大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养与鉴定

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的体外培养方法及其生物学特性。方法:体外分离、培养大鼠BMSCs,进行细胞形态学观察、生长曲线测定、细胞表面标记物检测;并采用体外诱导分化方法对BMSCs多向分化潜能进行鉴定。结果:大鼠BMSCs传代后细胞生长状态相对稳定,呈梭形;流式细胞仪鉴定CD90阳性率为88.2%,CD29阳性率为98%,CD34阴性率为2.8%,CD45阴性率为2.7%。成骨诱导21 d后,茜素红染色后可在显微镜下观察到矿化结节形成。成脂诱导14 d,油红O染色后显微镜下可见红色脂滴形成。结论:BMSCs在体外培养中贴壁生长,增殖较快;表达骨髓组织来源干细胞的表面标记物CD29、CD90;诱导后能向成骨细胞、脂肪细胞分化。     

骨桥蛋白对鼠皮肤表皮干细胞的生物学影响

目的:分离、培养并鉴定SD大鼠表皮干细胞;观察骨桥蛋白重组因子(recombinant rat osteopontin,rrOPN)对表皮干细胞体外增殖作用及促IL-6和IL-1β炎性因子分泌作用的影响。方法:体外分离培养大鼠表皮干细胞,用倒置显微镜及电镜观察其形态,采用β1-整合素、CK15、CK19、CK5及CK10染色鉴定,并进行细胞生长曲线测定,流式细胞仪分析及细胞克隆形成率测定,以角质形成细胞作为对照。实验对不同浓度rrOPN处理的表皮干细胞采用MTT法测定细胞生长率,ELISA法测定IL-6、IL-1炎性因子分泌的变化。结果:倒置显微镜观察所得鼠表皮干细胞呈上皮样生长,电镜观察细胞胞核大,较多处于分裂象。免疫组织化学检测表皮干细胞β1-整合素、CK15、CK19、CK5及CK10染色均呈阳性。细胞周期分析表皮干细胞中48.9%的细胞处于DNA合成期,细胞克隆形成率为34.7%。5～50 ng/mL的rrOPN促进角质形成细胞生长,浓度为15 ng/mL的rrOPN促进细胞生长作用最显著(P<0.05)。rrOPN引起IL-6明显升高(P<0.05),IL-1β未见明显上调。结论:成功建立大鼠表皮干细胞分离、培养方法,rrOPN促进表皮干细胞增殖,并促其炎性因子分泌,影响创口愈合。     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

［摘要］ 目的 寻求一种安全高效的兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs )的体外分离培养和鉴定方法。方法 采集兔胫骨骨髓组织,采用全骨髓贴壁培养法体外分离培养和扩增BMSCs;倒置相差显微镜观察细胞,取生长良好的第5代细胞成骨,免疫细胞化学染色和流式细胞术检测细胞表面标志物。结果 原代和传代的 BMSCs 贴壁生长,呈漩涡状排列生长;诱导后碱性磷酸酶活性持续高,有钙结节形成并茜素红染色阳性;CD29、CD44、CD105分子呈阳性, CD45、C-kit、CD34分子呈阴性。结论 成功建立了兔BMSCs 体外分离纯化、培养的有效方法,扩增的 BMSCs 具有多向分化潜能,是理想的组织工程种子细胞。     

鼠颊黏膜干细胞的分离及鉴定

目的 探讨鼠颊黏膜干细胞的体外分离和培养方法,以获得稳定生长的黏膜干细胞.方法 DispaseⅡ酶和Trypsin-EDTA两步法分离昆明小鼠颊黏膜上皮细胞,接种于以小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞为滋养层的培养板中.达尔伯克氏必需基本培养基(Dulbecco's minimum essential medium,DMEM)培养24 h后换用角质细胞无血清培养基(keratinocyte serum-free medium,K-SFM)继续培养,部分细胞72 h后行成骨、成脂诱导和改良型Kaplow碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色鉴定;部分细胞继续培养5 d后,消化转移至Ⅳ型胶原预包被的培养板中,加入黏膜干细胞培养基培养,观察细胞克隆形成和成骨、成脂诱导、兔抗鼠角蛋白和ALP染色结果.结果 初次分离的上皮细胞群83.96%处于G0或G1期,培养72 h后可见克隆样生长细胞,成骨、成脂诱导和ALP染色均呈阳性;细胞在Ⅳ型胶原包被的培养板上快速贴壁,呈圆形或卵圆形,胞体小,折光性强,克隆样生长,兔抗鼠角蛋白、ALP染色和成骨、成脂诱导均呈阳性.结论 运用滋养层细胞培养法获得大量干细胞样上皮细胞后,Ⅳ型胶原黏附结合K-SFM与NIH3T3培养上清液混合培养法可实现鼠颊黏膜干细胞的初步纯化和快速培养.     

CD146在人牙髓干细胞中表达的研究

目的:研究CD146在人牙髓干细胞及其诱导分化过程中的表达情况。方法:体外培养人牙髓干细胞,免疫荧光及流式细胞术检测CD146的表达。矿化诱导人牙髓干细胞分化,检测牙本质唾蛋白的表达,从mRNA及蛋白水平检测诱导过程中CD146的表达。结果:免疫荧光及流式细胞术证明人牙髓干细胞中CD146表达阳性。使用矿化诱导液培养人牙髓干细胞,通过检测到牙本质唾蛋白的表达,证明细胞已向成牙本质细胞方向分化;在此诱导过程中,CD146在人牙髓干细胞中的表达逐渐下调。CD146在人牙髓干细胞中有较特异性的表达,有可能作为其特异性标志物。     

人乳牙牙周膜干细胞的生物学特性研究

目的:体外分离纯化人乳牙牙周膜组织来源的干细胞,研究其生物学特性、表面标记物及多向分化能力。方法:用酶消化法和有限稀释法对正常人乳牙牙周膜组织进行原代培养,并通过免疫细胞化学方法和流式细胞仪对其来源进行鉴定,进而从增殖能力、克隆形成能力和多向分化能力等方面对乳牙牙周膜干细胞的生物学特性进行研究。结果:分离培养获得的人乳牙牙周膜干细胞在形态上与恒牙牙周膜干细胞相似,均为长梭形成纤维细胞样;免疫细胞化学和流式细胞仪分子表型鉴定显示乳牙牙周膜干细胞阳性表达间充质来源的表面标志STRO-1,CD146,CD29和CD90,造血系来源的标志物CD34为阴性;细胞周期,MTT和克隆形成率的检测结果显示,人乳牙牙周膜干细胞的增殖能力强于恒牙牙周膜干细胞;人乳牙牙周膜干细胞在体外诱导条件下可以向骨,脂肪细胞方向分化;同时RT-PCR检测发现,矿化诱导后细胞成骨相关基因(ALP,OCN,Col I)的表达上调,成脂诱导后细胞成脂相关基因(PPAR-γ,C/EBPα)的表达上调。结论:人乳牙牙周膜中确实存在间充质来源的干细胞,并且具有较强的增殖能力和多向分化能力,为牙周组织工程种子细胞提供了新的可能来源。     

体外连续扩增对乳牙源牙髓干细胞生物学特性的影响

目的 :研究人脱落乳牙牙源髓干细胞(SHED)在体外长时期扩增,培养至20代后生物学特性的改变,探讨长时间扩增培养对SHED特性的影响。方法:从健康儿童脱落的乳牙中分离牙髓干细胞,在常规条件下扩增培养至第20代,比较第4代、第20代SHED,在细胞形态、增殖速率、多向分化、细胞凋亡等方面的差异。结果:与第4代相比,第20代细胞增殖速率减慢,成脂、成骨分化能力减弱,凋亡细胞增多,但仍能保持干细胞特有的免疫表型,高表达CD73、CD90、CD105,低表达CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR。结论 :随着体外扩增至20代,SHED虽能维持干细胞特有的免疫表型,但其生物学特性发生改变,已成为衰老细胞,不再适用于组织工程及干细胞治疗。     

兔下颌骨来源骨髓间充质干细胞的体外培养及鉴定

目的:探讨兔下颌骨来源的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)体外分离、培养并对下颌骨来源的BMMSCs进行鉴定.为骨组织工程提供种子细胞.方法:取兔下颌骨中的骨松质,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁培养,取P2或P3代BMMSCs进行检测.倒置显微镜下观察细胞形态;MTT法测定细胞增殖并绘制细胞生长曲线;克隆形成实验计算克隆形成率;向成骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞多向诱导分化;流式细胞仪检测细胞表面抗原标记.采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析.结果:细胞经传代后形态一致,呈梭形或三角形;细胞生长曲线显示,下颌骨BMMSCs经历潜伏期、对数生长期和平台期;克隆形成率为37％;成骨及成脂诱导形成钙结节及脂滴,茜素红及油红O染色呈阳性;成骨骼肌诱导desmin抗原标记阳性;流式细胞仪检测结果显示,所获得的下颌骨BMMSCs纯度较高.CD90和CD146表面标记阳性率分别为98.7％、98.1％.结论:从兔下颌骨分离的BMMSCs纯度较高,有强大的自我复制、增殖特性和体外多向诱导分化潜能,有望成为骨组织工程的种子细胞.     

人牙龈干细胞的分离鉴定及基质细胞衍生因子-1对其趋化效应的研究

目的 研究基质细胞衍生因子-1（SDF-1）受体CXCR4在人牙龈干细胞（GMSCs）上的表达及SDF-1对人GMSCs的趋化效应。方法 通过有限稀释法分离并培养人GMSCs,检测其表面干细胞标志物的表达情况,测试其克隆形成率及多向分化能力,利用免疫荧光染色法检测人GMSCs上SDF-1受体CXCR4的表达,用Transwell细胞培养室检测不同质量浓度SDF-1对人GMSCs的趋化反应,光镜下计数迁移至滤膜下侧面的不同视野的细胞数。结果 人GMSCs具有较高的自我更新能力,在体外呈克隆状生长,表达间充质干细胞表面标志物CD44、CD73、CD90、CD105和CD166,而造血干细胞表面标志物CD14、CD34和CD45的表达为阴性。体外诱导培养的人GMSCs能够向成骨细胞及成脂细胞分化,其克隆形成率为21.4%±2.8%。免疫荧光染色显示,人GMSCs表达SDF-1受体CXCR4。SDF-1的质量浓度为100、200 ng·mL^-1时,Transwell细胞培养室中迁移的细胞数目（每高倍视野分别为189.3±4.4和164.6±4.9）显著多于空白对照组（每高倍视野47.8±2.5）（P<0.01）;使用CXCR4中和抗体处理后,人GMSCs的迁移效应明显受到抑制（每高倍视野降低为29.0±2.4,P<0.01）。结论 人GMSCs表达趋化因子SDF-1受体CXCR4,SDF-1对人GMSCs有趋化效应,这种趋化效应可能是通过其特异性受体CXCR4介导的。     

人CD146＋牙周膜干细胞的分选及其干细胞特性的鉴定

目的：通过酶消化法及流式细胞分选技术分选CD146＋牙周膜干细胞（Periodontal ligament cells,PDLCs）,探讨其干细胞特性。方法：采用流式细胞技术从人牙周膜细胞中分选CD146＋PDLCs,并对其进行免疫组化染色（角蛋白、波形丝蛋白及Stro-1）,成骨、成脂诱导分化及克隆形成实验鉴定其干细胞特性。结果：CD146＋PDLCs表达波形丝蛋白及Stro-1,具有成骨及成脂分化能力,体外培养能形成细胞克隆。结论：以CD146为分选指标的流式细胞分选技术可作为牙周膜干细胞筛选的方法。     

人牙髓干细胞体外成骨向分化的实验研究

目的：探讨人牙髓干细胞在体外成骨向分化潜能。方法：用免疫磁珠法分选人牙髓干细胞并检测其干细胞表面标志物Stro-1、CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105的表达。体外诱导人牙髓干细胞向成骨细胞分化,通过碱性磷酸酶染色和茜素红染色观察成骨诱导后细胞的成骨活性和矿化结节形成情况,通过real-time PCR分析成骨相关基因ALP、col I、RunX2、OC的表达,未成骨诱导细胞作为对照。结果：人牙髓干细胞阳性表达间充质干细胞表面标志物Stro-1、CD29、CD44、CD90、CD105,阴性表达造血干细胞表面标志物CD34、CD45。成骨诱导5d、7d、14d ALP染色阳性,21d茜素红染色仅诱导组可见明显钙结节形成,对照组为阴性。成骨相关基因ALP、RunX2和Col I mRNA在成骨诱导早期高表达,OC mRNA在成骨诱导14d表达开始逐渐升高。结论：经磁珠分选纯化的人牙髓干细胞在成骨诱导条件下可向成骨细胞分化,形成钙盐沉积和矿化结节,ALP、col I、RunX2、OC参与了成骨向分化的过程。     

毛囊bulge区神经嵴细胞体外分离培养及生物学特点

目的探讨毛囊bulge区神经嵴细胞的体外生物学特点。方法采用体视显微解剖分离毛囊bulge区组织块,贴壁培养获取神经嵴细胞,通过形态学,结合Sox10,p75,nestin免疫细胞化学,观察神经嵴细胞的生物学特点。结果分离培养的小鼠毛囊神经嵴细胞,其形态类似成纤维细胞,免疫细胞化学检测细胞表型nestin,p75,Sox10均呈阳性表达。结论本研究成功从小鼠触须毛囊分离培养出神经嵴细胞,为进一步利用神经嵴细胞开展组织再生研究奠定了基础。     

小鼠毛囊来源间充质干细胞体外诱导成骨的实验研究

目的:探索便捷而有效的小鼠毛囊来源间充质干细胞的体外培养方法,并研究该群细胞的成骨能力,以探寻新的骨组织工程种子细胞。方法:采用酶消化法分离获得小鼠毛囊来源的干细胞,用不同培养体系进行传代培养,观察各细胞的增殖能力,并对所获得的毛囊来源的干细胞向成骨细胞诱导,行碱性磷酸酶染色、茜素红染色,对该细胞的成骨能力进行鉴定。结果:应用MEF条件培养液培养的小鼠毛囊来源的间充质干细胞具有较强的增殖能力,且诱导组和对照组能在体外被诱导成骨。结论:小鼠毛囊中存在具有较强增殖能力及成骨能力的间充质干细胞,可作为骨组织工程的种子细胞。     

SD大鼠损伤下颌下腺干/祖细胞免疫及流式细胞分析

目的：对损伤SD大鼠下颌下腺中分离获得的唾液腺干/祖细胞（Salivary Gland Progenitor cells--SGPs）进行分析。方法：在结扎主导管的SD大鼠下颌下腺损伤模型中分离、培养类上皮单克隆细胞,利用α6β1整合素（α6β1 integrin）、层粘蛋白（LN）、β1整合素（CD29）、角蛋白19（CK19）分别进行免疫荧光学鉴定;CD29,CD90.1,标记后流式细胞术分析。结果：SGPs的α6β1 integrin、LN、CD29、CK19抗体阳性。流式细胞分析α6β1 integrin,CD29,CD90.1表达率分别为（94.99±4.04）%、（97.41±3.15）%、（98.81±1.58）%,CD29/CD90.1双标后表达率为（97.15±3.43）%。结论：SD大鼠损伤下颌下腺中获得的单克隆细胞具有组织干细胞特征。     

人牙周炎症组织中干(祖)细胞的分离培养及初步鉴定

目的:体外分离纯化人牙周炎症组织来源的干(祖)细胞,研究其生物学特性、表面标记物及多向分化能力。方法:用组织块消化法对人牙周炎症组织进行原代培养,经有限稀释法纯化细胞并连续培养,测定其生长曲线和克隆形成率,用免疫荧光化学染色检测细胞表面波形丝蛋白、STRO-1和CD146的表达,并对其进行成骨和成脂诱导,观察其分化能力。结果:从人牙周炎症组织中可提取出干(祖)细胞,该细胞具有较高克隆形成能力,波形丝蛋白、STRO-1、CD146表达阳性,具有成骨、成脂多向分化能力。结论:人牙周炎症组织中存在干(祖)细胞,为牙周组织工程种子细胞提供了新的可能来源。     

小鼠颌骨间充质干细胞优化获取及鉴定

目的:摸索优化获取小鼠颌骨间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的方法。方法 :通过调整小鼠年龄、胶原酶浓度及酶消化时间等,采用骨片培养法从C57BL/6小鼠下颌骨中分离培养MSCs,并进行生物学鉴定。结果:采用3⁴周龄小鼠、0.3%胶原酶消化2 h的方法,分离培养出的细胞增殖能力最强,第3代MSCs即可高表达CD44、CD90及低表达CD34、CD45。各种条件所得MSCs均在成骨诱导后经茜素红染色、成软骨诱导后经甲苯胺蓝染色,结果呈阳性,其成骨、成软骨能力相同。结论:该改良后的骨片培养法可在较短时间内分离出较高纯度的小鼠颌骨间充质干细胞,适用于多种实验研究需要。     

Magnetic separation and characterization of keratinocyte stem cells from human gingiva

Calenic B, Ishkitiev N, Yaegaki K, Imai T, Kumazawa Y, Nasu M, Hirata T. Magnetic separation and characterization of keratinocyte stem cells from human gingiva. J Periodont Res 2010; 45: 703–708. © 2010 John Wiley & Sons A/S Background and Objective: Although keratinocyte stem cells play a key role in tissue homeostasis, wound healing and neoplasia, they remain difficult to identify and characterize. The purpose of this study was to isolate and characterize an oral keratinocyte stem‐cell population. Material and Methods: Oral human keratinocytes obtained from keratinized oral mucosa were magnetically separated using α₆β₄ integrin and a proliferation‐related marker, CD71. The isolated cell fractions were analyzed for cell size, cell cycle stage (using flow cytometry) and colony‐forming ability. The expression of stem cell markers p63 and cytokeratin 19 and of differentiation markers cytokeratin 10 and involucrin was checked using immunocytochemical analysis. Results: The stem cell CD71^neg fraction had the smallest cell size compared with CD71^pos and fractions [780.7 ± 141.5 (pixels), 1422.9 ± 264.6 (pixels) and 3844.4 ± 220.1 (pixels) respectively, p < 0.01; analysis of variance (ANOVA)]. Also, the CD71^neg subpopulation consistently had the highest colony‐forming ability among the three cell fractions (126.2 ± 21.7 vs. 32.8 ± 4.5 vs. 12.4 ± 2.1 compared with CD71^pos and subpopulations, respectively, p < 0.01; ANOVA). Moreover, the CD71^neg fraction contained more quiescent cells and fewer actively cycling cells than the CD71^pos cell fraction. The candidate stem cells were positive for cytokeratin 19 and p63 keratinocyte stem cell markers, while differentiation markers such as cytokeratin 10 or involucrin were absent. Conclusion: The human gingival CD71^neg cell fraction, separated by a magnetic system, demonstrated several characteristics of gingival keratinocyte stem cells. It is also suggested that a magnetic system may be an important tool in acquiring oral keratinocyte stem cells for research.