GST-人可溶性成纤维细胞生长因子受体1融合蛋白在酵母细胞中的表达及活性测定

目的：表达重组人可溶性成纤维细胞生长因子受体１（ｓｏｌｕｂｌｅ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１，ｓＦＧＦＲ１），研究其对成纤维细胞生长因子（ＦＧＦ）生物学活性的拮抗作用。方法：采用逆转录－ＰＣＲ（ＰＴ－ＰＣＲ）技术自人肺成纤维细胞获得ｓＦＧＦＲ１　ｃＤＮＡ，测序确证后，将其克隆人酵母细胞表达载体ｐＹＥＸ４Ｔ－１；重组质粒转化入酵母细胞（ＤＹ１５０）中进行诱导表达，表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及 Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ鉴定。利用 ＮＩＨ３Ｔ３细胞增殖抑制实验检测重组人 ｓＦＧＦＲ１的生物学活性。结果：经 ＣｕＳＯ４诱导，酵母细胞表达出重组谷胱苷肽转移酶（ＧＳＴ）－ｓＦＧＦＲ１融合蛋白，此蛋白在凝胶上表现为 １条约 ６０ｋＤ的阳性区带，在 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ实验中可被ＧＳＴ特异性抗体识别。重组ＧＳＴ－ｓＦＧＦＲ１融合蛋白的粗提物在体外能够桔抗ＦＧＦ介导的促ＮＩＨ３Ｔ３细胞增殖的活性。结论：重组ＧＳＴ－ｓＦＧＦＲ１融合蛋白在酵母表达系统中得到有效表达，并具有很好的生物活性。     

人内皮抑制素在酵母细胞中的表达及其促成纤维细胞有丝分裂 …

目的 利用酵母真核细胞表达系统表达出重组人内皮抑制素（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）,并对其促成纤维细胞有丝分裂活性进行研究。方法 采用逆转录－ＰＣＲ技术自人肝组织获得人内皮抑制素的ｃＤＮＡ,将其克隆人真核表达载体ｐＹＥＸ４Ｔ－１,构建含人Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ的重组质粒（ｐＹＥＸＥｎｄｏ）;经全自动序列分析仪测序确证后,将此重组质粒转化入酵母细胞（ＤＹ１５０）中进行诱导表达,表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析     

U937细胞表达成纤维细胞生长因子受体

以逆转录－ＤＮＡ聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）自Ｕ９３７细胞钓出了两条ｃＤＮＡ片段。将其克隆入ＴＡ克隆载体后进行ＤＮＡ测序。结果证明ｃＤＮＡ片段分别是人成纤维细胞生长因子受体１（ＦＧＦＲ１）的细胞外段和细胞内段ｃＤＮＡ。这一结果表明，Ｕ９３７细胞可以表达ＦＧＦＲ１ｍＲＮＡ。     

成纤维细胞生长因子10在前列腺增生组织中的表达

目的 检测前列腺增生组织中成纤维细胞生长因子10（FGF－10）的表达，探讨其在前列腺增生中的作用。方法 应用半定量R－TPCR技术和免疫组织化学方法，检测20例前列腺增生组织中FGF－10的表达，并与正常的前列腺组织进行比较。结果 前列腺增生组织中FGF－10 mRNA的水平高于正常前列腺组织，前列腺增生组织中FGF－10 mRNA的水平高于正常前列腺组织；前列腺组织中均见FGF－10阳性染色，前列腺增生组织中表达显著高于正常的前列腺组织。结论 前列腺增生组织中FGF－10的表达高于正常前列腺组织，提示FGF－10对促进前列腺的增生起重要作用。     

碱性成纤维细胞生长因子在膀胱移行细胞癌中的表达

目的　研究碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)在膀胱移行细胞癌 (BTCC)中的表达及其意义。方法　SP法 ,对 5 5例BTCC及 10例正常膀胱组织中bFGF进行检测。结果　在正常移行细胞呈阴性表达 ,在BTCC中呈不同程度的阳性表达 ,且过表达率在不同病理分级、临床分期组间有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,复发组的阳性表达率明显高于初发组 (P <0 .0 5 )。结论　bFGF在BTCC侵润转移过程中起重要作用 ,BFGF表达可成为判断肿瘤预后的一项指标     

重组人角质细胞生长因子在毕赤酵母中的表达、纯化及活性测定

目的:利用巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)重组表达人角质细胞生长因子(humankeratinocytegrowthfactor,hKGF),为实现规模化生产重组hKGF奠定基础。方法:根据已报道的hKGF成熟肽序列,人工合成由毕赤酵母偏好密码子组成的编码hKGF的DNA片段后连接到分泌型表达质粒pPICZαA中,获得重组表达质粒并转化毕赤酵母X-33中进行表达。优化发酵条件,并利用5L生物反应器进行中试发酵。发酵上清通过超滤及层析方法分离纯化重组蛋白,并利用MMT法检测其对恒河猴肺上皮细胞的促增殖活性。结果:在20℃,甲醇诱导60h后,获得分子量约为28kD的目的蛋白,表达量约占菌体上清总蛋白的14.1%。发酵液经肝素亲和层析和SephardexG-25分子筛分离获得纯度为95.0%以上的重组蛋白,得率为12mg/L。该重组hKGF具有糖基化修饰,能显著促进恒河猴肺上皮细胞增殖,其ED₅₀约为57μg/L。结论:利用毕赤酵母成功表达出糖基化修饰及具促恒河猴肺上皮细胞增殖活性的重组hKGF。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染对人牙周韧带细胞的作用

背景：主要来源于因正畸或阻生拔除的健康牙培养而成的人牙周韧带细胞已成为牙周组织工程理想的种子细胞来源之一。 目的：了解采用重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染对体外培养的人牙周韧带细胞增殖及细胞周期的影响。 方法：体外培养人牙周韧带细胞, 经重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染,分为3组：对照组、空载病毒组、碱性成纤维细胞生长因子转染组。用RT-PCR,Western blot检测人牙周韧带细胞在转染前后碱性成纤维细胞生长因子基因和蛋白的表达。应用细胞生长曲线、四甲基偶氮唑蓝比色法观察细胞生长的优化作用;采用流式细胞术测定细胞周期分布的变化。 结果与结论：对照组、空载病毒组未检测到碱性成纤维细胞生长因子mRNA和蛋白表达;碱性成纤维细胞生长因子转染组碱性成纤维细胞生长因子mRNA和蛋白水平均有表达,细胞的生长速度明显增快,细胞周期G₀/G₁期减少,S期细胞数增多。各组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。     

脊椎动物成纤维细胞生长因子及其受体

成纤维细胞生长因子(FGFs)具有广泛的生物学功能,已知FGF家族至少包括23个因子(FGFs1-23);成纤维细胞生长因子受体(FGFRs)家族有3类:酪氨酸激酶受体类、富胱氨酸FGF受体和低亲和力受体肝素硫酸糖蛋白。FGFs和FGFRs一起组成了一个大而复杂的信号分子家族,具有促细胞分裂、促细胞运动和促形态形成的作用,在胚胎、组织发育和成熟中发挥着重要作用。     

人内皮抑制素在酵母细胞中的表达及其促成纤维细胞有丝分裂活性

利用酵母真核细胞表达系统表达出重组人内皮抑制素 (Endostatin) ,并对其促成纤维细胞有丝分裂活性进行研究。方法 :采用逆转录 PCR技术自人肝组织获得人内皮抑制素的cDNA ,将其克隆入真核表达载体pYEX4T 1,构建含人Endostatin的重组质粒 (pYEXEndo) ;经全自动序列分析仪测序确证后 ,将此重组质粒转化入酵母细胞 (DY15 0 )中进行诱导表达 ,表达产物经SDS PAGE分析及Westernblot鉴定。以MTT掺入法初步检测了重组人内皮抑制素对NIH3T3细胞的促有丝分裂活性。结果 :经CuSO4诱导的含pYEXEndo的酵母细胞表达出重组人GST Endostatin的融合蛋白 ,此蛋白在凝胶上表现为一约 45kD的阳性区带 ,在Westernblot实验中可被GST特异性多克隆抗体识别。重组人GST Endostatin融合蛋白的粗提物在体外能刺激NIH3T3细胞增殖。结论 :人GST Endostatin的融合蛋白在酵母表达系统中高水平表达 ,并具有刺激成纤维细胞生长的生物学活性。     

成纤维细胞生长因子与周围神经再生

周围神经再生的研究是一个国际热点。成纤维细胞生长因子促进周围神经再生的研究，是对于神经损伤治疗领域的新探索和拓宽。本文就成纤维细胞生长因子对周围神经再生作用的研究进行综述。     

鼠成纤维细胞因子8的克隆和表达

目的 :克隆和表达鼠成纤维细胞因子 8(FGF 8) ,以便进一步研究FGF 8的功能。方法 :根据已发表的鼠成纤维细胞因子 8的cDNA序列 ,从鼠胚胎中提取总RNA ,采用RT PCR技术 ,用设计合成的引物钓取cDNA片段。将该cDNA片段定向插入酵母表达载体pYEX4T 1中 ,做DNA序列分析。用此重组质粒转化酿酒酵母 ,经Western印迹分析表达产物。用MTT和3H TdR掺入法检测重组蛋白活性。结果 :经序列分析证明 ,所钓取到的 6 0 0bp的cDNA片段确实是FGF 8的“b”选择性剪接型(FGF 8b)。Western印迹分析表明 ,该基因获得了较高效的表达 ,分子量约 5 5kD。实验组成纤维细胞株NIH3T3的MTT和3H TdR掺入量明显增多 ,拮抗组的掺入量有所下降。结论 :获得了有活性的重组鼠FGF 8蛋白 ,该蛋白能刺激NIH3T3生长 ,并且这种活性能被重组人FGFR 1的细胞外段所拮抗     

人重组FGFR1在昆虫细胞膜上的表达

目的：将人重组成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）表达在昆明细胞膜表面,有作筛选成纤维细胞生长因子（FGFs）损抗肽抗针。方法：将人FGFR1 cDNA克隆入昆虫病毒的转递质粒pFastBac Ⅰ上,然后转座到昆虫病毒Bacmid上。以重组Bacmid转染昆虫细胞Sf9并表达人FGFR1,以Western印迹和ELISA对表达出的蛋白质进行鉴定。结果：FGFR1 cDNA片段2100bp,重组FGFR1表达产物分子量78kD。ELISA结果显示,人重组FGFR1高效地在昆虫细胞Sf9膜表达。结论：这个表达系统能很好地表达出人重组FGFR1,并能准确地将其定位到昆虫细胞膜的表面。     

以Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统表达人FGF-9

目的：在Ｂａｃｍｉｄ杆状病毒昆虫细胞系统中表达人ＦＧＦ９ 。方法：采用ＲＴＰＣＲ技术,自新鲜人脑胶质瘤组织获取人ＦＧＦ９ 全编码区ｃＤＮＡ,将其克隆入ｐＣＲＴＭ Ⅱ质粒及ｐＹＥＸ４Ｔ１ 真核表达质粒,经ＤＮＡ自动测序仪进行ＤＮＡ序列测定。将人ＦＧＦ９ ｃＤＮＡ 定向克隆入ｐＦａｓｔＢａｃ 质粒,进一步将其转座入Ｂａｃｍｉｄ 中,在昆虫细胞Ｓｆ９ 中进行表达,采用ＳＤＳＰＡＧＥ对表达产物进行分析。结果：在昆虫细胞表达系统中表达出人ＦＧＦ９ 重组蛋白。结论：人ＦＧＦ９ 在Ｂａｃｍｉｄ杆状病毒昆虫细胞系统中得到了表达。     

野生型和突变型人白介素13哺乳细胞表达质粒的构建

目的:构建野生型及突变型人IL-13(hIL-13)哺乳细胞表达质粒。方法:采用融合PCR扩增人生长激素(hGH)-hIL13融合蛋白编码序列。PCR产物和pcDNA3.1表达载体经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切处理后,将PCR产物定向插入pcDNA3.1真核表达载体中,构建质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g。将其转化到DH5α感受态细胞内进行扩增,阳性克隆鉴定,质粒抽提,进行测序验证。结果:重组质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g经测序验证,hGH-hIL13融合蛋白编码序列与实验设计一致,且已与pcDNA3.1(+)真核表达载体正确重组。结论:成功构建了哺乳细胞表达质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g,为后续野生型及突变型hIL-13哺乳细胞的重组表达奠定了基础。     

Effect of fibroblast growth factor saporin mitotoxins on human bladder cell lines

Mitotoxins targeted via high-affinity growth factor receptors on the cell surface are a potential means of anticancer therapy. We have evaluated the effect of a chemically conjugated (FGF2-SAP) and a fusion protein (rFGF2-SAP) mitotoxin containing FGF-2 and saporin on normal (FHs 738B1) and malignant bladder cell lines (HT1197, TCCSUP, EJ-6, and RT4). The FGF-saporins demonstrated potent cytotoxicity in malignant bladder cell lines with an ID range of 0.13-13.6nM, whereas cells derived from normal fetal bladder (FHs 738B1) were less sensitive to FGF2-saporins (ID₅₀>100nM). Greater than a 100-fold difference in cytotoxicity between FGF-saporins and unconjugated saporin was observed. Assessment of cellular FGF-2 content and secretion showed that FHs 738B1 and TCCSUP contained and secreted significantly more FGF-2 compared to other cell lines tested. 125I-FGF-2 receptor binding studies showed the presence of high-affinity (pM) FGF receptors on all bladder cell lines. Cross-linking studies revealed the presence of a major receptor-ligand complex of 90kDa on FHs 738B1 and 160-170kDa on the other bladder cell lines. All cell lines studied, except RT4, expressed solely FGFR-1. These studies demonstrate that FGF2-saporins have antiproliferative activity on human bladder cancer cell lines. However, the number of high-affinity FGF receptors, and FGF-2 cellular content and secretion are not absolute determinants of cellular sensitivity to FGF2-saporins.     

反义Ku70在人肺癌细胞的表达及对放射线的敏感性研究

目的：研究反义Ku70在人肺癌细胞的表达及对放射线的超敏效应。方法：采用Western-boltting法证明,Ku70－LCA中Ku70蛋白的表达情况,采用体外放线敏感实验症明,反义Ku70在人肺癌细胞的表达及对放射线的超敏效就,其结果以细胞存活克隆率和剂量效应曲线表示,结果：（1）对照组和人正义Ku70基因的LCA组细胞可见Ku70蛋白表达印迹,导入反义Ku70基因LCA组细胞未见Ku70蛋白表达印迹,（2）导入反义Ku70基因的LCA组细胞对放线的敏感性明显增强（P＜0．01）,并呈剂量依赖性,结论：反义Ku70封闭了肿瘤细胞的正义Ku70蛋白表达后,对放坶呈超敏感效应,为提高肿瘤放疗的特异性的靶向基因治疗奠定了基础。     

成纤维细胞生长因子21与代谢综合征的相关性研究

目的本研究通过对352名参与者进行5年的随访,探讨成纤维细胞生长因子（FGF-21）与代谢综合征（MS）发生发展的关系。方法记录参与者一般临床资料,采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定基线及随访5年后参与者血清FGF-21浓度水平,对比分析MS组与非MS组间FGF21浓度水平的差异,并采用多因素Logistic回归分析FGF21是否为MS的独立危险因素。结果 MS组参与者基线FGF21浓度水平明显高于非MS组,差异有统计学意义（P〈0.05）;MS组参与者随访5年后FGF21浓度水平明显高于基线FGF21浓度水平,差异有统计学意义（P〈0.05）,非MS组参与者随访5年后血清FGF21浓度水平与基线FGF21浓度水平差异无统计学意义（P〉0.05）;多因素Logistic回归分析发现,腰围、BMI、TG、HOMA-IR、FGF21是影响MS发生的独立危险因素。结论血清FGF-21浓度水平高是MS发生的独立危险因素,未来有可能成为干预MS有效的分子靶点。     

bFGF在人胚胎干细胞中自我更新的研究进展

人胚胎干细胞具有自我更新和多向分化的独特生物学特性。维持人和小鼠胚胎干细胞增殖的生长因子不同,白血病抑制因子（LIF）不能维持人胚胎干细胞的生长。目前已经确定了数种维持人胚胎干细胞（hESCs）自我更新的生长因子,其中碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）信号系统是人胚胎干细胞自我更新中最重要的调节因素之一。将从bFGF及其受体在人胚胎干细胞中的表达和作用的最新进展进行综述。     

人FGF12融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的：在原核表达系统中获得高效表达的人成纤维生长因子12融合蛋白。方法：采用逆转录PCR方法获得hFGF12 cDNA，将其连接到pET 28a原核表达载体，转化入BL21(DE3)菌中表达，经金属螯合亲和层析法和肝素亲和层析法纯化，以刺激NIH 3T3成纤维细胞增殖实验；测定纯化的hFGFl2融合蛋白活性。结果：表达产物经SDS-PAGE电泳，在Mr31000附近新增一条明显区带，与预期的相对分子质量相符。重组融合蛋白能刺激NIH3T3细胞增殖。结论：在大肠杆菌中表达了具有促有丝分裂活性的融合蛋白。