人乳头瘤病毒16 L1/CEA CTL表位融合蛋白的原核表达研究

目的:构建人乳头瘤病毒(HPV)16型衣壳蛋白L1与癌胚抗原(CEA)细胞毒T细胞(CTL)表位嵌合基因,探讨其在原核表达系统中的表达情况。方法:选择CEA CTL表位(CEA691 IMIGVLVGV),以HPV16阳性宫颈癌组织提取的DNA为模板,通过PCR方法扩增出HPV16 L1/CEA CTL表位嵌合基因,克隆入pET32a( )表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,通过Ni-NAT离子交换柱层析纯化,进一步采用SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定。结果:pET32a( )/HPV16 L1/CEA CTL表位重组质粒构建成功,并在大肠杆菌中得到表达。SDS-PAGE分析表明表达产物分子质量(Mr)约为83×103,与预期相符,Western-blot方法进一步证实其为目的蛋白。结论:利用pET32a( )表达载体能表达HPV16 L1/CEA CTL表位重组蛋白,为其进一步的免疫效应研究打下了基础。     

人乳头瘤病毒16 L1/CFA CTL表位融合蛋白的原核表达研究

目的:构建人乳头瘤病毒(HPv)16型衣壳蛋白L1与癌胚抗原(CEA)细胞毒T细胞(CTL)表位嵌合基因,探讨其在原核表达系统中的表达情况.方法:选择CEA CTL表位(CEA691 IMIGVLVGV),以HPVl6阳性宫颈癌组织提取的DNA为模板,通过PCR方法扩增出HPVl6 LI/CEA CTL表位嵌合基因,克隆入pET32a( )表达载体,转化大肠杆茵BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,通过Ni-NAT离子交换柱层析纯化,进一步采用SDS.PAGE和Western-blot分析鉴定.结果:pET32a( )/HPVl6 L1/cEA CTL表位重组质粒构建成功,并在大肠杆菌中得到表达.SDS·PAGE分析表明表达产物分子质量(Mr)约为83 X 10.,与预期相符,Western-blot方法进一步证实其为目的蛋白.结论:利用pET32a( )表达载体能表达HPVl6 L1/cEA CTL表位重组蛋白,为其进一步的免疫效应研究打下了基础.     

肠道病毒71型衣壳蛋白VP1基因部分序列在大肠杆菌中的表达

目的 克隆、表达和鉴定肠道病毒71型广州株EVGZ06VP1基因部分序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础.方法 在成功克隆肠道病毒71型广州株EVGZ06全长VP1蛋白基因并测序的基础上,将部分VP1蛋白基因克隆到表达载体pET28a( )上,构建了重组表达质粒pET28a( )/(502～891)VP1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni2 亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法 检测其抗原性.结果 重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量为19 000,与预计大小一致.ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性.结论 本研究成功克隆和表达了肠道病毒71型VP1基因部分序列,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础.     

人乳头瘤病毒16型E7基因的原核克隆与表达

目的:研究人乳头瘤病毒(Human papillomavirus HPV)16型E7在原核表达系统中的表达情况和活性,为制备HPV16型E7蛋白疫苗奠定实验基础.方法:通过聚合酶联反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从HPV16 DNA阳性的宫颈癌组织中扩增HPV16 E7全长基因,进一步将其克隆入原核表达载体pET32a( ),并构建重组质粒pET32a( )/HPV16 E7,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达的融合蛋白,用镍螯合亲和层析胶体(Ni-NTA Agarose)纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹法(Western blot,WB)分析鉴定.结果:测序证明成功构建重组质粒pET32a/HPV16E7,IPTG诱导下HPV16E7融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的16%,蛋白质印迹鉴定重组E7蛋白与表达载体的标签蛋白形成相对分子质量约30×103的可溶性融合蛋白.结论:重组质粒pET32a/HPV16E7在大肠杆菌BL21中高效表达目的蛋白.     

利用重叠PCR实现乙肝表面抗原CTL表位的替换

目的 以磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(glypican-3,GPC3)的CTL表位EYILSLEEL替换HBsAg中内源性CTL表位LLD,构建用于预防和治疗乙肝的DNA疫苗.方法 以重组表面抗原基因pcHBsAg质粒为模板,应用重延伸PCR扩增出含EYILSLEEL表位的HBsAg基因HBsAg/GPC3,将其插入pBSSK+载体中,构建出pBSSK/GPC3载体.利用DNA重组技术将其定向插入真核表达载体pcDNA3.1+中,将真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定,构建表达CTL表位EYILSLEEL的DNA疫苗.结果 酶切和测序的结果显示序列无错配,获得了完整表达EYILSLEEL表位的真核质粒pcDNA3-HBsAg/GPC3.结论 成功将EYILSLEEL表位替换HBsAg的内源性CTL表位,构建了pcDNA3-HBsAg/GPC3真核表达质粒.     

人乳头瘤病毒18型E2基因的原核表达载体构建与表达

目的 将人乳头瘤病毒18型(Human papillomavirus 18, HPV18) E2基因插入到原核表达载体pET28a( )T7启动子下游,构建原核表达载体pET28a( )-HPV18E2,原核表达并纯化HPV18E2蛋白,为研究HPV18 E2蛋白相关疫苗奠定实验基础.方法 1)以HPV18型基因组DNA为模板,运用聚合酶链反应扩增E2基因,将其插入到原核表达载体pET28a( )中,构建重组表达质粒pET28a( )-HPV18E2;2) PCR、限制性内切酶切分析以及核酸序列测定重组质粒pET28a( )-HPV18E2的正确性;3)将重组表达质粒pET28a( )-HPV18E2转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达,经镍螯合亲和层析胶体纯化HPV18E2蛋白;4)十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定HPV18E2蛋白的正确表达.结果 1) PCR、限制性内切酶切分析和核酸序列分析鉴定证实了重组表达质粒pET28a( )-HPV18E2的成功构建;2) SDS-PAGE电泳分析, HPV18E2蛋白在大肠杆菌BL21中表达量占菌体总蛋白的21%,纯化后的蛋白纯度大于90%;经Western blot鉴定,显示HPV18E2蛋白与标签蛋白(6xHis)形成相对分子质量约42KD的蛋白,与理论预计值相符.结论 1)成功构建了原核表达载体pET28a( )-HPV18E2;2)原核表达获得了HPV18E2蛋白.     

HSP-沙眼衣原体MOMP T细胞表位基因的重组、原核表达和蛋白质纯化

目的：构建热休克蛋白65（HSP65）与沙眼衣原体（C.trachomatis,Ct）主要外膜蛋白（MOMP）T细胞表位（简称ctm1）融合蛋白（简称H-ctm1）的原核表达载体,并将其表达及纯化。方法：用PCR技术获得HSP65基因和ctm1基因,并分别将其克隆入pMD18-T载体,采用酶切与连接的方法从pMD18-T载体上获得HSP65基因片段,并将其克隆入pET28a表达质粒,再用相同的方法将ctm1基因连接于HSP65基因片段的下游,从而完成H-ctm1的基因重组。用IPTG诱导转化H-ctm1表达载体的大肠杆菌,以镍金属螯合亲和层析法纯化融合蛋白质。结果：构建了HSP65与ctm1的表达载体pET28a-H-ctm1,DNA序列测定结果表明构建正确。以镍金属螯合亲和层析获得纯度为98%的融合蛋白质。结论：用分子克隆技术正确构建HSP65与Ct MOMP T细胞表位融合蛋白的表达载体,并成功表达与纯化出具有生物活性的融合蛋白。     

结核杆菌抗原多表位融合蛋白的重组表达与鉴定

目的:构建含有6个编码结核杆菌抗原HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位基因序列的重组质粒,并在大肠杆菌中诱导表达.方法:选取结核杆菌抗原Rv0309、Rv0173、Ag85A、Ag85C的6个HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位,引入Th表位PADRE及木马肽序列,并以RVKR序列作为接头,合成全基因序列,经 PCR扩增后插入融合表达载体pGEX-4T-1,将重组质粒转入大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western印迹鉴定重组表达蛋白.结果:成功构建了结核杆菌多表位蛋白的表达质粒,并经IPTG诱导表达了大小约为40 000的融合蛋白.结论:多表位融合蛋白的重组表达为进一步开发新型结核疫苗打下了基础.     

同种异型抗原激活并套式PCR法克隆人颗粒溶素Mr 15000与Mr 900O活性片段

目的:采用套式PCR克隆经同种异型抗原激活后的人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达的颗粒溶素(Granulysin,GLS)Mr 15000与Mr 9000活性片段的编码序列并进行序列测定与分析,为进一步表达纯化该活性片段和研究GLS的免疫杀伤机制奠定基础.方法:抽提经过培养并激活的健康人CTL淋巴细胞总RNA,经逆转录后以套式PCR方法扩增出GLS的Mr15000与Mr 9000活性片段的编码序列,插入pET32a( )载体,转化大肠杆菌TOP10,阳性克隆经PCR及酶切鉴定后进行测序分析.结果:成功扩增出了包含GLSMr15000与Mr9000活性片段完整编码序列的cDNA,与预期大小相同,PCR、酶切及测序鉴定证明得到了读码框正确的pET32a-Mr 15000与pET32a-Mr 9000重组子.序列分析表明GLS基因编码产物在第119位存在氨基酸多态性.结论:人天然颗粒溶素Mr 15000与Mr 9000活性片段编码序列能够通过以上方法获得和克隆并用于后续研究.     

HPV16L1ORF的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的获得足够量的人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1融合蛋白及含HPV16L1ORF序列的基因重组体。方法通过PCR扩增获得HPV16L1基因片段,将此片段插入原核细胞表达载体pGEMEX-1,构建相应的重组表达质粒pGEMEX-L1,将此质粒转化大肠杆菌JMl09(DE3),得到的转化子经IPTG诱导表达后进行菌体蛋白的Western blotting免疫印迹分析。结果HPV16L1基因重组体构建成功,克隆的目的基因片段在大肠杆菌中产生的融合表达产物在Western blotting检测中具有和抗HPV16L1阳性血清反应的抗原性。结论HPV16L1基因片段可在大肠杆菌中得到有效表达,表达产物可与相应的抗血清发生阳性反应。     

蓝氏贾第鞭毛虫甲硫氨酸硫氧化物还原酶基因的克隆、表达与纯化

目的 蓝氏贾第鞭毛虫（简称为贾第虫）甲硫氨酸硫氧化物还原酶基因（GlMSR）,进行原核表达获得其重组蛋白。方法 依据GenBank中GlMSR序列设计引物,以贾第虫中国C2 克隆株基因组DNA 为模板,通过PCR扩增编码序列,将所得片段连接至质粒pET28a以构建原核表达载体pET28a-GlMSR,将pET28a-GlMSR导入大肠杆菌E.coli JM109并挑取阳性克隆进行基因测序和鉴定。用化学方法将经测序验证的重组质粒pET28a-GlMSR转化至E.coli BL21（DE3）。经异丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside, IPTG）诱导表达后,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组蛋白表达结果。收集沉淀中的重组表达产物,镍柱亲和层析纯化带组氨酸标签的重组蛋白,并通过免疫印迹鉴定纯化结果。结果 电泳结果显示在约624 bp处出现目的DNA条带,表明成功得到GlMSR编码序列;PCR 鉴定、酶切鉴定以及基因测序结果表明成功构建重组表达载体pET28a-GlMSR,经IPTG诱导后在沉淀中获得目的蛋白,目的蛋白分子量（Mr）约为25 000,与预期分子量（Mr）22 800基本相符。经Western blot分析显示该重组蛋白含有His6标签。结论 本研究克隆、表达了蓝氏贾第虫GlMSR基因,并纯化获得重组蛋白,为进一步探索该酶的功能奠定了基础。     

梅毒螺旋体重复蛋白K的克隆表达

目的体外克隆并表达梅毒螺旋体重复蛋白K，为制备预防性疫苗奠定基础。方法利用PCR反应及基因重组技术，扩增重复蛋白K编码基因，构建重组质粒pET28b（＋）／TprK，IPTG诱导表达。结果PCR法扩增出了1350bp的目的片段，原核表达质粒pET28b（＋）／TprK酶切鉴定正确，测序结果与Gengbank上公布的该基因序列完全一致，并可在大肠杆菌中高效表达。结论成功构建人pET28b（＋）／TprK原核表达载体，并能高效表达TprK蛋白，为梅毒的预防性疫苗的制备以及进一步研究其血清学诊断试剂奠定了基础。     

HPV16 E7蛋白编码基因原核表达与鉴定

目的研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16E7蛋白原核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16E7基因,经BamH Ⅰ和Hind Ⅱ双酶切后插入相同酶切pET32a（＋）载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS—PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32／E7,HPV16E7-TRX融合蛋白在BL21（DE3）菌株中高效表达,在1mmol／L IPTG、30℃诱导条件下融合蛋白表达量占菌体总蛋白的30％左右。结论pET32／E7原核表达质粒的构建、HPV16E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础。     

刚地弓形虫肌动蛋白profilin的原核表达和纯化

目的：探讨刚地弓形虫肌动蛋白profilin （TgPRF）的原核表达体系和纯化条件,为后续的抗肿瘤免疫佐剂研究提供依据。方法：以弓形虫RH株速殖子的cDNA为模板,采用一对特定的引物扩增TgPRF基因的编码区。PCR产物双酶切后克隆入pET28a （+）载体中。重组的pET28a （+）-TgPRF质粒转化E.coli DH5α感受态细胞。双酶切鉴定阳性克隆,并选取测序正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）表达菌,经IPTG诱导表达4 h,SDS-PAGE法检测TgPRF蛋白的表达,Western blotting法检测重组蛋白His-prolilin的表达。结果：PCR扩增产物长度为492 bp。经双酶切和测序,重组质粒pET28a-TgPRF连接产物构建成功。SDS-PAGE检测,目的蛋白在超声菌液的上清中表达。经Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化,获得纯化的TgPRF蛋白（纯度>90%）。Western blotting检测,重组TgPRF蛋白能被Anti-His抗体识别。结论：成功构建重组质粒pET28a-TgPRF,并实现可溶性原核表达。     

具有免疫反应性的弓形虫多表位抗原在大肠杆菌中的可溶性表达和鉴定

目的 获得弓形虫多表位基因在原核系统中可溶性表达产物,为弓形虫病重组抗原试剂盒的制备及疫苗的研究奠定基础.方法 以PCR法扩增弓形虫多表位基因,使其两端带有与载体pET2a相匹配的酶切位点,插入载体pET2a,酶切并测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE),以IPTG进行诱导,SDS-PAGE分析和鉴定该基因的表达水平、表达产物的可溶性及其相对分子质量,Western-blot分析表达产物的免疫反应性.结果 该基因在原核表达系统中经诱导,得到了M_r1000的可溶性融合表达产物.经Ni-NTA纯化,纯度可达90%以上.免疫印迹实验表明该产物能够被弓形虫B6感染的小鼠血清和弓形虫RH感染的兔血清特异识别.结论 弓形虫多表位基因在原核中的可溶性表达产物在弓形虫病诊断及疫苗研究中有潜在的应用价值.     

HIV-1核心抗原p24基因的表达、纯化及应用研究

目的在原核系统中表达全长HIV-1p24抗原,对其抗原性进行鉴定,探讨其对HIV早期诊断的价值。方法利用PCR技术从含有HIV-1gag基因质粒PTM-1中扩增p24蛋白基因,通过酶切消化后连接到表达载体pET28a上,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,表达p24抗原。通过ELISA和Westernblotting（WB）法检测表达产物的免疫反应活性及特异性。结果PCR产物和构建的重组质粒pET28a—p24经双酶切均显示约690bpDNA片段,与预期p24抗原全基因片段大小-致。SDS—PAGE电泳可见纯化蛋白为1条相对分子量约26x10,Mr的外源表达蛋白带,与预期大小-致。ELISA及WB实验证实表达的p24抗原具有较好的活性及特异性。时间分辨荧光免疫双抗体夹心法显示与市售p24抗原线性-致。结论构建了HIV-1p24／pET28a原核高效表达系统,表达产物与市售的p24抗原具有相似的抗原性。     

融合蛋白ScFv（3G11）-mms13在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的：构建抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因ScFv与磁小体膜蛋白基因mms13融合基因的原核表达载体pET30a（＋）-ScFv-mms13,在大肠杆菌中诱导表达并对融合蛋白进行初步鉴定。方法 PCR扩增融合基因ScFv-mms13,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆入原核表达载pET30a（＋）质粒,构建重组表达质粒。将重组质粒导入大肠杆菌DH5ɑ中,利用PCR、酶切筛选鉴定重组菌株。用异丙基疏代半乳糖苷（ IPTG）诱导表达融合蛋白,通过改变IPTG浓度、诱导时间优化表达条件。表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。结果重组质粒经PCR、酶切、测序证实重组质粒pET30a（＋）-ScFv-mms13构建成功。 SDS-PAGE电泳结果分析表明诱导菌株在43kDa左右处有明显异源蛋白表达,且确定了在IPTG终浓度为0．2mmol/L、诱导时间为6h时为表达稳定。对表达蛋白进行定位分析确定表达蛋白主要以包涵体形式存在,部分存在于可溶细胞质中。 Western blot结果实证该表达产物可与His-tag抗体发生特异性结合,提示为目的融合蛋白。结论成功构建pET30a（＋）-ScFv-mms13表达载体并表达获得目的融合蛋白。     

经MHCⅡ通路的屋尘螨1类变应原T细胞表位融合肽疫苗载体的构建与表达

目的构建经MHCⅡ通路的屋尘螨1类变应原Der p 1的T细胞表位肽疫苗重组载体。方法分别合成TAT、IhC和含编码
Der p 1的3段T细胞表位的融合核苷酸序列,用特异性引物PCR扩增相应的基因片段,分别用相应的双酶切后,用T4 DNA连
接酶连接形成TAT-IhC-Der p 1-3T 融合基因,并插入至原核表达载体pET-28a(+ )中,构建重组原核表达载体pET-28a
(+)-TAT-IhC-Der p 1-3T,Bam HⅠ和XhoⅠ进行双酶切和测序鉴定。重组载体转化大肠杆菌E. coli BL21（DE3）菌株,IPTG诱导
后,经SDS-PAGE电泳分析和Western blot验证,纯化TAT-IhC-Der p 1-3T蛋白后进行IgE结合试验。结果双酶切和测序结果表
明,成功构建了pET-28a-TAT-IhC-Der p 1-3T重组原核表达载体;SDS-PAGE电泳分析显示TAT-IhC-Der p 1-3T可诱导表达;
Western blot 检测表明该融合蛋白纯化成功;IgE 结合试验表明TAT-IhC-Der p 1-3T结合屋尘螨过敏病人血清IgE 的能力强于
Der p 1变应原（P<0.001）。结论成功构建了可表达经MHC通路的编码Der p 1的3段T细胞表位的重组pET-28a-TAT-IhC-Der
p 1-3T载体,纯化的TAT-IhC-Der p 1-3T具有较强的IgE结合能力,从而为后续经MHC通路的特异性免疫治疗奠定基础。
     

表达人幽门螺杆菌外膜蛋白的穿梭质粒的构建及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的建立表达人幽门螺杆菌外膜蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗株，为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治幽门螺杆菌感染打下基础。方法利用聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）扩增的幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因全长片段，克隆入pET32a（＋），鉴定无误后，再亚克隆入大肠杆菌一分枝杆菌穿梭质粒pLA71，构建pLA71-omp载体，将pLA71-omp电转化耻垢分枝杆菌，经卡那霉素筛选后，抽提质粒用PCR法鉴定，Westernblot检测omp的表达及活性。结果从幽门螺杆菌基因组中扩增出约528bp的基因片段。所构建重组体阳性克隆经酶切和PCR鉴定与预期结果一致，测序结果确证了插入片段的正确性，Westernblot检测说明幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性。结论成功构建了幽门螺杆菌外膜蛋白528编码基因大肠杆菌一分枝杆菌穿梭表达质粒。该质粒能在E.coli／MS间进行穿梭，并在耻垢分枝杆菌中表达。     

重组结核分枝杆菌 MPT64的克隆与表达

目的：克隆和表达结核分枝杆菌抗原 MPT64,并分析其免疫活性。方法：以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板,PCR 扩增 mpt64基因,克隆至 T 载体 pMD18-T,转化入 E.coli DH5α,菌落 PCR 鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的 pMD18-T-mpt64的 mpt64基因亚克隆至表达载体 pET-28a,构建重组质粒 pET-28a-mpt64,转化 E.coli BL21中,PCR 和双酶切鉴定阳性重组子,IPTG 诱导 MPT64表达,亲和层析纯化,western-blot 分析其免疫活性。结果：成功构建 pET28a-mpt64重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约为26kDa 的 MPT64,并能被结核病人血清识别。结论：克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌 MPT64蛋白。