骨形成蛋白4对人视网膜微血管内皮细胞糖酵解水平的影响

目的观察骨形成蛋白4 (BMP4)对人视网膜微血管内皮细胞(hRMEC)中糖酵解水平的影响。方法实验研究。将体外培养的hRMEC分为正常组、4-羟基壬烯醛(HNE)组(4-HNE组)、4-HNE+BMP4处理组(BMP4组)。4-HNE组细胞培养基中加入10 μmmol/L 4-HNE;BMP4组细胞培养基中加入10 μmmol/L 4-HNE刺激6 h后, 再加入100 ng/ml重组人BMP4。采用流式细胞仪检测各组细胞内活性氧(ROS)水平;噻唑蓝比色法检测4-HNE对细胞生存力的影响;细胞划痕实验、Transwell小室法测定4-HNE对细胞迁移能力的影响。采用实时定量聚合酶链反应、蛋白免疫印迹法检测正常组、4-HNE组细胞中BMP4、SMAD同源物9 (SMAD9) mRNA、蛋白相对表达量。采用Seahorse XFe96细胞能量代谢分析仪测定正常组、4-HNE组、BMP4组细胞内糖酵解代谢水平。组间比较采用单因素方差分析。结果正常组、4-HNE组、BMP4组hRMEC内ROS水平分别为21±1、815±5、810±7。与正常组比较, 4-HNE组、BMP4组ROS水平显著...     

长链非编码RNA 母系表达基因3调控miR-34a对糖尿病视网膜病变Müller细胞活化及炎症因子分泌的影响

目的　探讨母系表达基因3（maternally expressed gene 3,MEG3）对糖尿病视网膜病变（DR）Müller细胞的活化及炎症因子分泌的影响及机制。方法　高脂饮食联合链脲佐菌素腹腔注射构建小鼠DR体内模型。高糖刺激人视网膜Müller细胞株MIO-M1构建DR体外模型。免疫荧光化学染色及Western blot检测小鼠视网膜及Müller细胞中胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。Western blot及酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠视网膜及细胞培养基上清中血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的表达。ELISA检测小鼠视网膜及细胞培养基上清中IL-1β蛋白的表达。分别或同时向Müller细胞中转染pcDNA-MEG3及miR-34a mimic对其表达进行干预。qRT-PCR检测MEG3 mRNA及miR-34a表达。结果　与正常对照组小鼠比较,DR组小鼠视网膜中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均增多（均为P<0.05）,MEG3 mRNA表达降低(P<0.01)。与对照组比较,高糖组Müller细胞中MEG3 mRNA表达降低(P<0.01),而GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均升高（均为P<0.05）。与高糖组比较,高糖+pcDNA-MEG3组中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均降低（均为P<0.05）。与正常对照组比较,DR组小鼠视网膜及高糖刺激的Müller细胞中miR-34a表达均升高(均为P<0.05)。与pcDNA组比较,pcDNA-MEG3组中miR-34a表达减少(P<0.01)。与pcDNA+NC mimic组比较,pcDNA+miR-34a mimic组中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均升高（均为P<0.05）,而pcDNA-MEG3+NC mimic组中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均减少（均为P<0.05）。与pcDNA-MEG3+miR-34a mimic组比较,GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达水平均升高（均为P<0.05）。结论　MEG3在DR小鼠视网膜及高糖刺激的Müller细胞中表达均降低,其可通过负向调控miR-34a抑制Müller细胞活化及炎症因子的分泌。过表达MEG3可能成为DR治疗的新靶点。     

脂质体法和电穿孔法体外转染SD大鼠视网膜M-ller细胞的比较

目的:探讨脂质体法及电穿孔法介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养的视网膜Müller细胞的可行性和区别.方法:体外培养出生后7～10d的SD大鼠视网膜Müller细胞,免疫荧光染色法鉴定95%以上为视网膜Müller细胞.分别用阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导的脂质体转染法和电穿孔法将质粒PEGFP-N1转染视网膜Müller细胞,荧光显微镜下检测转染后1,2,3,4d的转染效率,并持续观察至转染后14d,比较两者基因表达持续时间.结果:荧光显微镜下检测转染后1d,两组均可见少量细胞表达EGFP绿色荧光蛋白.转染后2d,两者转染效率均达到最大,并且电穿孔法介导质粒PEGFP-N1转染Müller细胞效率约为31.0%±2.8%,较脂质体法转染效率(10.5%±2.4%)更高.两者比较有统计学意义(P＜0.01).随后,两者转染效率均逐渐降低.电穿孔转染后的PEGFP-N1可在视网膜Müller细胞内持续表达近14d,而脂质体转染后仅能表达约7d.结论:脂质体法和电穿孔法均适用于视网膜Müller细胞的基因转染,但电穿孔法效率更高,表达时间更长.     

牛磺酸对高糖刺激大鼠视网膜Müller细胞GLAST和GS表达的影响

目的:通过检测牛磺酸对高糖刺激大鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运蛋白(glutamate-aspartate transporters,GLAST)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)表达的影响,探讨牛磺酸保护糖尿病引起视网膜损伤的机制。方法:高糖培养大鼠视网膜Müller细胞,分正常对照组(NC)、高糖组(high glucose,HG,25mmol/L)、高糖+0.1mmol/L牛磺酸(taurine,T)干预组(HG+0.1T)、高糖+1mmol/L牛磺酸干预组(HG+1T)、高糖+10mmol/L牛磺酸干预组(HG+10T)。用免疫荧光化学法和Western-blotting检测大鼠视网膜Müller细胞中GLAST和GS的表达。结果:高糖培养后,大鼠视网膜Müller细胞中GLAST和GS的表达明显减少(P<0.05),与高糖组相比,1mmol/L和10mmol/L牛磺酸干预可明显增加GLAST和GS的表达(P<0.05)。结论:牛磺酸增加Müller细胞中GLAST和GS的表达抑制糖尿病引起的视网膜Müller细胞功能改变。     

抗血管内皮生长因子单克隆抗体bevacizumab对缺氧Müller细胞水通道蛋白4表达的影响

目的 观察抗血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体bevacizumab(商品名Avastin)对氯化钴(CoCl2)诱导的缺氧Mller细胞水通道蛋白4(AQP4)表达的影响,探讨bevacizumab在治疗视网膜水肿中的作用机制.方法 采用酶消化法培养人视网膜Müller细胞,通过电子显微镜、细胞免疫荧光染色进行Müller细胞的鉴定.采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同浓度的CoCl2和VEGF作用不同时间后Müller细胞AQP4和VEGF mRNA的表达.观察200 μg/ml bevacizumab预处理对CoCl2诱导的缺氧人视网膜Müller细胞AQP4 mRNA表达的影响.结果 细胞免疫荧光染色显示,所培养的细胞95％表达波形蛋白、谷氨酰胺合成酶、α平滑肌肌动蛋白和胶质纤维酸性蛋白;电子显微镜下可见特征性的8～10 nm的微丝.证实培养的细胞为Müller细胞.RT-PCR结果显示,CoCl2上调Mller细胞AQP4和VEGF mRNA表达水平,AQP4和VEGF mRNA表达随CoCl2作用时间延长和CoCl2浓度增加的变化趋势均呈成正相关(r=0.952、0.954,P＜0.05).VEGF可上调Müller细胞上AQP4 mRNA的表达(F=12.43,P＜0.05).bevacizumab可抑制CoCl2诱导的Müller细胞AQP4 mRNA表达的上调(F=2 370.37,P＜0.05).结论 bevacizumab可以下调CoCl2诱导的Müller细胞AQP4的表达.这一效应可能是通过抑制VEGF对AQP4的诱导作用所发挥的,推测这是bevacizumab治疗视网膜水肿的机制之一.     

曲安奈德和酮咯酸氨丁三醇对缺氧视网膜Müller细胞上水通道蛋白-4及VEGF表达的影响

背景 曲安奈德(TA)玻璃体腔内注射可引起高眼压、白内障及眼内炎等并发症.酮咯酸氨丁三醇(Ketorolac)是一种作用机制与TA相似、不良反应较少的新型非甾体类抗炎药,其在治疗视网膜水肿方面可能替代或部分替代TA. 目的 研究TA和Ketorolac对CoCl2诱导的缺氧条件下兔视网膜Müller细胞上水通道蛋白-4(AQP4)及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,探讨其治疗视网膜水肿的作用机制. 方法 收集健康新西兰白兔20只,采用酶消化法培养兔视网膜Müller细胞并进行鉴定.取第2代细胞用于实验.分别用含500μmol/L CoCl2的DMEM 2 ml孵育细胞0、6、12、24 h建立视网膜Müller细胞缺氧模型,采用半定量逆转录PCR(RT-PCR)法观察缺氧对Müller细胞中AQP4 mRNA及VEGF mRNA表达的影响,确定造模的最佳时间点.将培养24 h的细胞分为正常对照组,缺氧对照组,缺氧+50、100、200 mg/L TA组,缺氧+50、100、200 mg/L Ketorolac组,分别在缺氧细胞培养基中加入相应的药物进行共培养,采用半定量RT-PCR法观察TA和Ketorolac对Müller细胞中AQP4 mRNA及VEGF mRNA表达的影响. 结果 培养的细胞呈不规则形、星形,细胞核呈卵圆形,培养14 ～25 d时细胞达到80％以上融合.95％的培养细胞中间丝波形蛋白(vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性表达,呈绿色荧光.RT-PCR法检测结果显示,培养后各时间点间Müller细胞中AQP4 mRNA和VEGF mRNA表达的吸光度(A)值总体比较差异均有统计学意义(F=18.70、53.20,P＜0.01),CoCl2作用6、12、24 h值均明显高于正常Müller,差异均有统计学意义(P＜0.05),其中24 h时AQP4 mRNA和VEGF mRNA的表达量达峰值.缺氧24 h时8个组Müller细胞中AQP4 mRNA和VEGF mRNA表达(A)值的总体比较差异均有统计学意义(F=27.98、10.03,P＜0.01);与缺氧对照组比较,除缺氧+50 mg/L TA组、缺氧+50 mg/L Ketorolac组外,其他各缺氧实验组Müller细胞中AQP4mRNA、VEGF mRNA表达量均明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05);缺氧+100 mg/L TA组和缺氧+100 mg/LKetorolac组以及缺氧+200 mg/L TA组和缺氧+200 mg/L Ketorolac组AQP4mRNA、VEGF mRNA的表达,组间差异均无统计学意义(P＞0.05). 结论 TA和Ketorolac均可下调化学性诱导的缺氧Müller细胞中AQP4和VEGF的表达水平,二者对视网膜水肿的治疗作用类似.     

雌激素对缺氧视网膜Müller细胞PEDF和VEGF表达的影响

目的：探讨雌激素对缺氧视网膜Müller细胞色素上皮衍生因子（PEDF）和血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法：采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western-blot印迹分析方法分别测定不同浓度雌二醇（E2）作用于缺氧Müller细胞后,细胞内PEDF mRNA,VEGF mRNA及相应的蛋白表达水平。结果：缺氧24h后PEDFmRNA及蛋白表达明显降低,10-5mmol/L和10-6mmol/LE2作用于Müller细胞后可明显缓解由于缺氧引起的细胞内PEDF mRNA及蛋白表达的降低,并与E2的浓度有关。缺氧24h后VEGF mRNA及蛋白表达明显升高,10-5mmol/L和10-6mmol/LE2作用于Müller细胞后可以明显降低细胞内VEGF mRNA及蛋白表达水平,并与E2的浓度有关。结论：雌激素可以调控缺氧条件下视网膜Müller细胞内PEDF和VEGF的表达,对视网膜病理性新生血管的形成具有保护作用。     

miRNA-147靶向调控VEGF对人视网膜色素上皮细胞增殖和凋亡及迁移的影响

目的：探讨miRNA-147靶向调控VEGF对人视网膜色素上皮细胞增殖和凋亡及迁移的影响,并初步研究其分子机制。

方法：选择人视网膜色素上皮细胞株(ARPE-19细胞),将细胞分为7组：空白对照组(不处理)、无义miRNA组(转染mimic NC)、miRNA-147模拟物组(转染miRNA-147 模拟物)、抑制剂阴性对照组(转染shRNA NC)、VEGF抑制剂组(转染VEGF抑制剂)、miRNA-147模拟物+空载病毒载体组(转染miRNA-147模拟物和空载体)和miRNA-147模拟物+VEGF过表达组(转染miRNA-147模拟物和VEGF过表达)。使用RT-qPCR检测各组细胞miRNA-147及VEGF mRNA表达水平; 双荧光素酶实验验证miRNA-147与VEGF靶向关系; Western blot检测VEGF蛋白表达水平; MTT法检测细胞增殖; 流式细胞术检测细胞凋亡水平及细胞周期的改变; 细胞划痕实验检测细胞迁移。

结果：与空白对照组和无义miRNA组相比,miRNA-147模拟物组miRNA-147表达水平显著升高,VEGF mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05); 与抑制剂阴性对照组相比,VEGF抑制剂组VEGF mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05); 与miRNA-147模拟物+空载病毒载体组相比,miRNA-147模拟物+VEGF过表达组VEGF mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。双荧光素酶报告显示VEGF是miRNA-147的靶基因。转染miRNA-147 模拟物和VEGF抑制剂均可降低ARPE-19细胞增殖和迁移水平,促进细胞凋亡(P<0.05)。转染VEGF过表达可逆转miRNA-147 mimic对ARPE-19细胞增殖、迁移和凋亡的影响(P<0.05)。

结论：miRNA-147可通过靶向VEGF抑制ARPE-19细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡。     

Müller细胞内色素上皮衍生因子与血管内皮生长因子的相互作用

目的 研究Müller细胞内色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor,PEDF)与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的相互作用,为临床上治疗新生血管提供新的思路.方法 大鼠Müller细胞原代培养,取第3代细胞用于实验.实验按以下操作进行:(1)观察VEGF对PEDF的作用:VEGF处理组细胞培养液中加入不同浓度VEGF(100nmol·L-1、500 nmol·L-1、1 000 nmol·L-1、5 000 nmol·L-1),24 h后收集细胞分别用RT-PCR和Western-blot法分析Müller细胞内PEDF mRNA和蛋白的表达.(2)观察PEDF对VEGF的作用:PEDF处理组细胞培养液中加入不同浓度PEDF(10 nmol·L-1、40 nmol·L-1、160 nmol·L-1、640 nmol·L-1),24 h后收集细胞分别用RT-PCR和Western-blot法分析Müller细胞内VEGF mRNA和蛋白的表达.结果 VEGF处理组中,VEGF浓度为1 000 nmol·L-1、5 000 nmol·L-1时,PEDF mRNA分别为正常对照组的0.69倍(P<0.05)和0.44倍(P<0.01),PEDF蛋白分别为正常对照组的0.54倍(P<0.05)和0.52倍(P<0.05).随VEGF浓度的升高,PEDF mRNA及蛋白表达均有逐渐减弱趋势.PEDF处理组中,PEDF浓度为40 nmol·L-1和160 nmol·L-1时,VEGF mRNA分别为正常对照组的0.61倍(P<0.05)和0.42倍(P<0.01),VEGF蛋白分别为对照组的0.70倍(P<0.05)、0.63倍(P<0.05).随PEDF浓度的升高,VEGF mRNA及蛋白表达亦有逐渐减弱趋势.结论 在Müller细胞内,VEGF对PEDF表达具有抑制作用,PEDF对VEGF也具有抑制作用,二者的负反馈调节作用可能在视网膜病理性新生血管中起重要作用.     

脑源性神经营养因子（BDNF）对高糖环境下视网膜Müller细胞的保护作用

目的　探讨脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）对高糖环境下视网膜Müller细胞的保护作用。方法　该研究实验分为3组,对照组、高糖组（对照组中添加25 mmol·L^-1葡萄糖）、BDNF组（高糖组添加100 mg·L^-1 BDNF）,实验干预24 h后,在倒置显微镜下观察各组细胞形态和生长状态,并进行各项指标检测。用倒置荧光显微镜观察各组视网膜Müller细胞的生长状态并检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）荧光强度;流式细胞仪检测视网膜Müller细胞凋亡率,Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达情况。结果　与对照组相比,高糖组Müller细胞生长状态差,细胞突起减少,细胞失去原有形态,由原来的不规则形变为类圆形,折光性增强;而BDNF组与对照组相比无明显差异;与高糖组相比,BDNF组细胞生长状态明显改善,细胞突起增多,细胞折光性减弱。与对照组相比,高糖组Müller细胞内ROS含量显著升高（P<0.01）,BDNF组细胞内ROS含量亦升高（P<0.01）;与高糖组相比,BDNF组ROS含量显著减少（P<0.01）。与对照组相比,高糖组细胞凋亡率显著升高（P<0.01）,BDNF组凋亡率仍高于对照组（P<0.01）;与高糖组相比,BDNF组凋亡率明显减少（P<0.01）。与对照组相比,高糖组Bcl-2蛋白相对表达量显著减少,Bax蛋白相对表达量明显升高,Bcl-2/Bax二者比值降低（P<0.01）,BDNF组与对照组相比相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）;与高糖组相比,BDNF组Bcl-2蛋白相对表达量明显升高,Bax蛋白表达减少,Bcl-2/Bax比值升高（P<0.01）。结论　高糖环境能诱导视网膜Müller细胞凋亡,而给予外源性BDNF能够显著抑制高糖环境诱导的视网膜Müller细胞凋亡,对视网膜Müller细胞起到保护作用。     

脂质体介导增强型绿色荧光蛋白基因在鼠视网膜Müller细胞中的表达

目的研究脂质体介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因对体外培养的鼠视网膜Müller细胞转染的有效性及安全性。方法采用视网膜组织块法培养鼠视网膜Müller细胞,振荡法分离纯化细胞,并对其进行免疫细胞化学鉴定。用阳离子脂质体Lipofectamine 2000负载pEGFP-N1质粒转染Müller细胞,荧光显微镜检测转染后12、24、48、72h的转染效率。台盼蓝排斥实验检测转染和未转染细胞的活力,明确脂质体Lipofectamine 2000对Müller细胞的毒性作用。结果成功培养视网膜Müller细胞,传代后90%以上的细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性。Lipofectamine 2000介导质粒pEGFP-N1转染Müller细胞后12、24、48、72h的转染效率分别为（9.7±1.9）%、（18.1±16）%、（17.2±2.5）%、（16.9±1.7）%。台盼蓝排斥实验显示Lipofectamine 2000转染前后活细胞率分别为（98.2±5.6）%、（96.1±6.2）%。结论脂质体Lipofectamine 2000可安全有效地介导Müller细胞的转染,为进一步明确Müller细胞的病理、生理功能及靶向Müller细胞的基因治疗提供了新的手段。     

缺氧对视网膜Müller细胞上水通道蛋白-4表达的影响

目的 利用体外培养的视网膜Müller细胞,研究在缺氧条件下视网膜Müller细胞上水通道蛋白-4(AQP-4)表达的变化.方法 采用组织块培养法从新西兰大白兔视网膜中获取Müller细胞,在含20%胎牛血清的DMEM培养液中原代培养,培养的细胞通过胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色及透射电子显微镜进行鉴定.取第2代细胞进行实验,将化学缺氧诱导剂CoCl_2联合DMEM培养液培养24h的细胞作为缺氧组;将DMEM培养液单独培养24h的细胞作为对照组.采用免疫细胞化学法及半定量RT-PCR法分别检测2组Müller细胞上AQP-4蛋白及AQP-4 mRNA的表达.结果 Müller细胞(第2代)上GFAP的阳性率为90%以上,细胞质染色呈棕色.细胞内含特征性的中间丝,细胞表面有微绒毛,细胞质内含丰富的细胞器.CoCl_2联合DMEM培养液培养24h后Müller细胞上AQP-4蛋白的表达较对照组明显增加(t=6.74,P＜0.05);AQP-4 mRNA的表达亦明显增加(t=21.79,P＜0.05).结论 缺氧能增强Müller细胞上AQP-4的表达,进而使视网膜内液体的积聚增加.提示Müller细胞在糖尿病视网膜病变(DR)或增生性视网膜病变的视网膜水肿形成过程中起重要作用.     

高浓度胰岛素对视网膜Müller细胞VEGF表达的影响(英文)

目的:探讨在高浓度胰岛素条件下,体外培养的兔视网膜Müller细胞的血管内皮细胞生长因子(vas-cularendothelialgrowthfactor,VEGF)的变化。方法:在不同浓度胰岛素条件下(4,8,12kU/L),体外培养兔视网膜Müller细胞,采用免疫细胞化学法、原位杂交法,定性测定Müller细胞分泌VEGF的变化,采用ELISA方法,定量测定Müller细胞分泌VEGF的变化。结果:高浓度胰岛素能明显增强VEGF的表达(P< 0.05)。结论:高浓度胰岛素可能通过刺激Müller细胞编码VEGF基因的转录,进而增强VEGF蛋白的表达,而在糖尿病视网膜病变的新生血管生成中发挥重要作用。     

表皮生长因子对氧化损伤的人眼Müller细胞增生及迁移的保护作用

背景 目前认为氧化损伤机制在年龄相关性黄斑变性(AMD)的发病中起着重要作用,主要与血-视网膜屏障的破坏有关,而Müller细胞是稳定血-视网膜内屏障功能的主要细胞成分.研究表明,表皮生长因子(EGF)可促进实验动物视网膜Müller细胞的增生和迁移,但其对人Müller细胞的作用研究较少. 目的 探讨EGF对体外氧化损伤的人眼Müller细胞增生和迁移的影响及其作用机制. 方法 将人眼Müller细胞系MIO-M1细胞进行培养并用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、第Ⅷ因子、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、人角蛋白及S -1 00免疫组织化学法进行鉴定.在无血清DMEM中加入不同质量浓度(0、1、10、30、100 mg/L) EGF,用5-溴脱氧尿嘧啶核苷( BrdU)标记法测定MIO-MI细胞的阳性率.根据干物方式的不同将培养细胞分为EGF组、H2O2损伤组、EGF+H2O2组、葡萄糖氧化酶(GO)组、GO+EGF组、EGF+ LY294002+H2 O2组,采用MTT比色法测定各组培养细胞的增生情况(A590).对培养的人眼Müller细胞采用划痕实验观察H2O2损伤条件下0、1、10、30、100 mg/L EGF作用24、48、72 h后对Müller细胞增生、迁移的影响;采用Western blot技术检测EGF对体外不同培养条件下M üller细胞Akt信号传导通路的作用. 结果 正常培养条件下10、30、100 mg/L EGF作用后Müller细胞的增生率分别为28.0％、32.9％、39.0％,明显高于0 mg/L、1 mg/L EGF组(24.5％、26.2％).在H2O2和GO分别培养细胞的条件下,高质量浓度的EGF组Müller细胞的吸光度(A570)值明显大于低质量浓度组,各组总体差异有统计学意义(F=23.582,P=0.000).与EGF+H2O2组比较,EGF+ LY294002+H2O2组Müller细胞的吸光度(A570)值明显下降.10 mg/L EGF促进Müller细胞迁移的作用最强.0.08 mmol/LH2O2作用Müller细胞后Akt信号通路激活,提前2h加入外源性EGF后,100 mg/L EGF对抗氧化所致Müller细胞的损伤作用最明显,同时提前2h加入外源性EGF和Akt信号通路阻断剂LY294002后,Akt信号传导通路的保护作用减弱. 结论 EGF对体外培养的Müller细胞具有促进增生及迁移的作用,10 mg/L EGF促进Müller细胞迁移作用最强.100 mg/L外源性EGF抗Müller细胞氧化损伤作用最强,其作用机制是激活Akt信号传导通路.     

碱性成纤维细胞生长因子在糖基化终产物作用下视网膜Müller细胞中的表达及对血管内皮生长因子影响

目的 观察糖基化终产物(AGEs)作用下兔视网膜Müller细胞中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达,以及bFGF对该细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响,探讨AGEs对于糖尿病视网膜病变(DR)发生发展的可能作用机制.方法 制备牛血清白蛋白AGEs(AGEs-BSA)及其对照物并将其作用于体外培养的兔视网膜Müller细胞,采用免疫细胞化学(ICC)方法 半定量检测不同时间点(1d、3d、6d、9d)Müller细胞bFGF表达变化.利用外源性bFGF(0.1、1.0、10.0、50.0、100.0)ng/mL干预Müller 细胞,采用ICC方法 半定量检测不同时间点(1d、3d、6d、9d)M üller细胞VEGF的表达变化.结果 AGEs作用下兔视网膜M üller细胞bFGF的表达增高(P<0.05或P<0.01)且具有一定的时间和浓度依赖性.外源性bFGF可上调视网膜M üller细胞VEGF的表达,且具有一定的浓度依赖性及时限性.结论 AGEs可以上调视网膜Mü ller细胞表达bFGF,而bFGF可以上调Müller细胞表达VEGF,推测AGEs可能通过增加bFGF的表达,以及通过分泌的bFGF间接促进VEGF的表达,从而在DR形成过程中起重要作用.

Abstract：

Objective To investigate the effect of advanced glycosylation end products (AGEs) on expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) in rabbit retinal Müller cells, also the effect ofbFGF on expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in rabbit retinal Müller cells in vitro. Methods Rabbit retinal Müller cells were cultured first, then AGEs-BSA and its control were prepared. Müller cells were treated with 5 different concentration series of AGEs-BSA and AGEs-BSA control for 1, 3, 6 and 9 days, while blank control group was incubated without any intervention. Then bFGF expression in Müller cells was half-quantitatively identified by immunocytochemistry (ICC). Cultured rabbit Müller cells were also treated with bFGF of 5 concentrations (0.1, 1.0, 10.0, 50.0, 100.0) ng/mL for 1, 3, 6, 9 days, while blank control group was incubated without any intervention. Then VEGF expression in Müller cells was half-quantitatively identified by ICC. Results Comparing with control group, AGEs-BSA evoked a time and concentration-dependent increase ofbFGF expression on cultured retinal Müller cells (P ＜0. 05 or P ＜0. 01). And comparing with blank control group, bFGF also evoked a time and concentration-dependent increase of VEGF expression on retinal Mi ller cells in a certain range. Conclusions AGEs up-regulates the expression ofbFGF, which can up-regulate the expression of VEGF in Müller cells. These results indicate that AGEs might promote the progress of DR.     

牛磺酸对高糖刺激大鼠视网膜Müller细胞GLAST和GS表达的影响

目的:通过检测牛磺酸对高糖刺激大鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运蛋白(glutamate-aspartate transporters,GLAST)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)表达的影响,探讨牛磺酸保护糖尿病引起视网膜损伤的机制。方法:高糖培养大鼠视网膜Müller细胞,分正常对照组(NC)、高糖组(high glucose,HG,25mmol/L)、高糖 0.1mmol/L牛磺酸(taurine,T)干预组(HG 0.1T)、高糖 1mmol/L牛磺酸干预组(HG 1T)、高糖 10mmol/L牛磺酸干预组(HG 10T)。用免疫荧光化学法和Western-blotting检测大鼠视网膜Müller细胞中GLAST和GS的表达。结果:高糖培养后,大鼠视网膜Müller细胞中GLAST和GS的表达明显减少(P<0.05),与高糖组相比,1mmol/L和10mmol/L牛磺酸干预可明显增加GLAST和GS的表达(P<0.05)。结论:牛磺酸增加Müller细胞中GLAST和GS的表达抑制糖尿病引起的视网膜Müller细胞功能改变。     

高糖对体外培养的视网膜Müller细胞表达蛋白转录活化因子4的影响

目的 观察高糖对体外培养的视网膜Müller细胞表达蛋白转录活化因子4(ATF4)的影响.方法 组织块悬浮法体外原代培养Sprague-Dawley(SD)大鼠视网膜Müller细胞,用链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物(SABC)法对Müller细胞进行神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及谷氨酰胺合成酶(GS)的鉴定.将培养的视网膜Müller细胞分为正常对照组和A、B、C组,正常对照组使用5.5 mmol/L葡萄糖培养液,A、B、C组分别使用20.0、30.0、40.0 mmol/L葡萄糖培养液进行.培养4d后,蛋白免疫印迹(Western blot)法检测各组视网膜Müller细胞上ATF4蛋白的表达.结果 体外培养的细胞均为视网膜Müller细胞,95％以上细胞染色呈GFAP及GS阳性.A、B、C组视网膜95％的Müller细胞呈阳性.Western blot检测显示,4d后A、B、C组Müller细胞表达ATF4蛋白的量均较正常对照组升高,组间比较,差异有统计学意义(q＝0.293、0.754、0.484,P＜0.05).结论 高糖能促使体外培养下的视网膜Müller细胞表达内质网应激蛋白ATF4增加,高糖培养下的视网膜Müller细胞可发生内质网应激反应.     

色素上皮衍生因子对高糖环境下视网膜Müller细胞钾离子通道Kir4.1的调控

目的 探讨高糖环境下视网膜Müller细胞钾离子通道Kir4.1的表达改变及色素上皮衍生因子(PEDF)对Kir4.1的调控及可能机制.方法 培养的大鼠Müller细胞随机分为对照组、高糖组、PEDF干预组和干预对照组.其中,对照组使用5 mmol/L葡萄糖的培养液,高糖组使用25 mmol/L葡萄糖的培养液,PEDF干预组在25 mmol/L葡萄糖的培养液中加入100 ng/ml PEDF,干预对照组在25 mmol/L葡萄糖的培养液中只加入相同容积的磷酸缓冲盐溶液.通过蛋白免疫印迹法和实时荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组Müller细胞Kir4.1表达的改变,同时采用二氯二氢荧光素二已酯荧光法检测各组细胞中氧自由基(ROS)生成;实时荧光RT-PCR法检测脂质过氧化物酶(GPx)的表达变化.结果 蛋白免疫印迹法和实时荧光RT-PCR法检测结果提示,高糖可以降低视网膜Müller细胞Kir4.1的表达(蛋白免疫印迹法:t=3.53,P＜0.05;实时荧光RT-PCR法:t=4.12,P＜0.05),同时引起ROS生成增多(t=3.76,P＜0.05)以及GPx表达下降(t=3.18,P＜0.05).PEDF处理后,高糖状态下视网膜Müller细胞的Kir4.1表达显著上升(蛋白免疫印迹法:t=6.43,P＜0.01;实时荧光RT-PCR法:t=3.66,P＜0.05),同时使ROS浓度下降及GPx表达升高(t=4.11,P＜0.05;t=5.12,P＜0.01).结论 高糖可以通过诱发氧化应激从而使Müller细胞Kir4.1的表达下调,PEDF能改善由高糖诱发的这一变化.     

重组人促红细胞生成素对高糖视网膜Müller细胞谷氨酰胺合成酶表达的影响

目的 观察体外培养大鼠视网膜Müller细胞在高糖培养环境下谷氨酰胺合成酶(GS)的表达变化,探讨重组人促红细胞生成素(rhEPO)对其表达的影响及作用机制.方法 出生后3～5 d新生Sprague-Dawley大鼠10只,摘除眼球分离视网膜,经胰酶消化后分离纯化视网膜Müller细胞.并将其随机分为正常对照组、高糖培养组、高糖+5U/ml rhEPO组、高糖+10 U/ml rhEPO组、高糖+20 U/mlrhEPO组、高糖+40 U/ml rhEPO组.48 h后原位缺口末端标记法检测高糖及不同浓度rhEPO对视网膜Müller细胞凋亡的影响;免疫细胞化学法半定量检测高糖组在不同浓度rhEPO干预下视网膜Müller细胞GS蛋白的表达水平.结果 与正常对照组比较,高糖培养组视网膜Müller细胞活性下降,细胞大量凋亡,GS蛋白表达下降,差异有统计学意义(t=27.4,P＜0.0l).与高糖培养组比较,不同浓度rhEPO处理组凋亡细胞随着rhEPO浓度的增加显著性减少,差异有统计学意义(t=857.2、2 374.6、2 473.2、2 537.7,P＜0.01),GS蛋白的表达显著性升高,差异有统计学意义(t=3.2、18.0、22.5、26.4,P＜0.05).结论 rhEPO对高糖作用下视网膜Müller细胞的凋亡具有保护作用,并可上调高糖损伤细胞内下降的GS蛋白表达水平;促进谷氨酸循环,有效降低高浓度谷氨酸的兴奋性毒性作用,可能是其抗高糖损伤的保护机制之一.     

紫杉醇对视网膜Müller细胞的影响

目的:探究抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)对Müller细胞增殖、凋亡、细胞周期、细胞形态与相关蛋白表达的影响以研究其对视网膜的潜在毒性。方法:体外培养Müller细胞并分成两组：对照组(正常培养基)、加药物组(PTX)。不同浓度PTX(0.005、0.05、0.5、5mg/L)处理视网膜Müller细胞12、24、36、48、72h, CCK8法检测不同浓度PTX、刺激不同时间对Müller细胞增殖的影响;流式细胞术检测不同浓度PTX对Müller细胞凋亡的影响及细胞周期的阻滞作用;免疫荧光观察Müller细胞的形态变化;Western blot及qRT-PCR检测PTX对Müller细胞凋亡相关蛋白表达以及水通道蛋白的影响。结果:PTX可以抑制体外培养的Müller细胞增殖能力,药物浓度越高,刺激时间越久,细胞增殖能力越弱;此外,PTX还能促进Müller细胞的凋亡,越高的药物浓度和更长的刺激时间会导致更高的细胞凋亡率;流式细胞检测细胞周期表明,PTX将Müller细胞阻滞于G2-M期。而细胞形态也由形态清晰、细长纤维状的正常形态趋于圆形,且细胞数量显著减少;药物处理后的细胞炎症因子较对...