.06±967.47).结论 经逆转录病毒介导Foxp3基因可在CD4+CD25-T淋巴细胞高表达,并使该细胞获得与CD4+CD25+T淋巴细胞相似的免疫无能及免疫抑制特性.     

高丽参提取液对大鼠自身免疫性脑脊髓膜炎的保护作用

目的:探讨高丽参提取液(Korean red ginseng extract,KRG)对实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)的治疗作用及相关免疫调节机制。方法:取SD 大鼠30 只,随机分为空白对照组、模型组(实验性自身免疫性脑脊髓炎模型)和实验组(高丽参提取液治疗),每组10 只,对EAE 大鼠进行神经功能评分及体重测量,通过病理学HE 染色和免疫组化观察25 d 脑和脊髓炎症浸润,流式细胞术检测大鼠脊髓和淋巴结CD4+ 、CD4+ / IFN-β+(Th1)、CD4+ / IL-17+(Th17)和CD4+ / Foxp3+ T 细胞数量,实时荧光定量q-PCR 检测大鼠脊髓和淋巴结IFN-β、IL-17、IL-23 和Foxp3 mRNA 水平的表达。结果:治疗组大鼠神经功能评分明显改善,体重明显增加;与模型组比较,实验组神经症状和病理改变减轻;与模型组相比,治疗组中大鼠脊髓和淋巴结 CD4+ 、CD4+ / IFN-β+ 、CD4+ / IL-17+ T 细胞数量减少,而CD4+ / Foxp3+ T 细胞数量增多(P<0.05);大鼠脊髓和淋巴结IFN-β、IL-17、IL-23 mRNA 表达下降,而Foxp3 mRNA 表达增加(P<0.05)。结论:高丽参提取液通过调节免疫系统的CD4+ 、CD4+ / IFN-β+ 、CD4+ / IL-17+和CD4+ / Foxp3+ T 细胞数量和CD4+ T 细胞分泌细胞因子的水平对EAE 起保护作用。     

炎症性肠病患者外周血CD4+CD25+Treg细胞及其特异标志物Foxp3表达水平的研究

目的：通过检测炎症性肠病（IBD）不同病期患者以及对照组外周血CD4^＋CD25^＋Treg及其特异标志物Foxp3的表达，来分析与IBD疾病活动性关系，探讨CD4^＋CD25^＋Treg和Foxp3在IBD发病机制中的作用。方法：52例IBD患者和35例正常对照组分别应用流式细胞术和逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）检测外周血中CD4^＋CD25^＋T细胞亚群的百分率测定和外周血单个核细胞Foxp3mRNA的表达水平。结果：IBD患者外周血CD4^＋CD25^＋Treg细胞比例明显低于疾病缓解期患者和正常对照组（P〈0．01）；活动期IBD患者中使用激素和／或免疫抑制剂与未使用激素和／或免疫抑制剂结果差异有统计学意义；IBD患者外周血单个核细胞（PBMC）中Foxp3mRNA表达水平低于缓解期和正常人，差异有显著性（P〈0．05）；缓解期Foxp3mRNA水平与正常人差异无显著性（P〉0．05）；IBD患者外周血CD4^＋CD25^＋Treg细胞表达率及PBMC中的Foxp3mRNA表达水平与疾病活动指数评分呈负相关性。结论：活动期IBD患者外周血CD4^＋CD25^＋Treg细胞及Foxp3mRNA表达下调，而恢复期其表达回升，且二者呈正相关，并与临床活动评分呈负相关，因此认为CD4^＋CD25^＋Treg细胞和Foxp3可能参与疾病的发生发展，与疾病的活动性密切相关。     

乙型肝炎e抗原、s抗原对Toll样受体及共刺激分子表达的调控和影响

目的：探讨乙型肝炎e抗原、s抗原（HBeAg、HBsAg）对健康人外周血单个核细胞（PBMC）Toll样受体（TLRs）和共刺激分子表达的影响。方法：分别用HBeAg、HBsAg、空质粒以及卵清蛋白（OVA）作为无关蛋白刺激健康人外周血单个核细胞（PBMC）,采用流式细胞技术检测各刺激组CD14＋细胞TLR2、TLR4、CD86、PD-L1的表达水平。结果：健康人PBMC经HBeAg或HBsAg刺激后,CD14＋细胞表面TLR2、TLR4的表达明显低于未刺激组（P〈0.05）,CD14＋细胞PD-L1的表达则明显增高（P〈0.05）;HBeAg刺激后同时可见CD14＋细胞表面共刺激分子CD86的表达水平明显降低（P〈0.02）。结论 HBeAg和HBsAg通过上调单核细胞表面PD-L1的表达,下调CD14＋单个核细胞表面TLR2、TLR4和共刺激分子CD86的表达,削弱机体固有免疫系统的应答能力,降低启动特异性免疫的活化信号,从而导致免疫清除逃避。因此,HBeAg和HBsAg可能是促进HBV感染慢性化的重要因素。     

CD226在系统性红斑狼疮患者T淋巴细胞亚群上的表达

目的：研究CD226在SLE患者外周血T淋巴细胞亚群上的表达，以阐明CD226抗原在SLE患者体内T细胞活化中作用以及与SLE发病的关系。方法：31例SLE患者和30例健康志愿者外周血单个核细胞，在体外培养72h后，三色荧光标记的单克隆抗体染色，利用流式细胞仪测定T细胞亚群细胞表面CD226抗原的表达。结果；SLE患者组的CD3^ 、CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞上CD226^ 表达均高于正常对照组（P＜0．01）；活动期SLE组、静止期SLE组的CD3^ 、CD4^ 、CD8^ T细胞上CD226^ 表达均显著高于对照组（P＜0．01），而活动期与静止期患者之间T细胞亚群上CD226^ 表达则无显著性差异（P＞0．05）。SLE患者CD3^ 、CD4^ 、CD8^ T细胞CD226^ 抗原表达水平与SLEDAI之间无明显相关性（P＞0．05）。结论：SLE患者体内存在T细胞亚群异常活化；活动期、静止期SLET淋巴细胞CD226^＋表达均增高，CD226^ 可能参与了SLE的免疫发病。     

重症肌无力患者外周血B7：CD28／CTLA4共刺激分子表达的动态变化

目的：研究重症肌无力（MG）患者B7：CD28／CTLA4共刺激通路相关分子表达动态变化及其与MG发病的关系。方法：用流式细胞仪检测18例MG患者和16例健康对照者外周血单个核细胞（PBMC）在经PMA（佛波酯）＋ionomycin(钙离子导入剂）刺激的0h,6h,24h,48h时B7－1、B7－2、CD28、CTLA4分子在CD4^ T细胞和CD8^ T细胞表面的表达。结果：（1）0h,MG患者B7－1、B7－2分子总体表达增加，CD4^ 、CD8^ T细胞表面B7－1、B7－2的表达未见明显增加，PMA＋ionomycin刺激后B7－1、B7－2在CD4^ 、CD8^ T细胞表面也无增加；（2）0h,CD28、CTLA4的表达增强，其中CD28^ 细胞的增多主要表现在CD4^ T细胞亚群，CTLA4的表达增强主要在CD8^ T细胞，在PMA＋ionomycin激活后，CD28表达明显增强，持续到48h都处于较高水平（与对照组相比P＜0．01），CTLA4表达出现短暂增强，6h即达高峰，以后下降，与对照组相比无显著增强（P＞0．05）。结论：MG患者外周血中B7：CD28／CTLA4通路共刺激相关分子表达增高，持续时间延长，检测共刺激分子的表达可反映机体的免疫激活状态，B7：CD28／CTLA4通路在MG发病中可能起重要作用。     

鼻黏膜诱导免疫耐受预防实验性自身免疫性脑脊髓炎机制的研究

目的：探讨鼻黏膜免疫耐受对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的预防机制以及与耐受原相关的剂量依赖性。方法：建立Lewis大鼠EAE模型，用不同种属和剂量髓鞘碱性蛋白（MBP）诱导免疫耐受，评估EAE临床发病情况；检测特异性淋巴细胞增殖反应ELISPOT检测特异性单个核细胞IFN-γ表达及原位杂交方法检测相关细胞因子的变化。结果：经鼻黏膜给予低剂量（30μg／rat）和高剂量（600μg／rat）特异性抗原可诱导免疫耐受，抑制EAE的发生。淋巴细胞增殖实验显示，高、低剂量耐受组与对照组相比均可抑制特异性淋巴细胞增殖反应（P〈0．001；P〈0．01）。ELISPOT结果表明，与对照组相比高、低剂量耐受组单个核细胞IFN-γ表达数量明显降低（P〈0．01；P〈0．001）。原位杂交结果显示，与对照组相比，低剂量组IL-4mRNA的表达水平明显增高（P〈0．001），高剂量组未见明显增高（P〉0．05）。结论：经鼻黏膜可诱导机体产生免疫耐受，预防EAE的发生。给予低剂量抗原可引起Th1／Th2分泌的细胞因子发生偏离，产生免疫耐受。     

RhoA和Rock-Ⅱ在Lewis大鼠EAE模型中的表达

目的研究RhoA和Rock-Ⅱ在Lewis大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中的表达,探索其在EAE模型中的作用。方法把36只Lewis大鼠随机分为两组：A组（空白对照组）,B组（EAE模型组）。以豚鼠全脊髓为抗原混合福氏完全佐剂（CFA）,诱导Lewis大鼠EAE模型,观察实验动物神经功能损害的情况;采用免疫组织化学染色法观察实验动物各组脑、脊髓组织中RhoA、Rock-Ⅱ的表达。结果成功建立Lewis大鼠EAE模型,RhoA和Rock-Ⅱ在EAE模型组的表达较空白对照组明显增加,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论 RhoA和Rock-Ⅱ在EAE模型中过量表达,可能在EAE模型的发病过程中起关键作用。     

中国HIV感染者细胞毒性淋巴细胞与CD4~+CD25~+调节性T细胞相关性研究

目的：对中国HIV感染者NK细胞、CD8^＋T细胞及胞内穿孔素、颗粒酶-B表达与CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋调节性T细胞水平的相关性进行研究,探讨调节性T细胞在HIV感染中的作用机制。方法：选取73名HIV/AIDS患者（长期不进展组、无症状HIV组、AIDS组）,应用流式细胞仪胞内染色技术检测NK细胞、CD8^＋T细胞数量及胞内穿孔素、颗粒酶-B表达水平,分析其与CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋调节性T细胞水平的相关性。结果：CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋调节性T细胞百分率与NK细胞、CD8^＋T淋巴细胞数量呈明显负相关（P〈0.01）,与CD8^＋T细胞内穿孔素、颗粒酶-B表达百分率呈明显正相关（P〈0.05）,与NK细胞内穿孔素、颗粒酶-B表达水平绝对值负相关（P〈0.01）,与CD8＋T细胞内颗粒酶-B表达绝对值呈明显负相关（P〈0.01）,与CD8^＋T细胞内穿孔素表达绝对值无明显相关性（P〉0.05）。CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋调节性T细胞绝对值与CD8^＋T细胞内穿孔素、颗粒酶-B表达百分率呈明显负相关（P〈0.05）。结论：中国HIV感染者细胞毒性淋巴细胞数量功能的变化与调节性T细胞显著相关,提示高水平的调节性T细胞可能与细胞毒性淋巴细胞耗竭相关,可能为导致疾病进展的原因之一。     

CD28-B7共刺激通路对外周血单个核细胞移植治疗重症肌无力的作用

背景：有研究表明,CD28-B7共刺激通路与重症肌无力的发生密切相关,但在干细胞移植治疗重症肌无力过程中的作用机制至今少有报道。 目的：观察CD28-B7共刺激通路在重症肌无力大鼠模型中的表达情况。 方法：40只雌性Lewis大鼠等分为正常组、模型组、佐剂组和移植组。后3组大鼠腹腔注射重症肌无力患者血清制备重症肌无力模型。移植组大鼠连续5 d皮下注射粒细胞集落刺激因子10 μg/(kg•d)动员骨髓中造血干细胞进入外周血,颈动脉采血10 mL,分离获得单个核细胞,加入适量生理盐水调节核细胞浓度至2×10⁹ L^-1;环磷酰胺50 mg/kg于移植前第4,3,2天从尾静脉注入,1次/d,移植当天用胰岛素注射针吸取单个核细胞自尾静脉注入,移植成功。佐剂组给予等量生理盐水和环磷酰胺。 结果与结论：移植组大鼠血清抗乙酰胆碱受体滴度、CD28、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、B7.1及B7.2的表达均显著低于模型组(P < 0.01);模型组和移植组大鼠血清抗乙酰胆碱受体滴度滴度与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4呈正相关(r=0.236,P=0.001和r=0.215,P=0.013);移植组大鼠Lennon评分显著低于模型组(P < 0.01)。提示干细胞移植可以通过抑制CD28-B7共刺激信号通路以调节机体的免疫系统。     

MOG诱导小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎及其对CD4+CD25+调节性T细胞的影响

目的： 探讨采用分子克隆技术诱导表达出的含硫氧还蛋白基团的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白细胞外Ig样结构域(MOGIgd-TrxA)融合蛋白免疫C57BL/6小鼠,建立多发性硬化的动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎的可行性;通过检测模型小鼠脾脏中CD4+CD25+调节性T细胞的数量,初步探讨CD4+CD25+调节性T细胞在实验性自身免疫性脑脊髓炎发病机制中的作用。方法: (1)分子克隆技术合成MOGIgd-TrxA融合蛋白,纯化、超滤浓缩后Bradford法测定蛋白浓度。(2)动物实验:C57BL/6小鼠,随机分为4组：MOGIgd-TrxA组（MOG组）、豚鼠脊髓匀浆组、硫氧还蛋白（TrxA）组及生理盐水正常对照组,每组动物12只,各组以相应抗原乳剂免疫小鼠制作EAE模型后评估其临床神经功能、组织病理(HE染色和髓鞘luxol fast blue染色)并评价模型质量。(3)流式细胞仪(FACS)检测小鼠脾脏中CD4+CD25+调节性T细胞的百分比。结果:(1)纯化浓缩后MOGIgd-TrxA蛋白纯度达98%左右,浓度约2.3 g/L。(2)MOG组小鼠与豚鼠脊髓匀浆组小鼠在临床神经功能评分等方面无显著差异(P>0.05)。2组发病动物组织切片HE染色和髓鞘染色均有不同程度的病理改变。(3)CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞比例MOG组为(4.71±1.61)％,豚鼠脊髓匀浆组为(1.44±0.65)％,均明显低于生理盐水正常对照组（9.22±1.24）％和硫氧还蛋白（TrxA）组（8.97±1.20）％(P<0.01)。结论: (1)分子克隆技术合成的MOGIgd蛋白免疫C57BL/6小鼠能够成功诱导出EAE模型,且模型稳定、发病率高,为进一步研究MS免疫发病机制并采取有效治疗措施奠定基础;(2)CD4+CD25+调节性T细胞数量减少可能与EAE小鼠临床表现相关。     

骨髓基质干细胞治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的实验研究

目的：通过体内、外实验，研究骨髓基质干细胞（BMSCs）对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的治疗作用及其机制。方法：建立Lewis大鼠EAE动物模型，在免疫后第6天尾静脉回输PKH26标记的BMSCs，于发病高峰期处死大鼠，组织取材。通过临床评估、荧光示踪、免疫学病理学等方法检测，评估BMSCs对EAE的治疗作用及其机制。同时在体外用化学方法诱导BMSCs向少突胶质细胞分化，观察其分化的情况。结果：通过尾静脉回输，BMSCs能够聚集到病变部位，并发生分化。与对照组相比，回输组大鼠发病临床评分较低，中枢神经系统脱髓鞘的病理改变和炎性细胞浸润减轻，CD4^＋和CD8^＋T细胞表达明显减少（P〈0．05），血清及淋巴细胞培养上清中IFN-γ和TNF-α的分泌水平显著降低（P〈0．05），IL4的分泌水平显著升高（P〈0．05）。体外诱导72小时未见到BMSCs向少突胶质细胞分化；4天后45％的BMSCs发生分化。结论：在体外BMSCs通过化学诱导可以向少突胶质细胞分化；在体内BMSCs能向病变部位迁移，并部分分化成少突胶质细胞，同时BMSCs通过调节免疫系统的炎症细胞因子表达、CD4^＋和CD8^＋T细胞数和Th1和Th2细胞平衡，对EAE起治疗作用。     

髓系来源的Gr-1~+CD11b~+抑制细胞参与实验性自身免疫性脑脊髓炎的免疫调节

目的探讨Gr-1+CD11b+髓系来源的抑制细胞(MDSC)在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中的数量变化及功能。方法 30只健康雌性C57BL/6小鼠随机分为EAE诱导组和对照组,借助MOG35-55多肽免疫诱导制备EAE小鼠模型,采用HE染色和Luxol快蓝染色评估发病动物的脊髓病理变化。流式细胞分析和免疫荧光染色技术确定2组小鼠脾脏和脊髓组织中Gr-1+CD11b+MDSC的数量变化,体外细胞共培养检测来自EAE小鼠的Gr-1+CD11b+MDSC对CD4+T细胞及CD8+T细胞体外增殖能力的影响。结果 EAE造模成功率为80%(12/15),HE染色显示炎症细胞广泛浸润于EAE小鼠脊髓组织,Luxol快蓝染色在炎性浸润灶内发现多处脱髓鞘区域。EAE诱导组小鼠脊髓组织切片中可见大量Gr-1+CD11b+MDSC,而对照组未发现任何阳性细胞。EAE小鼠的脾质量显著大于对照组[(146.5±12.4)mg vs(67.2±8.7)mg,P0.01],其中Gr-1+CD11b+MDSC比率明显增高(P0.01)。与免疫荧光染色结果一致,流式细胞术分析在EAE小鼠脊髓中亦可见明显增多的Gr-1+CD11b+MDSC。体外细胞共培养实验显示,EAE小鼠脊髓中Gr-1+CD11b+MDSC可显著抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的分裂增殖。结论EAE诱导了Gr-1+CD11b+MDSC在脾脏和脊髓中的扩增和聚集,后者参与了EAE疾病的免疫调节过程。