单细胞转录组测序技术在眼科相关研究中的应用研究进展

单细胞转录组测序(scRNA-seq)技术可以从单细胞水平获得全转录组的表达谱,并发现罕见细胞类型及其亚型,鉴定细胞特异性标记物,充分注重了细胞间或细胞亚型间的差异,被广泛地应用于肿瘤治疗、生殖生育、免疫学、神经科学、微生物学等领域。近年来,眼科领域研究也逐渐引入了scRNA-seq技术,本文将对scRNA-seq技术在眼科基础以及疾病研究的应用进展进行综述。     

单细胞转录组测序在眼科研究领域中的应用

单细胞转录组测序技术（single-cell RNA-sequencing，sc RNA-seq）是从单个细胞水平分析细胞转录组的表达谱，用于鉴定细胞特异性标记物，发现罕见细胞类型、细胞亚型，揭示细胞之间的差异表达，成为研究复杂生物体系细胞异质性的有效方法，已广泛应用于干细胞、器官发育、神经系统、肿瘤、免疫、微生物等多个研究领域。近年来，该技术在眼科研究领域的应用也日渐增多。随着现代分子生物学与生物信息学的进展，高通量、低成本、高效的商业化测序平台不断涌现。本文主要阐述sc RNA-seq的几项重要技术应用的优缺点和该技术在眼科研究领域中的应用。在未来的研究中，该技术可能扩展到更多的眼部相关疾病的研究中，逐渐应用于临床，指导疾病的诊断及治疗。     

转录因子Brn-3a在视网膜神经节细胞中的表达及意义

Brn-3a属于POU家族转录因子第Ⅳ亚类,人们对其基因表达的调节及其功能进行了广泛的研究.Brn-3a转录因子主要表达于神经系统的神经元亚群中,参与神经元的生存和分化相关基因的激活.其在神经系统的分化发育以及抗凋亡的调控作用成为目前的研究热点.本文就转录因子Brn-3a的基本结构、基因表达调节及其在视网膜神经节细胞中的表达等方面的研究现状及进展作一综述.     

单细胞转录组测序在年龄相关性黄斑变性研究中的应用

年龄相关性黄斑变性(ARMD)是临床中常见的老年性致盲性眼病,可造成中心视力的不可逆丧失,其发病机制复杂,尚未阐明,治疗方法有限,诊疗效果不佳。传统的转录组测序方法基于细胞群体水平获得细胞群的平均差异,或反映数量占优势细胞的生物信息,而单细胞转录组测序(scRNA-seq)能对单个细胞的mRNA进行转录组分析,可用于发现新的细胞亚型、揭示细胞异质性、鉴定罕见细胞、理解细胞分化。本文简述了scRNA-seq的技术原理,及其在视网膜、脉络膜发育及ARMD研究中的应用,提出了该项技术的缺陷和新兴技术的发展趋势,为深入研究视网膜、脉络膜生理学、ARMD疾病病理生理学及其发病机制提供新的思路及视角,以期对ARMD的靶向治疗提供理论依据。     

糖尿病视网膜病变患者血清微核糖核酸表达谱的初步研究

目的本研究旨在探讨血清微核糖核酸(miRNA)成为糖尿病视网膜病变(DR)生物标志物的可能性。 方法队列研究。2014年11月至2015年6月,招募中国医科大学附属盛京医院眼科和内分泌科患者69例作为研究对象。其中,单纯糖尿病患者30例作为单纯糖尿病组,DR患者39例作为DR组。两组采用数字表法各随机选取3例患者,应用miRNA芯片技术检测血清miRNA的表达水平;使用分层聚类分析,获得DR患者的血清miRNA表达谱;利用生物信息学方法,分析特异性表达的血清miRNA的靶基因及其相关信号通路。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术,检测两组患者血清中特异性miRNA的表达水平。采用受试者工作特征曲线(ROC曲线),评价血清中特异性miRNA对DR的诊断效能。 结果miRNA芯片技术检测表明,在3100种成熟的miRNA中,共筛选出19种差异miRNA。其中,13种表达上调;6种表达下调。结果表明,在DR患者血清中存在特异性表达的miRNA。qRT-PCR检测表明,DR组miR-19b、miR-221和miR-18b表达均上调,差异有统计学意义(U＝256.027,125.515,254.017;P<0.05),并且与miRNA芯片筛选的结果相符。受试者工作特征曲线结果表明,miR-19b(曲线下面积＝0.78,95%CI＝0.66~0.90)、miR-221(曲线下面积＝0.89,95%CI＝0.81~0.97)和miR-18b(曲线下面积＝0.78,95%CI＝0.67~0.90)对DR均有较高的诊断效能,其中miR-221诊断效能最高。 结论DR患者血清中存在特异性miRNA表达谱,这些差异性表达的miRNA可能作为调控因子,通过调节靶基因调控DR的发生和发展,其中miR-221最有望成为DR的生物标志物。     

基于RNA-seq技术的雏鸡晚期离焦识别转录组学研究

目的: 探讨晚期离焦识别的分子机制。方法: 实验研究。将30只7 d龄白来航鸡随机分为负镜组、正镜组和对照组, 分别给予雏鸡右眼-10 D/+10 D/0 D透镜诱导, 干预时间为6 d。所有动物均在光学干预前后测量屈光度、眼轴和后极部各组织厚度等生物学参数。采用单因素方差分析对数据进行分析。眼球生物学参数测量完毕后分离眼后极部组织, 提取RNA, 应用RNA-seq技术筛选差异表达基因, 并对其进行GO功能注释、KEGG通路分析及PPI网络分析, 观察离焦干预对雏鸡后极部各组织转录组的影响。结果: 负镜组、正镜组雏鸡的屈光度、眼轴长度以及脉络膜厚度, 与对照组相比, 差异具有统计学意义(P<0.05);以P<0.05和|log2FC|>1为筛选标准, 负镜组与对照组相比, 视网膜有203个差异表达基因, 脉络膜有757个差异表达基因, 巩膜有1 509个差异表达基因;正镜组与对照组相比, 视网膜有191个差异表达基因, 脉络膜有378个差异表达基因, 巩膜有1 918个差异表达基因。与对照组比, 负镜组与正镜组的重叠基因除LOC121112941外均表现出相同的差异...     

MicroRNAs在糖尿病视网膜病变中的相关研究进展

MicroRNAs(miRNAs)是一种小分子非编码RNA,是转录后调节基因表达关键因子,参与调控细胞分化、增殖和新陈代谢等多种生物学过程。在糖尿病视网膜病变(DR)发生发展过程中miRNAs表达差异改变明显,国内外多项研究表明miRNAs调控基因的表达与DR生理病理机制关系密切。部分特异性表达的miRNAs可以通过调控视网膜中氧化应激与炎症反应水平等影响DR发生发展,因此通过增强或抑制这部分miRNAs可以延缓DR病情进展。单个或多个miRNAs的组合可以作为DR新型的转录组学生物标志物,也是未来治疗DR的潜在有效靶点。目前针对血液或体液中特定miRNAs的检测有助于DR的早期干预治疗和病情随访追踪。因此,本文主要对miRNAs及其参与调控DR的分子机制、治疗前景及生物标志物的相关研究进展作一综述。     

微小RNA在糖尿病视网膜病变发病机制中的作用

微小RNA（micoRNA）是一类高度保守、非编码的小分子RNA,通过与mRNA互补配对在转录后水平降解mRNA或抑制mRNA翻译来负调控靶基因的表达,并可能调控着几乎每一个细胞生理进程.研究发现微小RNA的异常表达谱对于糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）的发病机制有着至关重要的作用.微小RNA在不同的刺激因素下通过靶向调控核因子-κB、缺氧诱导因子-1/血管内皮生长因子、p53等与DR发生发展密切相关的靶基因,产生不同的细胞生物学效应,从而广泛调节视网膜各类细胞在炎症发生、新生血管形成、增生和凋亡等方面的病理过程.异常表达的微小RNA及其功能靶标的发现不仅丰富了对DR发病机制的阐述,也为DR的早期预防和探索基因靶向治疗提供新的突破点.     

间充质干细胞来源小胞外囊泡对视网膜光损伤的治疗作用及其机制

目的研究间充质干细胞(MSCs)来源小胞外囊泡(sEVs)对小鼠视网膜光损伤的作用及其可能的机制。方法人脐带来源MSCs采用流式细胞术鉴定表面标记蛋白, 收集第3～5代MSCs培养上清, 超速离心收集sEVs并采用透射电子显微镜鉴定形态。将65只清洁级8～10周龄健康雌性BALB/c小鼠按照随机数字表法随机分为正常组(17只)、磷酸盐缓冲液(PBS)组(24只)和sEVs组(24只)。PBS组和sEVs组小鼠右眼玻璃体腔分别注射2 μl PBS和2 μl sEVs后, 在蓝光照度930 lx的环境下照射6 h;正常组小鼠不做处理。分组处理后3 d, 采用苏木精-伊红染色观察视网膜结构, 原位末端转移酶标记(TUNEL)染色进行凋亡细胞计数, 视网膜电图(ERG)检测小鼠视网膜功能, mRNA转录组测序技术检测PBS组与sEVs组小鼠视网膜mRNA表达差异情况, 并进行差异基因KEGG聚类分析, 实时荧光定量PCR法进一步验证差异基因表达。结果培养的MSCs中CD90、CD105表达阳性, 而CD34、CD45表达阴性, 提取的MSC-sEVs呈直径为80～140 nm的双层膜囊泡结构。...     

免疫磁珠法原代分离培养大鼠视网膜微血管周细胞

目的建立免疫磁珠法原代分离纯化大鼠视网膜微血管周细胞，并确定其免疫组化特征。方法免疫磁珠法结合传统的胶原酶消化及筛网过滤法分离出大鼠视网膜微血管周细胞，采用含有20％胎牛血清的DMEM培养。通过周细胞的形态和生长方式初步鉴别，再进行细胞α—SMA，vWF，GFAP抗体免疫组织化学特征鉴定，及激光共聚焦显微镜行用细胞PDGFR-β和desmin抗体荧光双标观察。周细胞生长曲线通过MTT法测定。结果本法获得的周细胞纯度可达98％，并能连续传代。原代周细胞约2～3周融合，传代后生长和融合速度加快，细胞形态不规则，胞内可见丝状结构，无接触性抑制。免疫组化证实周细胞胞浆内α-SMA蛋白表达阳性，内皮细胞特异性vWF因子表达阴性，胶质细胞特异性GFAP表达阴性。激光共聚焦显示周细胞PDGFR-β和desmin抗原表达均为阳性。结论本研究首次报道应用免疫磁珠法分离培养大鼠视网膜微血管周细胞。获得高度纯化的周细胞具有明确的免疫组化特征，可用于相关视网膜血管性疾病的进一步研究。     

血清抗视网膜抗体在视网膜疾病中的作用研究进展

血清抗视网膜抗体(ARA)是一组血清中可与视网膜自身抗原结合的抗体谱, 在视网膜退行性改变、炎症微环境的形成、组织破坏等病理过程中具有重要的生物学意义。近年来研究发现, ARA在老年性黄斑变性、自身免疫性视网膜疾病、视网膜色素变性等中表达升高, 且表达程度与疾病发展过程相关。然而目前对ARA的研究尚不完善, 缺乏动物实验以及大范围的随机对照临床试验, 导致ARA的具体作用机制尚不十分明确。尽管多项研究已经证明, 血清ARA在遗传性、自身免疫性、退行性视网膜疾病中具有重要的辅助诊断价值, 但目前缺乏公认的实验室检测手段与特异性强、灵敏度高的实验室指标, 仍需结合临床体征才能对疾病进行确诊, 具有一定的局限性。明确ARA在视网膜疾病中的作用机制, 能够为探索多种视网膜疾病的早期诊断和治疗提供新思路, 从而更好地保护视网膜细胞, 对维持视功能具有重要的临床和科学意义。     

细胞衰老在青光眼中的作用研究进展

细胞衰老是细胞在缺血、缺氧、氧化应激、DNA损伤、活性氧沉积等刺激下被激活的一种应答程序。衰老细胞的特征包括:衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性升高、P16INK4a高表达、衰老相关易染色质(SAHF)聚集、衰老相关分泌表型(SASP)产生、端粒缩短等。介导细胞衰老的经典信号通路包括P16INK4a/Rb途径和P19ARF/P53/P21Cip1途径, 这2条通路既相互作用, 又相互独立。近年来, 青光眼被认为是与细胞衰老密切相关的致盲眼病。细胞衰老在青光眼中的研究主要集中在小梁网和Schlemm管内皮细胞衰老引起房水流出通路阻力增加, 以及细胞衰老在青光眼视网膜神经节细胞损伤中的作用机制及干预研究。细胞衰老作为细胞死亡前的不可逆阶段, 深入研究其在青光眼发生和发展中的作用机制, 并特异性阻断细胞衰老信号传递, 有助于为降低房水流出阻力和青光眼视神经保护治疗提供新的切入点。本文就细胞衰老的特征、诱因、分子信号通路以及其在青光眼中的研究进展进行综述。     

微小RNAs在眼组织的表达及其与眼科疾病的关系

微小核糖核酸（miRNAs）是内源性小分子非编码调控RNAs,通过抑制转录或降解mRNA调控基因的表达。研究发现miRNAs涉及组织分化和生长等许多重要的生物进程,显示出组织特异性和生长阶段特异性,也参与新生血管形成及很多病理进程,如肿瘤血管新生、氧化应激、免疫反应和炎症。目前,视网膜、晶状体和角膜的miRNAs转录组已经建立,并可能在未来作为眼科疾病治疗的手段之一。就miRNAs在眼组织中的分布及其在眼病中的异常表达进行综述。     

糖尿病视网膜病变生物标志物的表达与测定

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病常见的血管并发症, 也是不可逆盲的主要原因之一, 其特征是视网膜血管渗漏、新生血管形成和纤维增生。尽管目前DR的治疗方式多样, 但大多针对疾病中晚期且疗效欠佳。因此, DR的早期诊断和精准治疗十分重要。近年来, DR相关生物标志物的研究发展迅速, 在疾病的风险评估、早期干预及治疗中发挥重要作用。经典的DR生物标志物如糖化血红蛋白, 已在临床实践中广泛应用。随着对DR发病机制的进一步了解, 炎症类生物标志物、血管生成类生物标志物已被证实与疾病的发生和进展密切相关。同时, 随着科技的不断进步, 先进设备与技术为DR相关生物标志物的探索构建了广阔平台, 组学类生物标志物、影像类生物标志物和人工智能的应用已成为研究热点, 为实现DR早期准确诊疗做出了重要贡献。本文就DR发生与发展中相关生物标志物表达与测定的最新研究进展进行综述, 以期为DR的高效防控与有效治疗提供新思路。     

重视视神经保护和再生基础研究, 推动其向临床转化

视网膜神经节细胞(RGC)的原发性或继发性死亡是临床中多种视神经疾病的共同转归, 常导致严重的视功能损害。RGC的内在特点是在细胞分化成熟过程中, 细胞内在的生长抑制因子转录因子不断上调, 生长诱导转录因子不断下调。同时, RGC受损后外在的抑制性微环境包括氧化应激、慢性炎症、神经营养因子缺乏、髓鞘蛋白的高度表达和胶质瘢痕的形成均限制了轴突的再生。内在和外在因素共同导致受损后RGC的死亡并阻碍轴突再生。多种神经保护制剂及方法试图从内在和外在两方面促进神经保护及轴突再生, 熟知这些神经保护策略对进一步拓展该领域的基础研究及推动其向临床转化有着重要意义。     

微小RNA在视网膜中的表达及其与视网膜疾病的关系

微小RNA(microRNA.miRNAs)是一类调控基因表达的非编码小RNA.miRNA的表达具有组织特异性,并参与细胞生长、发育、分化、增生以及凋亡等过程.近年来,人们也发现miRNA在视网膜不同细胞中呈特异表达,尽管尚无直接证据,但这些差异表达的miRNA可能与视网膜疾病如视网膜色素变性以及糖尿病视网膜病变的发生发展有着密切的联系.本文对miRNA在视网膜中的特异表达以及miRNA在视网膜疾病中的作用等研究现状进行总结,同时对miRNA在视网膜相关疾病的治疗方面的前景进行探讨.     

糖尿病小鼠视网膜p21活化激酶4表达上调及其对视网膜血管内皮细胞行为和线粒体功能的影响

目的观察p21活化激酶4(PAK4)对视网膜血管内皮细胞行为和线粒体功能的影响。方法实验研究, 分为体内动物实验和体外细胞实验两部分。体内动物实验:健康C57BL/6J雄性小鼠12只, 随机分为正常对照组、糖尿病组, 每组各6只小鼠。糖尿病组小鼠经链脲佐菌素诱导建立糖尿病模型。建模后8周, 采用蛋白质免疫印迹法、实时荧光定量聚合酶链反应检测正常对照组、糖尿病组小鼠视网膜PAK4表达情况。体外细胞实验:人视网膜微血管内皮细胞(hRMEC)分为常规培养细胞组(N组)、空载体组(Vector组)、PAK4过表达组(PAK4组)。各组加入150 μg/ml糖基化终末产物诱导细胞。细胞划痕实验检测各组hRMEC内细胞迁移情况;流式细胞仪检测各组白细胞粘附于hRMEC数量。Seahorse XFe96细胞能量代谢分析仪测定细胞内线粒体基础呼吸、三磷酸腺苷(ATP)生成、最大呼吸与备用呼吸能力。两组间比较采用t检验;三组间比较采用单因素方差分析。结果体内动物实验:与正常对照组小鼠比较, 糖尿病组小鼠视网膜中PAK4 mRNA、蛋白相对表达量显著升高, 差异均有统计学意义(t=25.372、22.41...     

视网膜母细胞瘤组织直接免疫制备抗人视网膜母细胞瘤单克隆抗体及其抗原特性的实验研究

目的 研究新鲜视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,Rb)细胞制备的抗人Rb单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb)的抗原特性。方法 利用手术中获得的新鲜Rb组织细胞制备成细胞悬液,并将其注射入3呈BALB－C小鼠腹腔中,免疫小鼠。取其脾淋巴细胞与SP2／0骨瘤细胞融合,以抗原的性质进行检测,观察McAb相应抗原蛋白在Rb组织中的表达。结果 经反复单细胞克隆化操作及抗体特异性筛选,共获得3株能持续,稳定分泌抗人Rb McAb的杂交瘤细胞系。其中3C6株杂交瘤细胞在体外经≥2年反复冻存,传代培养,仍能稳定分泌特异性强,效价高的抗体,为IgG1亚类。免疫荧光及免疫组化检测结果显示,McAb3C6相应抗原蛋白在Rb组织中呈强阳性表达,而在其他肿瘤及正常组织中无表达。免疫印迹法检测表明,McAb3C6相应抗原蛋白相分子质量约25000。结论 采用新鲜的实体瘤细胞制备的抗人Rb McAb 3C6在Rb组织中呈高度特异性表达,与其他肿瘤及正常眼组织无交叉反应,其所针对的抗原蛋白相对分子质量约为25000,提示可能有新的基因参与Rb肿瘤的发生。     

糖尿病视网膜病变患者转录组学初步研究

目的 利用转录组学技术研究有无糖尿病视网膜病变（DR）患者差异表达基因,寻找DR相关基因。设计 前瞻性比较性病例系列。研究对象 14例2型糖尿病（T2DM）患者,其中 8例合并中度以上非增生性DR（NPDR）或增生性DR（PDR）的T2DM患者纳入DR组,6例不合并DR的T2DM患者纳入DM组。方法 采集每例患者外周血,分离白细胞,抽提总RNA,反转录为cDNA,构建转录组文库,Illumina HiSeqTM2000系统测序,对测序结果进行生物信息学分析。RT-qPCR检测外周血白细胞钙调蛋白1（CNN1）、溶血磷脂酸受体3（LPAR3）mRNA水平,验证转录组测序结果。以两组间差异基因表达量均数和中位数差异倍数上下调均≥2.0倍为标准筛选差异表达基因。主要指标 两组间差异表达基因,差异基因本体（GO）注释和富集、生化代谢与信号转导通路（Pathway）注释和富集、差异基因相互作用网络。两组间外周血白细胞CNN1、LPAR3的mRNA水平差异。结果 与DM组相比,DR组筛选出差异表达基因103个,其中上调41个,下调62个。下调最明显的为杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DS1（KIR2DS1）,上调最明显的为U105B小核仁RNA基因（RNU105B）。GO富集分析显示在生物学过程（GO-P）、分子功能（GO-F）中显著富集的GO条目为细胞过程、单一生物过程、结合功能。谷胱甘肽S转移酶mu1（GSTM1）、早期生长应答1（EGR-1）、LPAR3、CNN1在以上条目均有富集。Pathway显著性富集分析显示,差异基因富集最多的为抗原处理和呈现、自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路,KIR2DS1均参与其中。差异基因相互作用网络分析示,差异表达基因中GAS1与多个基因之间存在相互作用。RT-qPCR结果显示,与DM组比较,DR组中的CNN1和 LPAR3的mRNA含量均升高（P均<0.05）。结论 采用转录组学技术发现,DR组患者外周血白细胞存在多种差异表达基因,下调的基因中KIR2DS1、GSTM1、EGR-1、GAS1,上调的基因中RNU105B、LPAR3、CNN1是否与DR的发生发展有关有待于进一步验证。（眼科, 2020, 29： 105-113）     

基于单细胞转录组测序探讨小鼠脉络膜新生血管内皮细胞的病理特征

目的基于单细胞转录组测序(scRNA-seq)探讨小鼠脉络膜新生血管(CNV)中内皮细胞(EC)的分子表达与病理特征。方法取6只6～8周龄C57BL/6小鼠按照随机数字表法随机分为2个组, 每组3只, 处死后摘取双眼眼球, 分别采用剪碎脉络膜巩膜复合体法和刮取脉络膜法分离脉络膜组织, 采用胰蛋白酶/Ⅰ型胶原酶37 ℃连续消化制得单细胞悬液, 流式细胞术检测细胞活率及EC比例, 确定单细胞悬液制备方法。选取6只小鼠随机分为正常对照组和CNV组, 每组3只, 其中CNV组小鼠建立激光诱导的CNV模型;于造模后7 d制备单细胞悬液, 采用10xGenomics进行单细胞分离并构建测序文库, Illumina Novaseq6000进行高通量测序, 获得基因表达矩阵;根据文献报道并参考Cellmarker数据库定义细胞亚群;选取EC亚群进行拟时序分析, 生成各个细胞分化状态(State)的基因表达矩阵, 筛选CNV-EC并初步分析表达特征。另选取6只小鼠建立CNV模型, 于造模后7 d取小鼠眼球制备冰冻切片, 免疫荧光染色检测EC标志物Pecam1与线粒体外膜蛋白Tomm20、mt-Co1和毛...