水杨酸钠诱发大鼠听皮层中GABARAP表达的改变

目的 通过检测水杨酸钠诱导耳鸣大鼠听皮层中GABAA受体相关蛋白(GABAA receptor-associated protein,GABARAP)转运蛋白的表达,研究耳鸣大鼠听皮层是否出现GABARAP蛋白表达的改变,探讨GABARAP在耳鸣中的作用机制.方法 126只SD大鼠,随机等分成7组:对照注射、慢性注射7...     

水杨酸钠引起耳鸣大鼠听皮层突触形态改变的透射电镜观察

目的用透射电镜观察水杨酸钠引起耳鸣大鼠听皮层突触形态的变化。方法成年健康雄性白色Wistar大鼠32只,随机平分为2组。第一组腹腔注射水杨酸钠350mg/kg,第二组腹腔注射等量生理盐水,均在每天上午9点注射,持续30天。两组所处饲养环境（包括环境噪声、12小时昼夜节律、饮食等）完全相同。1月后快速处死,取双侧听皮层组织进行透射电镜观察。结果与对照组相比,水杨酸组突触数量明显增加,许多突触形态由平型变成凹型或U型,突触界面曲率增加,突触面积增大,活性区增加,每一活性区的长度增加,突触间隙明显增宽,突触后膜致密物质厚度增加。U型突触直径平均为（1.7±0.23）μm,平直型突触直径平均为（0.53±0.14）μm,二者比较有显著性差异（P〈0.05）。结论水杨酸钠能够引起听皮层突触形态的改变,这种改变与长时程增强现象（Long-term potentiation,LTP）非常相似,有可能是耳鸣与突触可塑性以及与学习记忆相关的有力证据,值得深入研究。     

耳鸣模型大鼠听皮层生长相关蛋白-43和细胞骨架活性调节蛋白的表达

目的检测神经元功能可塑性基因生长相关蛋白-43（growth associated protein,GAP-43）和细胞骨架活性调节蛋白（activity regulated cytoskeleton associated protein,ARC）在水杨酸诱导耳鸣大鼠听皮层中的表达,探讨其在耳鸣产生中的作用。方法将24只白色Wistar大鼠随机分为3组：水杨酸钠组（8只）、生理盐水组（8只）和空白对照组（8只）。前两组从条件反射建立前开始于每次条件反射训练前2小时分别腹腔注射10%水杨酸钠溶液（350mg/kg）和同体积生理盐水,至实验结束,空白对照组不做任何处理。通过行为学方法证实水杨酸钠组动物感受到耳鸣后,利用荧光定量PCR检测动物听皮层中GAP-43和ARC的表达。结果水杨酸钠组大鼠听皮层中GAP-43和ARC蛋白阳性神经元的表达（分别为2.17±0.72、4.90±2.13）明显高于生理盐水组（分别为1.05±0.20、1.13±0.42）和空白对照组（分别为0.96±0.97、1.07±0.70）（P〈0.01）,而生理盐水组和空白对照比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论耳鸣大鼠听皮层中神经元功能可塑性基因GAP-43和ARC蛋白阳性神经元的表达增加,推测它们可能在耳鸣的发生发展中起重要作用。     

脉冲噪声暴露后大鼠听皮层神经颗粒素的表达研究

目的揭示脉冲噪声暴露后不同时期大鼠听皮层神经颗粒素(neurogranin,Ng)表达的变化。方法将50只成年SD大鼠随机分为5组:正常对照组及脉冲噪声暴露后3、7、14、28天组,每组10只。脉冲噪声暴露条件为:平均压力峰值156dB SPL,脉宽为0.25ms,暴露50次,每次间隔6s。于噪声暴露前及噪声暴露后即刻、3、7、14、28天检测各组大鼠ABR反应阈,同时,应用Western blot方法检测各组大鼠听皮层中的Ng的含量。结果与对照组相比,各组大鼠噪声暴露后即刻、3、7、14、28天各频率ABR反应阈均明显提高(P<0.05),噪声暴露后第7天,各频率ABR阈值有所恢复,第14天时趋于稳定;与对照组(0.68±0.08)比较,噪声暴露后第3、7、14天组大鼠听皮层中Ng的含量分别为0.96±0.05、1.11±0.05、0.78±0.04,显著高于对照组,第28天组为0.36±0.03,显著低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论噪声暴露后,大鼠ABR反应阈明显升高,听皮层Ng的表达呈现一个先上升后降低的过程,提示脉冲噪声刺激对大鼠听觉系统产生了一定持续性的影响,听皮层出现突触可塑性变化。     

双侧耳蜗毁损后大鼠听皮层突触素表达的变化

目的观察双侧耳蜗毁损后大鼠听皮层(auditory cortex,AC)突触素表达水平的变化。方法30只SD大鼠随机均分为6组:双侧耳蜗毁损后3、7、14、21、30天组及假手术对照组,每组各5只。双侧耳蜗毁损后不同时间行听皮层突触素二步法免疫组化染色,观察突触素表达的变化。结果双侧耳蜗毁损后3天突触素表达增高,毁损后7天突触素表达较毁损后3天有所下降,毁损后14、21天突触素表达持续上升,21天时上升到最高峰,毁损后30天突触素表达开始下降,除毁损后7天组外,其余各组与假手术对照组差异均有统计学意义。各组左右耳表达差异均无统计学意义。结论大鼠双侧耳蜗去传入损伤后,突触素表达的动态变化反映了听皮层内神经元突触的重塑情况。     

外周听觉活性改变诱导在体听皮层突触NMDA受体表达变化

目的 观察听觉剥夺和耳蜗电刺激对听皮质突触N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-as-partate receptor，NMDAR)表达的影响。方法 经两次不连续梯度超速离心，从初级听皮质提取高度纯化的突触体后，采用Western blotting对耳毒性聋组、听力正常组及电耳蜗内刺激0.5～2h的各实验组听皮质突触体NMDAR三个亚型的表达进行比较。结果 证实了听觉剥夺的成年或发育期大鼠耳蜗电刺激仅仅1.5小时可以诱导突触体NR2A蛋白的显著增加，但NR1和NR2B蛋白量的改变并不显著。结论 在体大鼠的听皮质存在活性依赖的突触的NR2A蛋白的表达。     

大鼠听皮层发育关键期胶质纤维酸性蛋白表达及听功能变化

目的：观察大鼠听觉发育关键期听功能的变化及听皮层星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein ,GFAP）的表达。方法清洁级 SD 大鼠幼鼠50只随机分成出生后第14、21、28、35和42天组,每组10只,分别检测各组大鼠 ABR 反应阈后,采用免疫组化染色方法及 Western blot 检测各组大鼠听皮层 GFAP 的表达。结果大鼠出生后第14、21、28、35、42天组 ABR 平均反应阈分别为84．5±4．97、70．5±3．69、58．5±5．80、37．0±4．83和35．5±3．69 dB SPL,除第35天组与第42天组之外,其余各组两两之间比较差异均有统计学意义（P＜0．05或 P＜0．01）;第14、21、28、35、42天组大鼠听皮层 GFAP 平均累积光密度值（IOD）分别为474．36±234．56、1465．93±474．96、2163．06±353．36、6572．01±808．88和7244．37±932．90,各组间两两相比差异均有显著统计学意义（P＜0．05或 P＜0．01）。第14、21、28、35和42天组大鼠听皮层 GFAP 蛋白表达水平分别为1．00±0．06、3．07±0．07、4．92±0．05、6．88±0．03和8．92±0．04,各组间两两相比差异有统计学意义（P＜0．05）。结论大鼠出生后第14～42天其 ABR 反应阈逐渐下降,GFAP 表达逐渐增强,提示星形胶质细胞可能有促进听皮层及听觉中枢的发育与成熟的作用。     

听觉剥夺后大鼠听皮层神经元的形态学变化和SHP-2基因的表达

目的研究双侧耳蜗毁损后大鼠听皮层神经元细胞的形态学变化和蛋白酪氨酸磷酸酶2型（src-homology domain containing protein tygosine phosphatase type 2,SHP -2）基因的表达。方法选取SD大鼠48只,随机分为4个实验组（2周组、4周组、6周组、8周组）和4个相应的对照组,每组6只。实验组动物行双侧耳蜗损毁术,通过HE染色和Nissl染色观察听皮层神经元细胞的形态学变化,用RT -PCR技术检测各组听皮层神经元细胞的SHP-2基因的表达,行相对定量分析。结果 HE染色和Nissl染色可见各实验组大鼠听皮层神经元细胞的凋亡形态随时间延长而加重,呈多样化表现;各对照组大鼠听皮层细胞形态正常。实验2、4、6、8周组SHP-2基因的RT -PCR相对表达量分别为1．1±0．28、1．5±0．04、2．5±0．08、11．0±0．06,随时间延长呈上升趋势,各实验组之间差异均有统计学意义（P＜0．05）。结论听觉剥夺可导致听皮层神经元细胞凋亡,凋亡的程度随时间延长逐渐加重;SHP-2基因可促进听皮层神经元细胞的增生,增生的程度也随时间延长而加重;在这两个相互拮抗的因素中,凋亡是最终的结果。     

慢性噪声暴露对大鼠听皮层及海马脑区胰岛素样生长因子－1表达的影响

目的：观察慢性噪声暴露后大鼠听皮层及海马脑区胰岛素样生长因子－1（insulin－like growth fac-tor－1,IGF－1）的表达,探讨其在长期噪声性中枢神经系统损伤中的作用。方法成年健康雄性 Wistar 大鼠16只,随机分为噪声组和对照组各8只,噪声组暴露于100 dB SPL 白噪声28天,每天4小时,制成慢性噪声暴露模型,对照组不予任何处理。造模结束后检测两组大鼠 ABR 反应阈,并采用免疫组织化学染色方法检测 IGF－1在听皮层和海马的表达。结果噪声组造模结束后 ABR 反应阈（80．62±4．58 dB SPL）较对照组（38．75±3．54 dB SPL）明显升高（P＜0．05）,听皮层及海马脑区 IGF－1阳性神经元数目和表达强度均较对照组显著增加（P＜0．05）。结论慢性噪声暴露可以使听皮层及边缘系统海马脑区 IGF－1表达增高,这可能与其对中枢神经系统噪声性损伤的保护作用有关。     

水杨酸钠诱导耳鸣大鼠海马中TNF-α、IL-1β的表达北大核心CSCD

目的探讨水杨酸钠诱导耳鸣大鼠海马中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(N-methyl-D-aspartate receptor 2B,NMDAR2B)的表达变化与大鼠耳鸣之间的联系。方法将18只健康成年SD大鼠随机分为三组:对照组(腹腔注射生理盐水)、腹腔注射水杨酸钠14天组(S14组)和腹腔注射水杨酸钠14天后停药恢复7天组(R7组),每组6只。检测各组大鼠造模前和造模结束后的惊跳反射前脉冲抑制(prepulse inhibition,PPI)和听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR);检测后处死大鼠并迅速分离出海马组织,采用荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)和Western Blot检测各组大鼠海马中TNF-α、IL-1β和NMDAR2B的表达。结果①S14组大鼠前脉冲抑制率较对照组显著增加(P<0.001),提示耳鸣模型建立成功;②S14组大鼠的ABR反应阈为51±1.87 dB SPL,较对照组(36.67±1.05 dB SPL)显著升高(P<0.01);R7组大鼠的ABR反应阈为35±1.29 dB SPL,与对照组差异无统计学意义(P>0.05);③S14组大鼠海马TNF-α、IL-1β和NMDAR2B的表达水平较对照组显著升高(P<0.01);与对照组相比,R7组大鼠海马IL-1β的表达水平显著升高(P<0.05),TNF-α和NMDAR2B的表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论腹腔注射水杨酸钠可诱导大鼠产生耳鸣,并可能通过上调大鼠海马区TNF-α、IL-1β和NMDAR2B的表达水平参与耳鸣的发生发展。     

电针听宫和翳风穴对豚鼠听皮层糖代谢及IGF－1表达的影响

目的探讨电针听宫穴和翳风穴对豚鼠听皮层葡萄糖代谢和胰岛素样生长因子-1(insulin like growth factor-1,IGF-1)表达的影响。方法将成年杂色豚鼠18只随机分为3组,电针耳穴组7只,同时电针双侧听宫和翳风穴,持续15分钟,每日1次,共7天;电针非穴位组6只,电针听宫穴靠眼侧方5mm处和翳风穴正下方5mm处,时间同电针耳穴组;对照组5只不作任何处理,常规饲养。各组完成电针后进行PET/CT扫描,获得CT、PET及两者融合图像,观察豚鼠听皮层摄取显像剂18F-脱氧葡萄糖的情况,以听皮层和小脑最大标准摄入值(standard uptake value,SUV)的比值为观察指标;采用实时荧光定量PCR技术检测豚鼠听皮层IGF-1mRNA表达。结果对照组、电针耳穴组、电针非耳穴组听皮层SUV最大值与小脑SUV最大值的比值分别为0.75±0.06、0.84±0.05和0.71±0.06,电针耳穴组高于对照组和电针非耳穴组,(分别为P=0.042,P=0.009);对照组、电针耳穴组、电针非耳穴组听皮层局部IGF-1mRNA相对表达量分别为1.34±0.24、2.03±0.36、0.92±0.23,电针耳穴组高于对照组和电针非耳穴组(分别为P=0.002,P<0.001)。结论电针针刺听宫和翳风穴可增加豚鼠听皮层局部IGF-1的表达,可能通过提高葡萄糖代谢水平促进豚鼠听皮层的功能。     

生长相关蛋白-43在听觉剥夺大鼠听皮层中的表达研究

目的探索听觉系统发育和损伤后修复的神经可塑性的分子机制,探索GAP-43与幼鼠听皮层发育和可塑性的关系;方法应用免疫组织化学方法,检测正常幼鼠(3周龄、4周龄及8周龄大鼠)及耳毒性药物致聋鼠发育的不同阶段(2周2天龄大鼠氨基糖苷类抗生素致聋后5天、12天及40天,即致聋的3周龄、4周龄及8周龄大鼠)GAP-43在听皮层的阳性神经元表达变化;结果发现GAP-43在刚出生大鼠听皮层阳性神经元高表达,随发育表达逐渐降低,出生后3周(NC P3W)的大鼠听皮层平均每高倍视野阳性神经元数为111.50±4.90,出生后4周(NC P4W)为84.17±3.24,出生后8周(NC P8W)为66.67±4.17;耳蜗损伤后早期GAP-43在幼鼠听皮层的表达反应性升高;结论 GAP-43与幼鼠听皮层发育和可塑性密切相关,GAP-43可作为听皮层乃至听觉系统发育和可塑性的重要标志。     

c-fos及NR2A在耳鸣大鼠听皮层中的表达

目的通过检测神经元功能可塑性标记物快反应基因c-fos和N-甲基-D-天门冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR）亚型NR2A在耳鸣大鼠听皮层中的表达探讨听皮层的可塑性变化及其在耳鸣产生中所起的作用.方法将30只白色Wistar大鼠随机分为3组,耳鸣模型组（12只）、生理盐水组（12只）和空白对照组（6只）.注射水杨酸钠造模并用行为学方法证实动物感受到耳鸣后,利用免疫组化技术检测动物听皮层中c-fos和NR2A的表达,并用数字图像分析系统进行分析.结果12只注射水杨酸钠的耳鸣模型组大鼠全部造模成功.c-fos基因的表达产物FOS蛋白主要存在于皮层神经元的胞核,其阳性细胞的数量及所占面积的百分比在耳鸣组显著高于对照组（P值均＜0.01）;NR2A受体主要表达在锥形细胞的胞膜上,其阳性细胞的数量、染色强度和面积百分比均显著强于对照组（P值均＜0.01）.结论耳鸣大鼠听皮层中c-fos和NR2A的表达明显增多,一方面表明神经递质及受体可能参与了耳鸣的发生;另一方面提示耳鸣大鼠听皮层中发生了功能可塑性改变,这种改变可能在耳鸣的发生发展中起重要作用.     

益肾活血通窍法对老化模型大鼠听皮层PEDF和氧化应激的影响

目的 观察益肾活血通窍方对老化模型大鼠听皮层PEDF、GSH、MDA、ROS表达水平的影响。方法 将45只大鼠随机分成空白组、模型组、中药组各15只。空白组腹腔注射生理盐水,模型组、中药组腹腔注射D-半乳糖。空白组、模型组灌服生理盐水,中药组灌服益肾活血通窍方,连续8周。检测各组大鼠听皮层GSH、MDA、ROS、PEDF表达水平。结果 与空白组相比,模型组听皮层MDA、ROS表达程度增高,PEDF、GSH表达程度降低。与模型组相比,中药组听皮层MDA、ROS表达程度降低,PEDF表达程度增高。结论 益肾活血通窍方通过调控PEDF及氧化应激水平起到保护老化模型大鼠听皮层的作用。     

耳鸣大鼠NMDA受体亚型1、2A、2B的表达研究

目的研究耳鸣大鼠听皮层NMDA（N-甲基-D-天冬氨酸,N-methyl-D-aspartate）受体亚型1、2A、2B（NR1、NR2A、NR2B）的表达变化,从而推测其在耳鸣的发生中可能的作用机制。方法按照随机化原则将动物分成3组,每组9只：A组为耳鸣模型组、B组为生理盐水组、C组为空白对照组。A组通过腹腔注射水杨酸钠并用食物抑制法进行验证。造模成功后运用核酸荧光染料SYBR Green实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应）方法检测NMDA受体三种亚型的表达情况。结果NR1在A组的表达显著低于C组（P〈0.05）,NR2A在A组的表达则显著高于C组（P〈0.05）,而A、C两组之间NR2B的表达差异比较无统计学意义（P〉0.05）。NMDA受体三种亚型B、C两组之间表达差异比较均无统计学意义（P〉0.05）。A组NR2A、NR2B与NR1表达量的比值较C组均增大。结论耳鸣大鼠听皮层NMDA受体调节亚基的调控作用增大,突触局部受体蛋白质合成改变,听皮层发生了与NMDA受体相关的可塑性变化,这可能是耳鸣产生的机制之一。     

C57BL/6J小鼠初级听皮层神经元凋亡与caspase-3表达的年龄相关性改变

目的探讨不同月龄C57BL／6J小鼠初级听皮层中caspase3的表达及初级听皮层神经元凋亡情况,探讨两者之间的关系以及caspase--3、凋亡在老年性聋发生、发展中的作用。方法分别选取2月龄（15～20克）和10月龄（45～60克）C57BL／6J小鼠各15只,免疫组织化学法染色检测两组C57BL／6J小鼠初级听皮层caspase-3的表达情况,末端转移酶介导的原位缺口末端标记染色（TUNEL）技术检测两组小鼠初级听皮层神经元凋亡状况。结果与2月龄组C57BI．／6J小鼠相比,10月龄组C57BL／6J小鼠初级听皮层中caspase-3的表达显著增多,初级听皮层神经元凋亡数目明显增多（P值均〈0．01）,且caspase-3的表达与神经元的凋亡呈正相关（r=0．5202）。结论caspase3的表达可能在老年性聋的发生、发展过程中起重要作用,它参与了小鼠初级听皮层神经元的凋亡调控过程,可能是老年性聋的发病机制中一个重要因素。     

MUC5AC和TNF-α在大鼠急性分泌性中耳炎模型中的表达变化

目的研究MUC5AC(黏蛋白MUC5AC)和TNF-α(肿瘤坏死因子-α)在大鼠中耳炎黏膜的表达变化。方法40只SD大鼠随机分为对照组10只、实验组30只;实验组建立大鼠急性分泌性中耳炎模型,采用q PCR检测MUC5AC及TNF-α在第1天,第3天,第7天两组中耳黏膜的表达变化,并用免疫组织化学染色技术分别检测MUC5AC和TNF-α在第1天,第3天,第7天在中耳黏膜的表达变化。结果在对照组中,MUC5AC不表达,TNF-α轻度表达,实验组从第1天到第3天MUC5AC及TNF-α的表达随着时间的延长而增强,至第7天则表达开始减弱,实验组与对照组的比较差别具有统计学意义(P<0.05)。结论 MUC5AC和TNF-α在大鼠急性分泌性中耳炎黏膜中表达上调,且与时间相关。     

罗布麻宁减轻D-半乳糖诱导的老化大鼠听皮层线粒体氧化损伤

目的研究NADPH氧化酶抑制剂罗布麻宁(Apocynin, APO)对D-半乳糖诱导的老化大鼠听皮层线粒体氧化损伤的作用。方法 36只1月龄雄性Sprague-Dawley大鼠适应性喂养1周后随机分为3组(每组12只):①对照组:大鼠颈背部皮下注射生理盐水,每日1次,连续8周;②D-半乳糖组:大鼠颈背部皮下注射500mg/kg D-半乳糖,每日1次,连续8周;③D-半乳糖+罗布麻宁组:大鼠颈背部皮下注射500mg/kg D-半乳糖+腹膜内注射50mg/kg罗布麻宁,每日1次,连续8周。我们利用酶化学法检测H2O2、总超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase, T-SOD)活性、ATP和线粒体膜电位水平,利用免疫组织化学法检测DNA氧化损伤标记物8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-hy?droxy-2-deoxyguanosine, 8-OHdG),利用透射电子显微镜观察听皮层线粒体超微结构。结果和对照组相比较,D-半乳糖组大鼠听皮层H2O2和8-OHdG水平显著增加,而T-SOD活性、ATP和线粒体膜电位水平则显著降低。和D-半乳糖组相比较,D-半乳糖+罗布麻宁组大鼠听皮层H2O2和8-OHdG水平显著降低,而T-SOD活性、ATP和线粒体膜电位水平则显著增加。同时,我们也观察到罗布麻宁可有效保护D-半乳糖诱导的老化大鼠听皮层线粒体超微结构。结论罗布麻宁可有效保护中枢听觉系统老化过程中线粒体氧化损伤。