同种异体脱钙骨基质的组织工程学特性

摘要 背景：由骨衍生的支架材料无论形态学和力学特征,具有合成材料无可比拟的优势,脱钙骨基质具有和自体骨最接近的三维结构,同时以Ⅰ型胶原为主,胶原是细胞黏附和生长的良好支架。 目的：从组织工程学角度研究同种异体脱钙骨基质的生物学特性,探讨其作为软骨组织工程支架材料的可行性。 方法：据Urist描述的方法制备青紫蓝兔同种异体脱钙骨基质,扫描电镜观察脱钙骨基质的超微结构,测定其孔径、孔隙率和降解率,测定同种异体脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞的黏附率,兔体内植入法评价同种异体脱钙骨基质的组织相容性。 结果与结论：脱钙骨基质呈多孔海绵状三维结构,孔径在210~320 μm之间,孔隙率为92%,体外降解12周降解率达90%以上,脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞共培养第2,4,6天的黏附率分别为(51.50±2.30)%,(94.13±2.14)%和(87.24± 1.75)%。兔体内植入6周后脱钙骨基质周围界面未引起明显的炎症和排斥反应,并形成软骨样结构和少量骨组织。说明脱钙骨基质具有适宜的三维多孔结构,降解时间和软骨形成时间同步,同种异体脱钙骨基质与种子细胞黏附率高,与细胞组织相容性好,能满足软骨组织工程对支架材料的要求,是理想的软骨组织工程的支架材料。     

骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养种子细胞特征及体内成软骨活性

目的：组织工程技术为解决关节软骨缺损修复这一难题提供了新的思路，但至今尚无一种细胞能完全满足软骨组织工程对种子细胞的要求。探讨以自体骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养为种子细胞修复关节软骨缺损的可行性，并评价修复效果。 方法：实验于2005-03/2006-02在兰州大学骨科研究所组织工程实验室和连云港市东方医院骨科实验室完成。①取浓度为3×108 L-1的第2代骨髓间充质干细胞和软骨细胞，按2:1比例混匀共培养作为种子细胞，观察细胞的增殖和基质合成，绘制细胞生长曲线。②将细胞终浓度为3×108 L-1的共培养细胞加入含有同种异体脱钙骨基质的24孔培养板中进行接种培养2，4，6 d，计算共培养细胞与脱钙骨基质的黏附率。③取54只青紫兰兔制备全层关节软骨缺损模型，随机分为实验组、脱钙骨基质对照组、空白对照组，每组18只。实验组于软骨缺损处植入同种异体脱钙骨基质与共培养细胞；脱钙骨基质对照组植入脱钙骨基质；空白对照组不作任何植入。移植术后6，12周取出膝关节对修复组织进行大体、组织学评分和免疫组织化学观测。 结果：54只青紫兰兔均进入结果分析。①共培养的软骨细胞基质合成丰富，细胞增殖加快。脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养第2，4，6天的黏附率分别为（46.50±1.40）%，（93.25±2.89）%和（88.34±0.76）%。②大体观察结果：实验组缺损修复组织呈软骨样，表面光滑平坦，与周围软骨整合的软骨细胞更为成熟，修复组织与软骨下骨结合牢固。脱钙骨基质对照组、空白对照组的修复组织呈纤维组织和无修复。③组织学评分：实验组优于脱钙骨基质对照组、空白对照组，差异具有显著性意义（P﹤0.01），脱钙骨基质对照组与空白对照组比较差异无显著性意义（P﹥0.05）。④免疫组织化学染色显示实验组修复组织的细胞为透明软骨样细胞，柱状排列，Ⅱ型胶原染色阳性，与周围软骨及软骨下骨整合良好。 结论：自体骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养作为种子细胞，骨髓间充质干细胞能增强软骨细胞的增殖，促进软骨细胞基质合成，缩短软骨细胞培养时间和减少传代次数，可节省大量的软骨细胞，与脱钙骨基质复合后能有效修复关节软骨缺损。     

低强度脉冲式超声对兔脱细胞脱钙骨基质负载关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞复合体的影响*★

背景：有关低强度脉冲式超声波促进关节软骨损伤修复的研究较多，可供选择的细胞支架亦较多，但是有关低强度脉冲式超声波的应用条件及构建出理想的组织工程软骨细胞支架尚未达到共识。 目的：构建新西兰兔同种异体脱细胞脱钙骨基质负载关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞的复合体，给予一定条件的低强度脉冲式超声波刺激，以探讨脱细胞脱钙骨基质作为组织工程软骨支架的可行性和低强度脉冲式超声波刺激对关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞的促进作用。 设计、时间及地点：多个样本观察，实验于2009-05/08在解放军第二军医大学生物医学工程研究所完成。 材料：应用新型改良Urist法制备兔脱细胞脱钙骨基质。采用机械粉碎结合酶消化法获取兔关节软骨细胞；采用全骨髓漂洗法分离出骨髓间充质干细胞并加以纯化，进行体外单层培养扩增。 方法：按与脱细胞脱钙骨基质复合的细胞成分不同及是否应用低强度脉冲式超声波刺激不同分为4组：软骨细胞组、骨髓间充质干细胞组、复合细胞组：脱细胞脱钙骨基质分别与软骨细胞、骨髓间充质干细胞、软骨细胞/骨髓间充质干细胞复合，未进行低强度脉冲式超声波刺激。超声组：将脱细胞脱钙骨基质与软骨细胞/骨髓间充质干细胞复合，第2天进行低强度脉冲式超声波刺激，刺激频率1.0 MHz、瞬时空间强度10 mW/cm2，20 min/d。 主要观察指标：①平面培养第2代关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞行免疫组织化学检测。②新型改良Urist法制备的脱细胞脱钙骨基质行苏木精-伊红染色。③于细胞-支架复合第21天行Ⅱ型胶原的免疫组织化学检测。 结果：①平面培养第2代关节软骨细胞行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，可见细胞形态为多角形、星形、圆形，有伪足伸出，胞质内容丰富，胞浆明显呈棕黄色，胞核为圆形。②平面培养第2代骨髓间充质干细胞的CD34免疫组织化学染色呈阴性，CD44及CD105免疫组织化学染色呈阳性。③新型改良Urist法制备的兔脱细胞脱钙骨基质内未见明显的细胞样结构，空隙大小均匀。④复合第21天后，骨髓间充质干细胞组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阴性，软骨细胞组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色弱阳性，复合细胞组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性，超声组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈强阳性。 结论：①第1~3代关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞与原代细胞的生物学性能相似。②在脱细胞脱钙骨基质内，软骨细胞和骨髓间充质干细胞可以保持较高的增殖能力。③10 mW/cm2的低强度脉冲式超声波不影响骨髓间充质干细胞活性，并且能够加速其向关节软骨细胞分化，但未发现有明显促进细胞增殖的作用。 关键词：组织工程；软骨细胞；骨髓间充质干细胞；脱细胞脱钙骨基质；低强度脉冲式超声波 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2009.47.002     

脱钙松质骨的骨支架材料制备及其生物学检测

摘要 背景：脱钙松质骨的主要成分是胶原,由于其良好的三维空间及促进细胞增殖分化的生长因子,使其具有传导成骨和诱导成骨的双重功能,但是目前没有修订出一个规范科学的制备流程。 目的：采用新方法制备兔脱钙松质骨,并检测其孔隙率、降解率及其生物相容性,对其能否作为组织工程的支架材料进行评估。 方法：在Urist方法的基础上采用新方法制备新西兰兔脱钙松质骨,并对脱钙松质骨的空隙率、体外降解率、以及细胞活力和诱导骨髓间充质干细胞成骨能力进行检测。实验分为脱钙3 h,脱钙24 h和脱钙48 h组,其他的处理步骤3组都相同。 结果与结论：脱钙3,24,48 h组的孔隙率分别为76.56%,81.25%,84.38%。完全降解所需时间分别为64,59,53 d。细胞在种植后1~3 d为生长滞留期,第5天达到对数生长期,以后进入到平台期。诱导后的骨髓间充质干细胞行碱性磷酸酶染色呈阳性。结果提示,新方法制备的脱钙松质骨对细胞无毒害作用,在生物学特性上达到骨组织工程支架材料的要求。 关键词：脱钙松质骨;孔隙率;降解率;生物学检测;骨组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.007     

不同接种密度骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体修复大鼠桡骨缺损

背景：在构建种子细胞与载体材料的复合体时,种子细胞的接种密度是影响复合体成骨能力的一个重要因素,目前关于种子细胞的接种密度认识尚不统一。 目的：构建骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体,观察构建复合体骨髓间充质干细胞的最适接种密度。 方法：体外单层培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,以不同的细胞密度将骨髓间充质干细胞接种到异种骨基质明胶上,构建骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体,通过扫描电子显微镜观察细胞在骨基质明胶中的黏附生长情况。制备SD大鼠双侧桡骨骨干5 mm节段性骨缺损模型。随机分成4组,采用骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体修复骨缺损,所用的接种细胞密度分别为1×108 L-1、5×108 L-1、1×109 L-1、5×109 L-1。各组于第2,4,8,12周取材,通过大体观察大鼠的术肢活动情况,X射线放射学、组织学,免疫组织化学等检测方法,对骨缺损的修复情况进行评价。 结果与结论：4种细胞密度与骨基质明胶复合培养24 h,骨髓间充质干细胞在骨基质明胶上的黏附率随着细胞接种密度的增高而增高,当密度为1×109 L-1时,黏附率最高为(76.00±2.94)%,继续增加细胞密度其黏附率反呈下降趋势。复合培养7 d,扫描电子显微镜观察结果显示,材料上均有细胞黏附生长。X射线放射学评分显示,同一组别8,12周评分均高于2周评分(P < 0.01);第4,8,12周1×109 L-1组与5×109 L-1组差异无显著性意义 (P > 0.05),均高于其余两组(P < 0.01)。组织学评分结果表明,同一组别8,12周评分均高于2周评分 (P < 0.01)。结果提示,在构建骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体时,骨髓间充质干细胞接种密度维持在1×109 L-1最佳。     

骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质组合生长因子诱导向软骨细胞分化*

背景：用组织工程学方法高质量修复关节软骨缺损并达到很好的远期疗效目前尚无定论。鉴于此,课题组提出“同种异体骨髓间充质干细胞关节腔内定向培养组织工程软骨”的实验设技。 目的：同种异体脱钙骨基质组合转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的能力,同时探索其在关节腔内培养促进向关节软骨定向分化的方法。 方法：分离兔骨髓间充质干细胞并行体外培养,分为两组：实验组DMEM培养液中加入转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ,对照组中未加入诱导因子。比较两组细胞的增殖情况和成软骨分化情况。制备同种异体脱钙骨基质支架材料,实验组骨髓间充质干细胞负载到同种异体脱钙骨基质中,构建组织工程软骨复合体,取另2只兔的腰背筋膜包裹后缝合固定到30只兔膝关节腔内行腔内培养。分别于植入后4,8,12周各取10只标本进行组织学切片观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学观测,并对结果进行分析。 结果与结论：实验组中骨髓间充质干细胞集落形成效率明显高于对照组(u=3.326,P < 0.01)。实验组细胞爬片做Ⅱ型胶原免疫组化检测呈阳性,对照组未见阳性细胞。组织工程复合体在腔内培养12周后,苏木精-伊红染色见大量软骨细胞增生,胞核染色呈蓝色;甲苯胺蓝染色见软骨细胞成串排列,大量软骨陷窝形成,周围大量基质包绕;Ⅱ型胶原免疫组织化学反应见细胞外基质中出现大量棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色强阳性。提示转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ可显著促进骨髓间充质干细胞增殖和成软骨分化,骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质结合后可在关节腔内成功培养出组织工程软骨。同种异体脱钙骨基质符合组织工程软骨支架材料的基本要求。     

纳米β-磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原层状支架复合骨髓间充质干细胞修复膝关节骨软骨缺损

摘要 背景：关节软骨损伤修复面临的难题主要表现在再生软骨的结构及生理功能距正常软骨相差较远，无法满足正常生理需要，目前修复方法很多，但效果均不理想。 目的：探讨纳米β-磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原层状支架-骨髓间充质干细胞复合物修复犬膝关节骨软骨缺损的可行性。 方法：12月龄杂种犬10只，随机分为实验组、缺损对照组，无菌条件下自髂后嵴处抽取骨髓分离培养骨髓间充质干细胞，传至第3代消化、收集，调整细胞浓度为2×109 L-1，与纳米β-磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原共培养24 h，即制成纳米β-磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原层状支架-骨髓间充质干细胞复合物。两组犬均制备右膝关节骨软骨缺损，实验组于缺损处植入支架-细胞复合物，缺损对照组不做任何处理。 结果与结论：第12周，实验组缺损内充填以白色半透明组织，表面光滑，触之较软，稍高出周围软骨面，软骨细胞分布较均一，排列无方向性；第24周，实验组缺损内充填白色半透明新生软骨组织，色泽与正常软骨相似，质韧，表面平整，与正常软骨界限消失，表面细胞平行于关节面，深层细胞排列紊乱，细胞呈团状，基质异染广泛，与周围正常软骨连接良好。缺损对照组缺损未修复，底部为白色纤维组织。提示骨髓间充质干细胞是修复关节软骨缺损较理想的种子细胞，在新生软骨形成的同时，纳米β-磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原层状支架逐渐降解吸收，是组织工程修复关节软骨缺损适宜的支架材料。 关键词：纳米；β-磷酸三钙；Ⅰ型胶原；Ⅱ型胶原；骨髓间充质干细胞；软骨细胞；组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.42.003     

牛脱细胞骨基质的生物力学特性及其黏附性

背景：脱细胞骨基质作为一种天然骨生物衍生材料，应用于骨组织工程支架有着其独特的优越性。 目的：观察牛松质骨脱细胞后骨基质的生物力学特性、孔隙率及其黏附特性，探讨其作为组织工程骨天然支架材料的可行性。 设计、时间及地点：力学实验采用随机对照观察，于2008-02/06在天津医科大学总医院骨科实验室完成。 材料：新鲜牛股骨来自16月龄雄性蒙古牛，体质量350 kg；新生24 h内SD大鼠3只。 方法：利用100 g/L NaCl联合1%TritonX-100的方法制备脱细胞骨基质。脱细胞骨基质脱钙切片。利用ElectroForce3200力学试验仪对标本进行压力加载测试。利用新生SD大鼠颅骨传代培养第3代成骨细胞与脱细胞骨基质复合培养12 h。空白对照组置于9 g/LNaCl溶液。 主要观察指标：①苏木精-伊红染色观察骨基质平均空隙直径及空隙率。②观察骨基质弹性强度、破坏载荷、弹性模量。③采用细胞计数法计算两者的黏附率。 结果：①利用100 g/L NaCl与 1%TritonX-100联合可达到良好脱细胞效果，与对照组比较，脱细胞后实验组骨小梁无明显破坏。②所测得牛脱细胞骨细胞外基质空隙直径为（376.33±80.91）μm,空隙率为（70.15±2.98）%。③力学测试此脱细胞方法对骨基质力学特性无显著影响。④脱细胞骨基质与体外培养成骨细胞具有良好的黏附性能，黏附率为62.38%。 结论：牛松质骨脱细胞骨基质较完整的去除了细胞的免疫原性，具有良好的骨组织工程支架材料力学性质，接近生理结构的空隙直径及孔隙率，黏附性能满足支架材料的要求。     

兔软骨基质支架与脂肪干细胞的生物相容性

背景：软骨基质主要为Ⅱ型胶原和葡萄糖胺聚糖，它是软骨细胞分化和发育的先天环境，能促进干细胞向软骨细胞分化。 目的：观察兔软骨基质支架与同种异体脂肪干细胞在体外的生物相容性。 设计、时间及地点：观察实验，于2007-12/2008-05在遵义医学院珠海校区中心实验室完成。 材料：取兔新鲜耳郭软骨组织在蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟的保护下利用低渗透压和Triton X-100脱去细胞成分制备软骨基质。脂肪干细胞由新西兰大白兔颈部脂肪组织经剪碎、Ⅰ型胶原酶消化并离心后获得。 方法：将2×l07 L-1的脂肪干细胞悬液0.2 mL滴在软骨基质支架表面，置于37 ℃、体积分数为0.05 CO2饱和湿度的培养箱中静置4 h后加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液培养。 主要观察指标：采用倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞在支架上的黏附、生长及增殖情况，同时计算细胞黏附率，并采用二甲氧唑黄比色法检测细胞增殖趋势。 结果：扫描电镜和倒置显微镜观察到脂肪干细胞在软骨基质支架上黏附和变形，其黏附率为93.7%；苏木精-伊红染色见细胞向支架深层生长；二甲氧唑黄比色法测定细胞生长曲线表明细胞在支架上有增殖的趋势。 结论：兔软骨脱细胞基质与同种异体脂肪干细胞在体外具有良好的生物相容性。     

磷酸三钙多孔生物陶瓷复合自体骨髓间充质干细胞修复股骨头坏死模型的超微结构观察

背景：股骨头坏死病灶清除后的骨缺损难以修复,磷酸三钙多孔生物陶瓷与兔骨髓间充质干细胞的复合培养体内成骨的超微结构仍不明确。 目的：通过观察磷酸三钙多孔生物陶瓷与兔骨髓间充质干细胞复合培养体内成骨的超微结构,了解其在股骨头缺损修复中的成骨效应,验证磷酸三钙多孔生物陶瓷作为组织工程载体材料的可行性。 设计、时间及地点：随机对照开放性动物体内实验,于2008-02/08在中日友好医院骨坏死与骨循环实验室完成。 材料：体外培养兔骨髓间充质干细胞,并与β-磷酸三钙多孔陶瓷材料复合共同培养2周。 方法：新西兰大白兔30只,随机分为3组,制作股骨头坏死缺损模型后,空白对照不作填充,磷酸三钙组填充磷酸三钙多孔生物陶瓷,磷酸三钙+骨髓间充质干细胞组填充磷酸三钙多孔生物陶瓷和骨髓间充质干细胞的复合物。 主要观察指标：通过环境扫描电镜观察骨髓间充质干细胞与材料的复合情况;回植体内6,12周后,取材,通过电镜观察磷酸三钙多孔生物陶瓷和骨髓间充质干细胞体内成骨的超微结构,了解材料降解及骨组织的替代过程。 结果：磷酸三钙多孔生物陶瓷与骨髓间充质干细胞复合培养良好。空白对照组缺损区6,12周均见纤维组织结构,无骨小梁结构;磷酸三钙组6周材料和骨基质交界不清,材料开始降解,12周材料与周围组织边界模糊,材料部分降解,多孔框架结构不清;磷酸三钙+骨髓间充质干细胞组6周新生骨从宿主骨长出,12周可见成熟骨组织的连续平行纤维结构网络,材料降解,表面有较多的成骨细胞。后2组在股骨头缺损修复成骨方面优于空白对照组,磷酸三钙+骨髓间充质干细胞组成骨更佳。 结论：磷酸三钙多孔生物陶瓷是良好的组织工程支架材料,易与骨髓间充质干细胞复合,可用于股骨头坏死骨缺损的修复。     

生物衍生骨材料与骨髓间充质干细胞体外的生物相容性

背景：生物衍生骨材料已在临床应用多年，但其作为组织工程骨支架材料的可行性还需验证。 目的：评价异种生物衍生骨材料与骨髓间充质干细胞的生物相容性。 设计、时间及地点：单一样本体外观察性实验，于2007-08/2008-01在中国辐射防护研究院医用组织库组织工程实验室完成。 材料：山西省医用组织库生产的人松质骨；体外分离培养1周龄新西兰兔骨髓间充质干细胞。 方法：经脱脂、脱钙、去抗原等步骤制备生物衍生骨材料，扫描电镜观察其表面超微结构。直接贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞，MTT法和流式细胞仪检测生物衍生骨材料对骨髓间充质干细胞增殖及凋亡的影响。PKH26标记骨髓间充质干细胞与生物衍生骨材料复合培养，荧光显微镜动态观察细胞在骨材料上的生长情况；扫描电镜观察细胞在骨材料上的贴附、生长情况。 主要观察指标：①生物衍生骨材料的形态结构及骨髓间充质干细胞在其上的生长、增殖情况。②生物衍生骨材料的细胞毒性。 结果：所制备的生物衍生骨材料呈白色，扫描电镜观察呈规则的疏松多孔结构，孔隙间有微孔相互连通。其对骨髓间充质干细胞的增殖和凋亡无明显的影响；荧光显微镜下观察，在材料表面及孔隙内可见PKH26标记的细胞，显示红色荧光；扫描电镜观察可见细胞在材料上附着生长，细胞形态呈梭型或多角形，与材料贴附紧密。 结论：实验制备的异种生物衍生骨材料细胞毒性低，与骨髓间充质干细胞具有良好的生物相容性。     

兔骨髓间充质干细胞/壳聚糖-胶原支架复合体构建软骨组织工程支架*

背景：软骨组织工程的核心是利用少量的细胞经体外培养、扩增后,在一定环境下附着在三维多孔支架上,再将细胞/支架复合体移植到体内形成新的组织。 目的：拟构建兔骨髓间充质干细胞/壳聚糖-胶原支架复合体,探讨该支架作为软骨组织工程支架的可行性。 设计、时间及地点：细胞-支架学体外观察,于2008-03/2009-02在武警医学院生物化学教研室完成。 材料：日本大耳白兔6只用于分离培养骨髓间充质干细胞。医用壳聚糖粉末为山东奥康生物科技有限公司产品。Ⅰ型胶原为Sigma公司产品。 方法：取3%的壳聚糖和2%的胶原混合的醋酸溶液,倒入72孔板内,-20 ℃预冷冻10 h,冻干机冷冻抽干24 h制作成壳聚糖-胶原支架。取第3代兔骨髓间充质干细胞,以1×109 L-1密度接种于支架内,构建细胞/支架复合体。 主要观察指标：傅里叶红外光谱、扫描电镜、液体置换法测定支架的理化性质,观察三维培养后细胞在支架上的生长情况。 结果：壳聚糖-胶原支架孔径为160~380 μm,平均为270 μm,孔相通性好,支架孔隙率为(86.00±5.12)%。傅里叶红外光谱仪测定数据表明复合支架组成物有典型的壳聚糖、胶原峰,未发现有聚乙二醇峰。细胞/支架共培养24,48,72 h后,骨髓间充质干细胞可渗入支架多孔结构内,并黏附在支架上成簇生长,部分细胞已与支架融合。 结论：壳聚糖-胶原支架基本符合软骨组织工程支架要求,能够作为种子细胞的承载体。 关键词：壳聚糖-胶原支架;骨髓间充质干细胞;冻干法;软骨组织工程     

新型组织工程椎间盘纤维环支架的制备与性能检测****

摘要 背景：以组织工程技术修复退变椎间盘,目前的研究多集中在如何修复摘除的髓核组织,然而髓核组织工程方法无法完整重建椎间盘的结构和功能,所以相应的纤维环组织工程被认为是组织工程椎间盘治疗策略的主要限制因素之一。 目的：制备天然猪脱细胞脱钙骨基质明胶,并验证其作为组织工程椎间盘纤维支架的可行性。 方法：取猪股骨近端松质骨,用环钻钻取直径10 mm、内径5 mm、厚3 mm的中空环状骨,高压水枪冲洗,进行脱脂、脱钙、脱细胞等相关处理,制成环状的支架材料。对材料进行大体、组织学、光镜、扫描电镜观察,并对支架的吸水率、孔隙率、生物力学参数等进行检测。分离培养犬骨髓间充质干细胞,采用MTT法分析支架浸提液毒性。 结果与结论：支架为乳白色,中空环状,质地柔软的多孔结构。苏木精-伊红染色示组织无细胞结构残留。光镜及扫描电镜示支架孔隙均匀,孔隙相通,平均孔径为(401.4±13.1) μm,孔隙率为(62.12±1.52)%,吸水率为(409.77±11.34)%。生物力学结果示支架的弹性模量为(47.75±6.32) kPa。MTT法显示不同浓度支架浸提液与对照 DMEM 培养液吸光度值比较,差异无显著性意义(P > 0.05),支架无细胞毒性。提示猪脱细胞脱钙骨基质明胶去细胞彻底,具有良好的孔径、孔隙率及生物力学强度,并且无毒,具备良好的生物相容性,可作为组织工程椎间盘纤维环支架材料。 关键词：纤维环;支架;脱钙骨基质明胶;生物相容性;组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.03.005     

生物蛋白胶双相接种法促进组织工程骨构建的观察

背景：很多学者采用生物蛋白胶修饰无机支架材料改善其细胞黏附能力,并证实该方法能有效促进骨髓间充质干细胞与支架材料黏附。 目的：观察采用生物蛋白胶双相接种技术促进组织工程骨体外构建的可行性。 设计、时间及地点：细胞生物学水平实验,2003-01/2008-10在解放军第三军医大学组织工程研发中心实验室完成。 材料：医用生物蛋白胶为广州倍特生物技术有限公司产品,同种异体冻干脱钙骨基质由解放军第三军医大学西南医院骨组织库提供。 方法：以生物蛋白胶为介质,用双相接种技术将羊骨髓间充质干细胞与同种异体冻干脱钙骨基质复合,在体外构建组织工程骨,以静置接种法作为对照。 主要观察指标：通过细胞计数及MTT观察不同接种密度生物蛋白胶双相接种法所构建的组织工程骨细胞数量,并通过相差显微镜和扫描电微观察细胞在支架材料中的分布情况。 结果：双相接种法在不同接种密度时都可保持细胞黏附率维持在80%左右,上架细胞的数量随接种细胞密度增加成比例增加;生物蛋白胶对细胞的增殖没有明显影响,提高接种密度使细胞生长曲线提前达到平台期,各组的细胞数量峰值接近。 结论：双相接种技术可显著提高种子细胞与支架材料的复合数量、复合效率并且分布均匀,是一种工程骨快速高效组织的构建方法。     

不同种植密度对大鼠脂肪间充质干细胞三维培养下成软骨能力的影响

背景：软骨组织工程要求植入的软骨细胞在三维支架材料中能够合成与软骨相同的软骨基质，而植入密度是成功的关键点之一。 目的：探讨壳聚糖-胶原-硫酸软骨素支架上不同种植密度对大鼠脂肪间充质干细胞成软骨能力的影响。 设计、时间及地点：细胞-支架学体外观察，于2007-11/2008-07在中国医科大学细胞生物实验室完成。 材料：清洁级雄性SD大鼠6只，由中国医科大学实验动物中心提供。 方法：室温下以乙酸为溶剂的5 g/LⅠ型胶原溶液与20 g/L壳聚糖按7∶3体积比置于预冷的模具中混合，冷冻干燥后将支架切成5 mm×5 mm×2 mm，浸入含20 g/L硫酸软骨素的乙醇中室温交联，双蒸水冲洗至中性，再次冷冻干燥即为壳聚糖-胶原-硫酸软骨素支架。切取大鼠腹股沟脂肪组织，通过胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶消化后得到脂肪间充质干细胞。将制备的壳聚糖-胶原-硫酸软骨素支架分为3组，分别调整第3代细胞密度为2×109 L-1，2×1010 L-1，2×1011 L-1，吸取细胞悬液50 μL均匀的种植于每个支架上，加入成软骨诱导培养基培养3周。 主要观察指标：取样制成切片进行苏木精-伊红染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色，RT-PCR检测软骨特异性基因的表达。 结果：诱导培养3周后，各组细胞在支架中生长黏附良好，且高种植密度2×1011 L-1组细胞排列紧密，有较多的基质形成，并有软骨陷窝样结构；各组Ⅱ型胶原均呈阳性表达，并随细胞种植密度的升高呈递增趋势。RT-PCR结果显示，随着细胞种植密度的升高，蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA的表达逐渐增强，而Ⅹ型胶原mRNA的表达逐渐下降。 结论：壳聚糖-胶原-硫酸软骨素复合支架材料可为脂肪间充质干细胞生长分化及组织形成提供一个良好的环境，2×1011 L-1高密度种植有利于脂肪间充质干细胞的成软骨分化。     

异种脱蛋白松质骨作为支架材料的性能分析*★

背景：异种脱蛋白松质骨因其来源广泛和独特的生物学特性有望成为较好的骨组织工程支架，其关键点为免疫原问题，如能解决免疫原问题，则有望开发出一种新型植骨材料。 目的：通过理化方法制备脱蛋白松质骨，对其结构、组成及生物安全性能进行分析，探讨异种脱蛋白松质骨作为骨组织工程载体可行性。 设计、时间及地点：对比观察实验，于2008-02/2009-01在黑龙江省纤维化生物治疗重点实验室完成。 材料：取成年猪和山羊股骨远端松质部分，1∶1氯仿甲醇液脱脂、体积分数30%H2O2脱蛋白，制得脱蛋白松质骨。 方法：①通过红外光谱仪、X射线衍射分析仪、氨基酸分析仪、力学测试仪进行载体性能测试。②取第3代人髂骨骨髓间充质干细胞调整浓度为2×108 L-1细胞悬液，接种到载体至饱和，倒置显微镜和扫描电镜观察种子细胞黏附及生长增殖情况。③40只BALB/C小鼠随机分为实验组和对照组，每组20只。分离小鼠股后肌肉制成肌袋，实验组植入猪脱蛋白松质骨，对照组直接缝合。术后1,2,4,8周检测分析血清肌苷、谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平。④采用免疫酶组织染色方法分析猪脱蛋白松质骨和植入小鼠体内4周脱蛋白松质骨标本的免疫原性。 主要观察指标：体外实验分析脱蛋白松质骨理化性能、免疫原性。动物实验分析生物安全性能。 结果：脱蛋白松质骨载体无机成分主要是与人骨天然成分相同的羟基磷灰石，经过一系列处理后，胶原蛋白并没有被脱除，这种结构保持了较好的力学性能。脱蛋白松质骨由于脱除了主要的免疫原性物质，其免疫原性较弱，毒性低。人骨髓间充质干细胞接种于载体后生长分化良好。 结论：异种脱蛋白松质骨是一种良好骨组织工程载体。     

胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状修复体负载骨髓间充质干细胞体外培养*★

目的：观察胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体对经诱导骨髓间充质干细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响，评价其作为关节软骨工程支架的可行性。 方法:实验于2007-09/2008-03在广东省组织工程构建与检测实验室进行。①实验方法：以胶原、壳聚糖、β-磷酸三钙制备复合支架，孔隙率≥ 90%，孔径100 μm；体外培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞并成骨诱导3 周，经检测诱导成功后，使之吸附于多孔胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体上三维立体培养4周。②观察指标：通过倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测修复体三维立体培养对成骨细胞的表型、增殖及功能的影响。 结果：①骨髓间充质干细胞经成骨诱导，检测碱性磷酸酶染色阳性，钙结节染色阳性，证实诱导成功。②胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙复合支架亲水性好，经诱导的骨髓间充质干细胞吸附于支架表面24 h后,顺孔隙迁徙至支架内部，倒置显微镜和扫描电镜观察显示细胞在孔壁贴附良好。③组织学及免疫组织化学检测表明成骨细胞在复合支架上增殖和表型维持稳定，能分泌细胞外基质，Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性。　 结论：胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体与经成骨诱导的骨髓间充质干细胞相容性良好，为修复关节软骨下层骨的进一步研究提供了实验依据。     

带部分松质骨小牛皮质骨支架复合兔骨髓间充质干细胞植入兔体内血管内皮细胞生长因子的表达

摘要 背景：目前异种松质骨作为组织工程材料较为多见,而皮质骨因其难以降解,孔隙率低等原因限制了其使用。但皮质骨具有许多松质骨不具备的优越性,如生物力学方面,如何开发利用皮质骨是课题研究的重点。 目的：观察兔骨髓间充质干细胞复合带部分松质骨小牛皮质骨支架材料植入兔体内后血管内皮细胞生长因子表达。 方法：健康1月龄新西兰大白兔4只用于干细胞提取;3月龄新西兰大白兔60只,在髂骨翼分别植入骨髓间充质干细胞成骨诱导后复合异种骨,单纯异种骨,自体髂骨。术后4,8,12,24周取材RT-PCR检测血管内皮细胞生长因子的表达。 结果与结论：血管内皮细胞生长因子的表达情况：在各时间点,单纯异种骨组低于骨髓间充质干细胞成骨诱导后复合异种骨组和自体髂骨组(P < 0.05)。术后第4周时,骨髓间充质干细胞成骨诱导后复合异种骨组低于自体髂骨组(P < 0.05),在术后第8,12,24周时,两组差异无显著性意义(P > 0.05)。提示兔骨髓间充质干细胞复合带部分松质骨的小牛皮质骨支架材料植入新西兰兔体内具有较好的血管生成能力。 关键词：成骨诱导;骨髓间充质干细胞;带部分松质骨小牛皮质骨;血管内皮细胞生长因子;骨科生物材料 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.34.005     

猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体兔体内成骨☆

目的：生物衍生骨具有天然骨组织的三维立体孔隙-网架结构，有利于种子细胞的黏附、增殖。观察猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体在兔体内成骨及支架的降解。 方法：实验于2005-03/2006-12在中南大学湘雅医院中心实验室完成。选择健康家兔16只，3月龄左右，其中1只提供骨髓，另15只作组织工程骨植入，分4，8，12周3个时间点，每个时间点5只。采用Ficoll密度梯度离心法得到兔骨髓基质干细胞并诱导培养；采用物理化学方法对猪松质骨进行处理得到猪松质骨支架，与经诱导培养的骨髓基质干细胞体外复合培养后植入机体内，同时植入单纯猪松质骨支架做自身对照。 结果：纳入动物15只，均进入结果分析。采用X射线、苏木精-伊红染色、Masson三色染色及图像分析观察猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体在兔体内成骨及支架的降解。①X射线观察：猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体移植术后4周移植区周围可见少量散在分布的中密度影，8，12周时中高密度影逐渐向中心区增大。单纯猪松质骨支架移植术后各时间点移植区内均呈低密度影。②组织学观察：猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体植入后4周开始有新骨生成，支架开始降解；8周时新骨的形成及支架的降解都明显增加；12周时新骨继续增加，逐渐向成熟骨组织转变，可见少量哈佛系统，但骨小梁尚不典型，毛细血管增生明显，少量支架残留，未见炎症细胞。单纯猪松质骨支架植入后各时间点无新骨形成。③图像分析表明：猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体植入后新骨组织随时间延长而增加，而材料组织随时间延长而减少，但新生骨组织增加与支架材料组织减少无明显直线相关（P > 0.05）。 结论：猪松质骨支架与骨髓基质干细胞复合移植后新骨逐渐形成，支架逐渐降解，是一种较理想的骨组织工程支架材料。     

羟基丁酸-羟基辛酸共聚体/脱细胞软骨基质支架的细胞黏附性

背景：羟基丁酸-羟基辛酸共聚体[poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyoctanoate)，PHBHOx]是一种新型的多聚羟基烷酸类材料，具有优良的可塑性、生物相容性、生物可降解性等性能，但同其他酯类材料相似，PHBHOx亲水性能较差，单纯PHBHOx材料支架细胞黏附性能明显不足。 目的：观察羟基丁酸-羟基辛酸共聚体/脱细胞软骨基质支架的细胞黏附性。 方法：取新鲜猪膝关节表面透明软骨，采用非离子型去污剂Triton X-100、低渗Tris-HCl以及Dna酶和Rna酶等进行脱细胞处理。低温粉碎后与PHBHOx以不同比例复合，采用溶剂浇铸-颗粒沥滤技术制备支架。分离培养猪关节软骨细胞，进行细胞-支架黏附实验并通过MTT比色法和扫描电镜观察软骨细胞在支架上的黏附存活情况。 结果与结论：PHBHOx/脱细胞软骨基质支架的细胞黏附率较对照组显著提高，软骨细胞在支架上黏附紧密，生长良好。提示复合脱细胞软骨基质可以明显提高单纯PHBHOx支架的细胞黏附性能。 关键词：羟基丁酸-羟基辛酸共聚体；脱细胞软骨基质；支架材料；细胞黏附性 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.25.007