脓毒症患者外周血祖细胞和内皮祖细胞数量的变化

目的 检测脓毒症患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuelear cell,PBMC)中祖细胞和血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)相对数量的变化,探讨感染性休克和非休克患者外周血EPC变化的特点.方法 收集2007年8月至2008年2月复大学附属中山医院急诊科收治的脓毒症患者27例进行前瞻性研究,其中感染性休克患者12例、非休克患者15例,另选10例健康成年人作为正常对照,ICU非脓毒症患者10例作为ICU对照.Ficoll梯度离心法分离外周血PBMC,通过流式细胞仪检测外周血PBMC标记的CDl33,CIY34和血管内皮牛长因子受体-2(vascular endothelialgrowth factor receptor-2.VEGFR-2)的表达情况,计算祖细胞以及内皮祖细胞的相对数量.组间比较采用单因素方差分析.结果 健康成年人外周血祖细胞、EPC数量较少,分别占PBMC的0.25%.4-0.14%和0.09%.4-0.02%;ICU非脓毒症患者祖细胞和EPC数量分别占PBMC的0.38%.4-0.29%和0.12%.4-O.02%,与正常对照组相比无明显的变化(P>0.05);脓毒症非休克组患者外周血祖细胞、EPC的数量明显增加,分别占PBMC的0.57%±0.12%和0.22%±0.10%,与正常对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05);感染性休克患者外周血祖细胞和EPE的数量明显减少,分别占PBMC的0.20%.4-0.12%和0.04%±O.01%,与非休克组、ICU对照组和正常对照组相比差异均具有统计学意义(P相似文献   

猪外周血内皮祖细胞的体外分离培养及鉴定

背景:内皮祖细胞是一种能直接分化为血内皮细胞的前体细胞,研究表明猪的心血管解剖结构较其他低等哺乳动物更接近于人类,用其建立心血管疾病模型更具临床意义.目的:拟在体外建立猪外周血内皮祖细胞的分离培养方法.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-09/2008-05在美国纽约州布法罗大学心血管疾病研究中心和首都医科大学病理生理学教研室完成.材料:12周龄健康成年猪6只,由布法罗大学实验动物中心提供.方法:采集猪外周血,以梯度密度离心法分离血单核细胞,按3×107/孔密度接种于预先包被Ⅰ型鼠尾胶原的6孔培养板,每孔加入EGM-2内皮细胞生长培养液2 mL,贴壁法纯化扩增,取传至第2代细胞用于指标检测.主要观察指标:采用免疫荧光染色和流式细胞仪检测内皮祖细胞表面抗原的表达,通过内吞DU-acLDL和Matrigel血管形成实验进行细胞功能学鉴定,将第2～10代细胞按500个/孔接种后检验其克隆形成能力.结果:猪外周血单核细胞体外培养7～10d后,出现呈铺路石样的细胞克隆,表达内皮祖细胞表面抗原CD9,CD31,CD105,VE-Cadherin,VEGFR2和内皮源性一氧化氮合酶,部分细胞表达干细胞标志c-Kit,但不表达CD133和造血祖细胞标志CD45.细胞能内吞Dil-acLDL,在Matrigel上可以形成毛细血管样结构,且具有很强的克隆形成能力.第2,4,6,8,10代细胞克隆数及内皮祖细胞总数均基本相似(F=0.167,F=0.195,P>0.05).结论:梯度密度离心联合贴壁法可成功从猪外周血中分离培养出内皮祖细胞,体外扩增后细胞增殖能力无变化.     

人外周血内皮祖细胞培养方法的建立

背景:成人外周血来源丰富,但内皮祖细胞含量较少,为使其能够更好的应用于组织工程及细胞治疗,有必要建立外周血内皮祖细胞成熟、稳定的体外扩增体系.目的:建立稳定的人外周血分离、培养和体外扩增血管内皮祖细胞的方法.方法:应用密度梯度离心法,获取外周血单个核细胞,将分选后细胞接种于预先包埋了人纤维连接蛋白的培养板上,加入内皮祖细胞专用培养基中培养3d 后,洗掉非贴壁细胞,培养至第6 天,收集贴壁细胞,应用倒置显微镜和苏木精-伊红染色进行细胞形态学观察;采用MTT 法和细胞计数测定第1,3 代细胞生长曲线;应用流式细胞仪测定祖细胞和内皮细胞系标志,对培养的细胞进行鉴定.结果与结论:细胞生长曲线测定表明接种后第3 天细胞进入指数增生期,至第6 天进入平台期,随着传代次数的增加,细胞增殖速度变慢,同时表达干细胞表面标志CD34、CD133 和内皮细胞表面标志血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体2.证明人外周血可以分离培养内皮祖细胞.     

人外周血内皮祖细胞培养方法的建立

背景：成人外周血来源丰富,但内皮祖细胞含量较少,为使其能够更好的应用于组织工程及细胞治疗,有必要建立外周血内皮祖细胞成熟、稳定的体外扩增体系。目的：建立稳定的人外周血分离、培养和体外扩增血管内皮祖细胞的方法。方法：应用密度梯度离心法,获取外周血单个核细胞,将分选后细胞接种于预先包埋了人纤维连接蛋白的培养板上,加入内皮祖细胞专用培养基中培养3d后,洗掉非贴壁细胞,培养至第6天,收集贴壁细胞,应用倒置显微镜和苏木精-伊红染色进行细胞形态学观察;采用MTT法和细胞计数测定第1,3代细胞生长曲线;应用流式细胞仪测定祖细胞和内皮细胞系标志,对培养的细胞进行鉴定。结果与结论：细胞生长曲线测定表明接种后第3天细胞进入指数增生期,至第6天进入平台期,随着传代次数的增加,细胞增殖速度变慢,同时表达干细胞表面标志CD34、CD133和内皮细胞表面标志血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体2。证明人外周血可以分离培养内皮祖细胞。     

利用自体血清培养人外周血内皮祖细胞

背景:传统方法培养人外周血来源内皮祖细胞操作复杂,费用大,细胞获得率较低。目的:利用自体血清培养人外周血来源内皮祖细胞,并鉴定其功能。方法:采用密度梯度离心法从人外周血分离得到单个核细胞,体外培养分化为内皮祖细胞。按培养基条件不同分为EGM-2MV组、添加自体血清组(M199+体积分数10%自体血清+胰岛素样生长因子)、添加胎牛血清组(M199+体积分数10%胎牛血清+血管内皮细胞生长因子+碱性成纤维细胞生长因子+胰岛素样生长因子+表皮生长因子)。观察内皮祖细胞增殖、迁移能力;采用细胞形态观察、双荧光染色法及流式细胞仪等技术对培养的内皮祖细胞进行鉴定。结果与结论:培养第7天,EBM-2MV组和添加自体血清组细胞增殖能力和迁移率都优于添加胎牛血清组(P<0.05)。每组细胞经结合Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素双色荧光染色鉴定后双阳性率>80%,免疫细胞化学检测显示每组细胞CD133,CD34和KDR的表达均为阳性。证实在M199培养液中添加自体血清是一种简单、高效的培养内皮祖细胞方法。     

人外周血内皮祖细胞移植治疗缺血性心脏病研究进展

缺血性心脏病(ischemic heart disease，IHD)是由于冠脉循环改变引起冠脉血流和心肌需求之间不平衡而导致的心肌损害，其中最常见的原因是冠心病，约占90％。IHD是严重危害人民健康的多发病和常见病，是慢性心力衰竭的主要原因。传统的治疗IHD的主要手段是重建血供，而不能修复损伤和坏死的心肌。     

大鼠骨髓与外周血来源内皮祖细胞生物学特性比较

背景：内皮祖细胞不仅参与胚胎血管生成,也参与出生后血管发生和血管内膜损伤后修复,对治疗缺血性疾病意义重大,但目前对内皮祖细胞的分离、培养、鉴定还存在争议。目的：体外分离、培养大鼠骨髓与外周血来源的内皮祖细胞,并比较其生物学特性。方法：密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓和外周血单个核细胞,接种于纤维连接蛋白铺被的培养瓶中贴壁培养,用加入血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子的完全培养基诱导培养,对获得的贴壁细胞进行细胞形态学,免疫细胞化学染色,流式细胞仪,透射电镜,以及Dil-acLDL、FITC-UEA-1双荧光染色法检测。结果与结论：骨髓来源的内皮祖细胞数量多,集落状生长,增殖能力强;外周血来源的内皮祖细胞数量较少,散在生长,消化后能贴壁但不能传代。两种不同来源的内皮祖细胞免疫细胞化学检测贴壁细胞CDl33、CD34、FIk-1、Ⅷ因子在不同时段呈阳性表达;激光共聚焦显微镜观察,Dil-acLDL、FITC-UEA-1均为双染。透射电镜检查外周血来源的内皮祖细胞发现W-P小体。提示大鼠骨髓和外周血均能分离培养出内皮祖细胞,但前者是早期内皮祖细胞,后者为晚期内皮祖细胞,两者生物学特性各不相同。     

成人外周血单个核细胞体外培养过程中分化为早及晚期内皮祖细胞生物学表征

目的:观察成人外周血来源的单个核细胞在体外培养过程中形态、增殖能力和表面抗原的变化。方法:实验于2006-08/2007-02在广州南方医院完成。①实验材料:健康志愿者肘静脉血20份,年龄20～26岁,对本实验均知情同意。②实验方法:密度梯度离心健康成人肘静脉血得到单个核细胞,以(2～3)×106/cm2的密度接种于人纤维连接蛋白包被的6孔板,在含有人血管内皮细胞生长因子的M199培养基中进行培养,第4天首次换液,后每3d换液一次。③实验评估:第3天起观察细胞的形态及数量,分别对培养至第7,21天的贴壁细胞行流式细胞学分析及免疫组化染色检查。结果:①培养细胞的形态学观察:外周血来源单个核细胞接种后约有1/20贴壁,第4天左右可形成从中心向外放射的典型细胞集落,第7天有大量长梭形、双极针样细胞生长。培养第2周长梭形细胞开始凋亡,数量减少,同时出现大量椭圆形鹅卵石样细胞。至第3周鹅卵石样细胞已占据生长优势且增殖旺盛,长梭形细胞基本消失。②内皮祖细胞表面标志的变化:原代培养第7天,贴壁细胞表达与单核巨噬细胞系相关的表面抗原CD44(96.3%)、CD45(83.9%)、CD11c(63.7%)、CD14(11.9%),弱表达内皮细胞相关抗原flk-1(18.2%)、CD31(6.7%)、vWF(3.6%);第21天CD44表达下降至57.6%,而内皮细胞相关抗原CD31表达增加至67.2%,vWF增加至14.2%;造血干细胞相关抗原CD34始终呈阴性表达。免疫组化染色结果与流式细胞分析结果一致。结论:成人外周血中存在两种不同类型的血管内皮前体细胞,单个核细胞贴壁培养4～7d左右出现早期内皮祖细胞,2～3周时出现晚期内皮祖细胞。二者的外形、增殖潜能、表面抗原表达均不同。晚期内皮祖细胞是更好的种子细胞来源。     

肝细胞生长因子对体外培养冠心病患者外周血内皮祖细胞生物学功能的影响

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)对体外培养冠心病患者外周血内皮祖细胞(EPCS)生物学功能的影响。方法选取2014年1月至2014年9月就诊的冠心病患者16例作为研究组,同时期未患有冠心病的健康体检者16例作为对照组。每组又均再随机分为HGF组和非HGF组。观察并比较两组患者外周血中CD133+细胞数量、血浆中HGF含量以及EPCS生物学功能。结果研究组患者CD133+细胞数量显著低于对照组患者(P0.05);研究组患者HGF含量显著高于对照组患者(P0.05)。研究组非HGF干预增殖能力吸光度、粘附细胞数和迁移细胞数均显著低于对照组非HGF干预组(均P0.05)。研究组患者中HGF干预组增殖能力吸光度、粘附细胞数和迁移细胞数均显著高于非HGF干预组(均P0.05)。对照组患者HGF干预组增殖能力吸光度显著高于非HGF干预组(P0.05),粘附细胞数和迁移细胞数比较差异均无统计学意义(均P0.05)。结论 HGF可显著增强冠心病患者外周血中EPCs增殖、粘附和迁移等生物学功能。     

紫绀型先天性心脏病患儿外周血内皮祖细胞的体外分离培养和鉴定

背景:一些基础研究成果对于新生血管形成和内皮祖细胞的自动募集机制已做出了合理的解释,体外培养的内皮祖细胞可分化为成熟的内皮细胞,有助于血管内皮修复。目的:拟建立从紫绀型先天性心脏病患儿外周血获取内皮祖细胞的方法。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-08/2008-04在中南大学湘雅二医院完成。材料:外周血来源于2007-10/12中南大学湘雅二医院胸外科收治的15例法洛四联症患儿,安静状态下末梢氧饱和度为(78.0±5.0)%。方法:采用Ficoll密度梯度离心法从外周血中分离单个核细胞,以含体积分数为0.2的胎牛血清、4mg/L牛脑垂体提取物、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL氨苄青霉素、100g/L硫酸链霉素的M199培养基进行体外诱导分化,调整细胞密度为2×109L-1,接种至预铺人纤维连接蛋白的6孔培养板,置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下,贴壁法纯化培养10d。主要观察指标:细胞形态和生长情况,Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白/FITC标记的荆豆凝集素双荧光染色鉴定结果,vWF、CD34及CD31免疫组化鉴定结果,PE标记CD133抗体与藻蓝蛋白标记KDR抗体免疫荧光鉴定结果,透射电镜观察内皮祖细胞特征细胞器。结果:接种后0.5h细胞贴壁生长,培养第7天形成典型的细胞集落,第14天呈铺路石样外观,细胞数量级可达108。培养第10天,贴壁细胞中70%呈Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白/FITC-UEA-Ⅰ双阳性,为正在分化的内皮祖细胞;vWF、CD34及CD31免疫组化染色均呈阳性表达;PE标记CD133抗体呈红色荧光,藻蓝蛋白标记KDR抗体呈蓝色荧光。透射电镜可见内皮祖细胞特征性幼稚线粒体及Weibel-Palade小体。结论:实验成功从紫绀型先天性心脏病患儿外周血中分离培养并获取高纯度的内皮祖细胞,且在体外稳定快速扩增。     

人外周血内皮祖细胞的培养与鉴定

目的:探讨人外周血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法,为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打基础。方法:实验于2004-09/2005-05在解放军第四军医大学西京医院肝胆外科实验室完成。采集献血员抗凝外周血,经Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,在含有体积分数为0.1胎牛血清、20μg/L的血管内皮细胞生长因子和4μg/L的碱性成纤维细胞生长因子的M199培养液中培养和扩增,分别在培养的第6和14天,流式细胞仪检测其KDR,CD133,CD34和vWF阳性率,并通过检测其对异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素的吸附和内吞DiI-acLDL来进行细胞功能学的鉴定。结果:①人外周血单个核细胞经体外诱导分化,培养第6天的贴壁细胞表达KDR,CD133,CD34和vWF,流式细胞仪检测其阳性率分别为(46.4±9.3)%、(33.8±11.7)%、(73.5±6.3)%和(38.9±8.2)%,能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL。②培养第14天的贴壁细胞表达KDR,CD34和vWF,不表达CD133,流式细胞仪检测其阳性率分别为(81.5±7.6)%、(88.9±5.4)%和(78.3±13.6)%,能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL。结论:外周血来源的单个核细胞在一定的培养条件下可以分化为内皮祖细胞,为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打下基础。     

人外周血内皮祖细胞的培养与鉴定

目的：探讨人外周血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法，为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打基础。 方法：实验于2004-09／2005-05在解放军第四军医大学西京医院肝胆外科实验室完成。采集献血员抗凝外周血，经Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞，在含有体积分数为O．1胎牛血清、20μg/L的血管内皮细胞生长因子和4mg/L的碱性成纤维细胞生长因子的M199培养液中培养和扩增，分别在培养的第6和14天，流式细胞仪检测其KDR，CDl33，CD34和vWF阳性率，并通过检测其对异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素的吸附和内吞、DiI-aeLDL来进行细胞功能学的鉴定。 结果：①人外周血单个核细胞经体外诱导分化，培养第6天的贴壁细胞表达KDR，CDl33，CD34和vWF，流式细胞仪检测其阳性率分别为（46．4&;#177;9．3）％、（33．8&;#177;1l、7）％、（73．5&;#177;6、3）％和（38．9&;#177;8、2）％，能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-aeLDL。②培养第14天的贴壁细胞表达KDR，CD34和vWF，不表达CDl33，流式细胞仪检测其阳性率分别为（8l、5&;#177;7、6）％、（88．9&;#177;5．4）％和（78、3&;#177;13．6）％，能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-aeLDL。 结论：外周血来源的单个核细胞在一定的培养条件下可以分化为内皮祖细胞，为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打下基础。     

大鼠外周血单个核细胞体外向内皮细胞诱导分化时的表型变化

背景:内皮祖细胞在贴壁分化过程中其干细胞标记以及内皮细胞表型的变化过程将有助于了解内皮祖细胞的分化特性.但日前还未找到区别于成内皮细胞特异性的细胞标记.目的:观察大鼠外周血单个核细胞外分化为内皮细胞的过程中干细胞标志物以及内皮细胞表型的变化.设计、时间及地点:细胞观察实验,2004 06/2008-12在青岛市市立医院心脏外科实验室完成.材料:抽取雄性SD大鼠外周血,应用Ficoll 密度梯度离心的方法获得单个核细胞.方法:单个核细胞体外培养于纤连蛋白处理的培养皿中,同时应用血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导,使之向内皮细胞转化. 主要观察指标:以免疫组织化学方法检测细胞CD31、CD34、Flk-1、vWF在第1～7大的表达.结果:贴擘细胞的0D31、CD34、FIk-1、vWF在不同时段呈不同程度的表达.干细胞标志物CD31、CD34在培养的第2天开始表达,第4天最强,以后逐渐弱,第6天消失.而Flk-1在第3天开始表达,以后逐渐增强,第7天时最强.vWF表达是逐步出现的,第7天时表达为100%.结论:大鼠外周血干细胞向内皮祖细胞分化的过程中,干细胞标志物逐渐消失,内皮细胞的表型逐步出现.     

外周血内皮祖细胞移植对肢体缺血的改善作用

背景:内皮祖细胞移植为肢体缺血的治疗提供了新的选择。目的:研究人外周血来源内皮祖细胞移植对改善肢体缺血的作用。方法:采用Ficoll密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞,体外诱导扩增6d后,检测其内皮祖细胞特异性标志的表达,并将荧光染料标记后的贴壁细胞通过缺血局部多点注射移植到后肢缺血的裸鼠动物模型体内,以评价其治疗效果。结果与结论:从人外周血单个核细胞诱导出的贴壁细胞可表达内皮祖细胞特异性标志物CD133、CD34和血管内皮生长因子受体2,说明从人外周血单个核细胞中可诱导出内皮祖细胞。移植内皮祖细胞后裸鼠缺血后肢的坏死情况和毛细血管密度均明显改善(P<0.05);在缺血后肢肌肉石蜡切片中可见分散不均的红色和黄绿色荧光标记的内皮祖细胞的掺入。表明移植的内皮祖细胞可以定向整合到缺血局部,改善裸鼠的后肢缺血。     

犬外周血淋巴管内皮祖细胞的分选及其向内皮细胞的诱导分化研究

目的研究犬外周血中CD34^＋／CD133^＋／VEGFR-3^＋淋巴管内皮祖细胞的生物学特征，探讨血管内皮生长因子-C（VEGF-C）／血管内皮生长因子受体3（VEGFR-3）信号途径在淋巴管内皮祖细胞向淋巴管内皮细胞分化中的作用。方法用密度梯度离心法从犬外周血分离单个核细胞，再用流式细胞仪从单个核细胞分选VEGFR-3^＋细胞。通过VEGF-C诱导使VEGFR-3^＋细胞向内皮细胞分化。在扫描电镜和透射电镜下观察细胞表面形态和超微结构，并在共聚焦激光扫描显微镜下观察特征性标志物的表达。结果VEGFR-3^＋细胞同时表达CD34和CD133。经流式细胞仪分析，外周血单个核细胞中CD34^＋／VEGFR-3^＋细胞的含量约为0.13％，VEGFR-3^＋／CD133^＋细胞的含量约为0.08％。CD34^＋／CD^33^＋／VEGFR-3^＋细胞的体积较大，直径约为15μm。经VEGF-C诱导后，细胞数目增多。细胞变为梭形，伸出板状伪足和许多丝状伪足。诱导后1周，细胞表达血管性血友病因子。诱导后2周，细胞表面出现小凹，细胞内可见Weibel-Palade小体。细胞表达淋巴管内皮细胞特异性标志物LYVE-1，CD133标志消失。结论在VEGF-C诱导作用下，外周血中的CD34^＋／CD133^＋／VEGFR-3^＋淋巴管内皮祖细胞能向淋巴管内皮细胞分化。VEGF-C／VEGFR-3信号途径在淋巴管内皮祖细胞的分化过程中起着重要作用。     

大鼠骨髓和外周血早晚期内皮祖细胞的分离培养和鉴定

背景：旨在从大鼠外周血及骨髓中提取内皮祖细胞,培养晚期内皮祖细胞,为干细胞移植治疗或通过内皮祖细胞联合基因治疗使内皮祖细胞高表达血管新生诱导因子,达到促进缺血性脑血管病血管新生的目的。目的：从大鼠骨髓及外周血中分离出内皮祖细胞并对其进行鉴定。方法：使用密度梯度离心及贴壁筛选法从大鼠骨髓和外周血中分离获得单个核细胞,进行诱导培养,观察并记录贴壁细胞的生物学特征;选取内皮祖细胞特异性表面标志CDl33、CD34、KDR对原代细胞进行免疫荧光检测,利用流式细胞学技术检测KDR、CD34表达,并通过吞噬功能实验进～步鉴定培养细胞。结果与结论：大鼠骨髓和外周血能够分离获得早晚期内皮祖细胞;贴壁细胞免疫荧光检测CD34、CDl33、KDR表达阳性;流式细胞学检测CD34、KDR表达阳性;贴壁细胞能够吞噬ac—LDL,结合UEA-1。实验成功从大鼠骨髓及外周血中分离出内皮祖细胞;并获得了增殖活性强的晚期内皮祖细胞,找到了更好的成血管干细胞的种子来源。