神经干细胞与乳鼠基底膜共培养后分化为毛细胞样细胞的研究

目的探讨体外培养和鉴定胚胎大鼠神经干细胞及诱导其分化为毛细胞样细胞。方法从SD系胚鼠大脑分离神经干细胞，在无血清培养基中培养。取乳鼠基底膜与神经干细胞一起培养，14—21天后通过免疫荧光和免疫组化法检测毛细胞标志物myosin VIIa和calretinin。结果培养的神经干细胞胞体透亮，折光性好，Nestin鉴定阳性。诱导分化后的细胞免疫荧光和免疫组化示myosin VIIa和calretinin阳性。结论无血清条件下能培养出活性很好的神经干细胞，乳鼠基底膜能引导其朝毛细胞方向分化。     

完整与分段取材法解剖小鼠耳蜗基底膜的比较

目的对完整与分段取材法解剖小鼠耳蜗基底膜进行比较。方法2019年2—3月,将6只10周龄C57BL/6小鼠以随机数字表法分成2组,分别应用完整取材法及分段取材法进行基底膜取材。应用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽荧光染色方法标记耳蜗毛细胞并进行计数,观察基底膜的完整性以及荧光染色效果。SPSS 19.0软件进行统计学分析。结果两种方法均能完整或分段将基底膜完全剥离,完整取材法耗时明显短于分段取材法,差异有统计学意义[(16.33±1.86)min比(23.66±3.88)min,t=-4.173,P=0.002]。鬼笔环肽荧光染色显示两组基底膜毛细胞均保存完整,完整取材法及分段取材法取得的基底膜全长比较差异无统计学意义[(5.92±0.22)mm比(5.72±0.16)mm,t=1.822,P=0.099]。结论应用两种取材方法均可较快分离基底膜并保持其结构的完整性。操作者可根据技术熟练程度及实验目的选择不同的方法。     

细胞增殖及凋亡与耳蜗感觉上皮的分化

目的观察耳蜗发育中细胞增殖、凋亡的变化规律，探讨它们与耳蜗感觉上皮分化的关系。方法利用透射电镜观察从胚胎第8天到刚出生的C57BL/6小鼠耳蜗感觉上皮的增殖、凋亡及分化的变化。结果胚胎第10天，耳蜗才开始发育；到胚胎第11天耳蜗感觉上皮出现核分裂像并逐渐增多，胚胎第14天时已开始减少；细胞凋亡现象出现在胚胎第13天，从胚胎第14天到胚胎第15天细胞凋亡最明显，后逐渐减少；同时在胚胎第14天毛细胞开始分化形成，到胚胎第16天，Corti器原基形成时，毛细胞和支持细胞形态趋向成熟，但到出生时，Corti器尚未发育成熟。结论细胞增殖和凋亡是耳蜗发育中的必然现象，细胞增殖、凋亡及毛细胞的分化成熟相继发生但又互相重叠；细胞增殖与凋亡的动态平衡在耳蜗感觉上皮分化成熟中起着重要作用。     

蜗内直流电对耳蜗基底膜振动的影响

目的探讨外加直流电流后对耳蜗基底膜振动的影响.方法在豚鼠耳蜗底回距圆窗龛缘2.4mm处开一直径约0.4mm小孔,作为测量活体基底膜的振动速度测试窗.在测试窗上、下缘的鼓阶、前庭阶各开一小孔,将铂-铱电极置入鼓阶、前庭阶作为跨蜗管的电刺激电极.用激光多普勒干涉测速仪观察直流电流对纯音诱发的基底膜振动速度的影响.结果当外加电流前庭阶极性为正,鼓阶极性为负时,可以看到基底膜振动速度显著增大,给相反极性电流时,基底膜振动速度减小.结论生理状态下的正内淋巴电位是耳蜗将声音能量转变为神经冲动的必要条件.适当提高外毛细胞顶端正电位,有助于提高耳蜗放大器的增益.外加负电位则严重影响耳蜗放大器的增益.     

谷氨酸及其受体与耳蜗神经元死亡的关系

谷氨酸(glutamate，Glu)作为耳蜗的传入神经递质，以L-Glu形式在毛细胞、听神经传入活动中起重要作用。当耳蜗内毛细胞(inner hair cell，IHC)释放Glu过多或再摄取不充分时，可导致以传入神经树突水肿为特征的兴奋性损害，伴大幅度听力下降，严重者可因迟发性传入神经元死亡(delayed neuronal death，DND)致不可逆性耳聋。目前已证实，噪声性聋、部分突发性聋、     

小鼠前庭支持细胞诱导人羊水干细胞定向分化为功能性神经元的初步研究

目的探讨通过支持接触共培养模式,小鼠前庭支持细胞体外诱导人羊水干细胞向功能性神经元分化的可行性。方法分离培养人来源的羊水干细胞。从新生C57BL/6J小鼠获取内耳前庭组织,经酶解消化、细胞培养,选取其空心球体,制备单细胞饲养层。将标记慢病毒载体介导产生绿色荧光蛋白nGFP的羊水干细胞种植在饲养层表面,形成支持接触共培养,期间不添加任何外源性神经生长因子及神经元信号诱导因子。检测分化后的羊水干细胞中神经元标记物β微管蛋白(β-Tubulin,Tuj1)、突触后致密蛋白PSD95的表达;标记功能性突触小泡技术(FM1-43穿透)检测分化后细胞是否具有神经元离子通道。同时观察羊水干细胞单独分化、小鼠前庭支持细胞单独分化、Transwell共培养体系中羊水干细胞和饲养层细胞神经元的分化情况。结果单细胞饲养层表达内耳支持细胞特异性标记物细胞周期蛋白激酶抑制因子P27kip1。nGFP标记过的羊水干细胞接种于饲养层后,nGFP表达阳性的部位有(52.0±3.0)%的细胞表达Tuj1,并具有典型的神经元形态特征,突起长度平均(110.7±6.2)μm。饲养层细胞单独分化,仅有(1.1±0.6)%的细胞表达Tuj1阳性且形态典型的神经元;羊水干细胞单独分化,(92.0±1.0)%的细胞表达神经元标记物Tuj1,但无典型的神经元形态特征,突起长度平均(16.0±4.1)μm。将羊水干细胞与饲养层在Transwell中共培养,虽然(92.0±1.0)%的羊水干细胞表达Tuj1,但仍无典型的神经元形态特征,突起长度平均(17.0±4.5)μm,饲养层仅有(1.2±0.9)%的细胞Tuj1表达阳性且具有典型的神经元形态。结论通过支持接触共培养模式,由小鼠前庭来源的内耳支持细胞制备的饲养层,可成功将人羊水干细胞定向诱导分化为功能性神经元。     

重组腺病毒Ad-GFP转染新生小鼠离体耳蜗基底膜的实验分析

目的观察重组腺病毒Ad-GFP转染新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织的情况。方法取新生1～5 d小鼠的耳蜗基底膜,离体培养1 d后,加入重组腺病毒Ad-GFP继续培养1 d,在荧光显微镜及Confocal显微镜下观察病毒对离体耳蜗基底膜的转染情况。结果耳蜗基底膜离体培养1 d后,在显微镜下观察,可见基底膜贴壁生长良好,外周有新生上皮细胞和成纤维细胞长出;高倍显微镜下可见耳蜗内外毛细胞和支持细胞等结构。离体耳蜗基底膜培养组织加入重组腺病毒Ad-GFP继续培养1 d后,可见重组腺病毒Ad-GFP能高效转染新生小鼠离体耳蜗基底膜及其外周长出的新生上皮细胞和成纤维细胞;在新生小鼠离体耳蜗基底膜上,不仅大上皮嵴细胞区域、小上皮嵴细胞区域的细胞能被高效转染,毛细胞也能被高效转染。结论重组腺病毒Ad-GFP能高效转染新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织。     

大鼠单侧耳蜗损毁对耳蜗核中γ-氨基丁酸能神经元的影响

目的:研究大鼠单侧耳蜗损毁前后耳蜗核中γ-氨基丁酸(GABA)能阳性神经元的分布及数量。方法:应用免疫组织化学方法(SP法)行耳蜗核中GABA能阳性神经元分布的检测。结果:耳蜗核中GABA能神经元的体积较小、数量较多、着色很深。单侧耳蜗毁损后耳蜗核中GABA能阳性神经元的数量:术后1～2周术侧明显低于对侧(均P<0.01);术后3周上升,但仍低于对侧(P<0.05);术后1个月,术侧略低于对侧,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:单侧耳蜗损毁前后,GABA能阳性神经元的分布及数量在耳蜗核中呈一明显的动态变化过程,说明GABA能神经元参与了耳蜗毁损后初级听觉中枢的可塑性变化或功能重组的过程,提示GABA能神经元数量的增减可能为初级听觉中枢的重组所必需。     

新生小鼠耳蜗基底膜体外培养的实验研究

目的建立可靠的新生小鼠离体耳蜗基底膜的培养方法,为内耳的研究提供新的条件和模型。方法在显微镜下完整分离出新生1～5 d小鼠的耳蜗基底膜组织,采用组织贴壁法在无血清培养基中进行培养,免疫荧光法检测新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织中毛细胞及螺旋神经元的生长状态。结果新生小鼠耳蜗基底膜离体培养24 h后,显微镜下观察可见基底膜贴壁生长良好,外周有新生上皮细胞和成纤维细胞长出;高倍显微镜下可见耳蜗内外毛细胞和支持细胞等结构;免疫荧光法检测可见毛细胞和螺旋神经元生长良好,并能保持较长一段时间。结论组织贴壁法无血清培养新生小鼠离体耳蜗基底膜是一种理想的耳科实验造模方法。     

化学修饰电极对雏鸡耳蜗神经元一氧化氮的定性检测

目的比较雏鸡和哺乳动物耳蜗生理功能的异同。过去已有哺乳动物耳蜗及前庭神经元中一氧化氮合酶（ＮＯＳ）活动证据的报道，其所释放的一氧化氮（ＮＯ）在听觉和平衡活动中可能发挥重要作用。方法用经化学修饰的碳纤维微电极，定性检测雏鸡离体耳蜗神经元在不同激动剂的诱发下所释放的ＮＯ。根据电极所检测的电流变化的幅度和持续时间判断ＮＯ的释放。结果由激动剂乙酰胆碱和Ｌ精氨酸所诱发的ＮＯ释放反应幅度相似，但乙酰胆碱的高电流持续时间较短，而ＡＴＰ所致者幅度大，持续时间长。预加ＮＧ硝基Ｌ精氨酸，再加上述激动剂，电流无变化。结论雏鸡耳蜗神经元细胞中存在ＮＯＳ。     

人工耳蜗植入与骨髓间充质干细胞移植联合治疗感音神经性耳聋研究进展

感音神经性聋(sensorineural hearing loss,SNHL)是耳科学领域难点及热点问题,内耳毛细胞和螺旋神经元(spiral ganglion neurons,SGNs)的损伤是导致SNHL的主要因素之一,目前治疗SNHL的方法主要有助听器或人工耳蜗植入(cochlear implant,CI),但都无法恢复正常的听觉结构,治疗效果不佳。近年来,有学者提出是否能将干细胞移植与人工耳蜗植入相结合,以实现SGNs损伤修复从而提高人工耳蜗植入的效能,而骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)由于其高扩增潜能,遗传稳定,易于分离培养,低免疫源性和免疫调节功能,近几年成为现代生物学和医学的研究热点,且已被多个临床试验证实具有很大的临床应用潜能,可被应用于组织损伤修复,如心肌梗死、脊柱及脑损伤、软骨及骨损伤。本文将从SGNs数量与人工耳蜗植入效果的关系、BMSCs移植实现SGNs再生或修复几方面进行综述,包括探讨人工耳蜗植入联合干细胞移植面临的治疗难点。