人类抗人CD40单克隆抗体免疫激活活性依赖于其Fc与FcγRⅡB相互作用

激动型抗CD40单抗能够激活APC表面CD40免疫共刺激信号,促进其成熟和交叉提呈抗原并激活抗原特异性CTL以杀伤肿瘤,多年来一直是肿瘤免疫治疗的研究热点。以鼠源抗体为基础的研究表明,激动型抗鼠CD40单抗的活性受到抑制性Fcγ受体(FcγRⅡB)的驱动,但尚不清楚这一调控机制是否影响人类抗人CD40(hCD40) IgG单抗。为此,作者研究了Fcγ受体(Fcγreceptor, FcγR)结合能力对人类抗hCD40单抗活性的影响,发现抗体恒定区(Fc)失去FcγR结合能力会严重削弱人类激动型抗hCD40 IgG1单抗活性;同时,FcγRⅡB特异性阻断抗体可以显著抑制人类激动型抗hCD40 IgG1单抗活性;此外,增强抗体Fc的FcγRⅡB结合能力能够提高抗体的激动活性。而且,多个抗原结合表位不同的人类抗hCD40单抗在实验中表现一致,说明抗CD40单抗的激动活性普遍依赖于FcγRⅡB。上述研究有助于探索激动型抗CD40单抗的活性调控规律,为设计更好的激动型抗hCD40抗体提供思路。     

抑制性受体FcγRIIB的研究进展

FcγRIIB作为一种抑制性受体,可介导对多种免疫细胞的负反馈调节反应,其可通过依赖或不依赖胞浆区免疫受体酪氨酸抑制基序ITIM的方式起到抑制细胞激活的作用。FcγRIIB在多种细胞上的异常表达可引发各种疾病,如自身免疫疾病、感染性疾病和肿瘤等。阐明FcγRIIB的生物学功能及与疾病间的联系,将有助于人们在治疗这些疾病方面找到新的靶点,进而提供一种有效的治疗方法。     

Fcγ和Fcε受体在小鼠三叉神经节的表达

目的 检测正常小鼠三叉神经节(TG)是否表达免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白E(IgE) Fc段Fcγ受体和Fcε受体,及其在过敏小鼠TG中的变化.方法 通过腹腔注射OVA和铝剂,建立小鼠过敏性结膜炎(ACJ)模型.EHSA检测血清总IgE.用Westernblot和免疫荧光检测Fcγ受体和Fcε受体的表达.结果 小鼠TG表达Fcγ受体和Fcε受体.其中IgG激活型高亲和力受体FcγRI和抑制型低亲和力受体FcγRⅡ只表达在小鼠TG神经元上,而IgG激活型低亲和力受体FcγRⅢ表达在小鼠TG中的卫星胶质细胞上.IgE激活型高亲和力受体FcεR Ⅰ表达在小鼠TG神经元上,而IgE低亲和力受体FcεRⅡ同时表达在小鼠TG神经元和卫星胶质细胞上.与正常小鼠比较,ACJ小鼠的血清总IgE水平升高,TG的FcεR Ⅰ和FcγRⅡ表达增加(P＜0.05).而ACJ小鼠的FcεRⅡ和FcγRⅠ表达下降(P＜0.05).FcγRⅢ在正常和ACJ小鼠TG中的表达无显著差别.结论 小鼠TG表达的Fcγ和Fcε受体可能参与ACJ及其他过敏性疾病的发生和发展.     

含人FcγRⅡB基因慢病毒的制备及其在HT-1080细胞中的表达

目的构建FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体,并鉴定其在细胞中的表达。方法以人mRNA为模板逆转录获得FcγRⅡB基因片段,并将其克隆入慢病毒表达质粒TRE,构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒。将慢病毒表达重组质粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒可诱导质粒Tet分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,分别包装表达病毒和可诱导病毒,分别测定表达病毒和可诱导病毒感染滴度。表达病毒和可诱导病毒共感染HT-1080细胞,经梯度浓度强力霉素(Dox)诱导,实时定量PCR检测FcγRⅡB mRNA表达,免疫荧光染色检测HT-1080细胞FcγRⅡB表达,Western blot法检测FcγRⅡB蛋白表达。结果重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定,测序结果显示插入片段碱基序列与GenBank提供FcγRⅡB基因序列同源性100%。表达病毒滴度达106TU/mL,可诱导病毒滴度达105TU/mL,感染性良好。HT-1080细胞被病毒感染后经Dox诱导表达FcγRⅡB,免疫荧光染色结果显示FcγRⅡB能够在HT-1080细胞中表达;实时荧光定量PCR和Western blot法结果显示FcγRⅡB表达水平与诱导剂浓度正相关。结论成功制备了FcγRⅡB慢病毒,感染HT-1080细胞后可实现FcγRⅡB的诱导表达。     

自身免疫性疾病的Fcγ受体的靶向治疗

IgG受体(Fcγ受体,FcγR)是重要的免疫应答调节分子。在人类,有3种白细胞FcγR,FcγRI(CD64)、FcγRⅡ(CD32)及FcγRⅢ(CD16)。FcγRⅡ具有两种功能不同的亚型,FcγRⅡA和FcγRⅡB。这两种亚型广泛分布于各种白细胞,是涉及自身免疫性疾病发病的主要受体。在临床和实验研究中已经发现FcγRⅡA的过度激活和/或FcγRⅡB的过度抑制均可导致免疫复合物介导的自身免疫性疾病。因此,下调FcγRⅡA或上调FcγRⅡB功能也许是治疗自身免疫性疾病的一种有效的方法。     

FcγRⅡB与系统性红斑狼疮

FcγRⅡB是相对分子质量为40 000的IgG低亲和力受体,FcγRⅡB的胞浆区含有以酪氨酸为基础的抑制小体ITIM(Immunoreceptor Tyrosinesed Inhibition Motif),有抑制淋巴细胞活化的作用。FcγRⅡB表达下降时产生免疫复合物的清除功能障碍,FcγRⅡB表达缺陷是系统性红斑狼疮(SLE)的重要易感因素。     

淋巴细胞表面FcγRⅢ基因多态性与免疫相关性疾病研究

在抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)参与的体液免疫中,免疫球蛋白(IgG)扮演了很重要的角色.IgG通过其Fc段与效应细胞表面的Fc受体结合,发挥多种免疫学效应.淋巴细胞表面FcγRⅢ(CD16)属于(Ig)超家族成员,是人白细胞表面上与抗体结合的主要受体之一,由于转录和剪接的不同,CD16存在FcγRⅢA和FcγRⅢB两种异型.每种又由于基因的多态性而分为不同的亚型.CD16的基因多态性影响其与IgG亚型的结合能力,从而影响体液免疫,产生不同效应的免疫反应.CD16基因多态性与免疫相关性疾病的发生发展关系密切.     

人FcγRⅠ受体胞外区基因的克隆、原核表达及纯化

目的:探讨人FcγRⅠ(huFcγRⅠ)胞外区蛋白的原核表达纯化及其在体外与IgG的结合活性。方法:PCR方法从人的外周血白细胞中扩增出huFcγRⅠORF区全长基因并与T载体链接,从克隆载体huFcγRⅠ-T中扩增huFcγRⅠ胞外区基因,并将其装入原核表达载体pGEX-6p-1。构建好的载体转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导重组蛋白表达,并利用SDS-PAGE和Western blot对表达的蛋白进行鉴定。结果:扩增到了huFcγRⅠ的胞外区基因,所构建的pGEXhuFcγRⅠ重组质粒经PCR和酶切鉴定与预期一致。IPTG诱导下目的蛋白的表达率约为30%。SDS-PAGE结果显示表达的目的相对分子质量(Mr)56 700与理论预期值一致。West-ern blot结果显示原核表达的huFcγRⅠ胞外区蛋白与人IgG特异亲和。结论:FcγRⅠ(huFcγRⅠ)胞外区蛋白在原核表达系统中得到有效的表达,复性蛋白在体外与人的IgG特异结合。     

抗Fc受体γ链单克隆抗体的研制及生物学特性鉴定

目的:制备Fc受体γ链的单克隆抗体(mAb),并对其生物学特性进行鉴定,为研究受体γ链相关的疾病提供实验材料。方法:人工合成的蛋白多肽偶联后免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA法筛选阳性克隆,Western blot、流式细胞术(FCM)检测鉴定抗体的特性及抗原识别位点。结果:通过细胞融合和亚克隆,共筛选出3株能稳定分泌抗体并且反应性好的杂交瘤细胞株5B6、7D3和8D4。其中7D3抗体反应性最强,2.5μg/mL与体内体外的γ链都能特异性反应。结论:获得了抗Fc受体γ链特异性的mAb,为进一步研究Fc受体γ链在相关疾病发生发展过程中所发挥的作用提供了良好的研究手段。     

FcγRⅢ在乙型肝炎病毒胎盘感染中作用的研究

目的研究FCγRⅢ在乙型肝炎病毒胎盘感染中的作用。方法收集早孕、中孕,足月胎盘各15例,进行免疫荧光检测FcγRⅢ的表达情况;并随机选取经免疫组化PV-9000法检测为HBsAg( )的足月胎盘15例,进行免疫荧光双标检测HBsAg/FcγRⅢ的分布。结果早孕绒毛组织未见FcγRⅢ表达,中孕胎盘有11例表达,其中最早的为孕17w,足月胎盘均有明显表达;HBsAg/FcγRⅢ在胎盘屏障各层细胞上可分布于同一部位。结论孕17w后胎盘组织开始表达FCγRⅢ,使胎盘具有转运IgG的功能:HBV可能是以免疫复合物的形式经由滋养细胞表面FCγRⅢ的介导而感染胎盘的。     

重组人γ－干扰素单克隆抗体的制备及初步应用

应用常规方法制备了４株能稳定分泌抗人重组γ－干扰素单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的小鼠杂交瘤细胞系：３Ｄ３、３Ｄ１２、３Ｆ９和３Ｂ８．经免疫琼脂双扩散法鉴定，其分泌的ＭｃＡｂ的亚类分别为：ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ１和１ｇＧ１．相对亲和常数前两株ＭｃＡｂ为６．２５×１０－１１、后两株ＭｃＡｂ为６．２５×１０－１３．问接ＥＬＩＳＡ法测培养上清的效价为２×１０２～１．２８×１０５．由小鼠腹水提取的４株ＭｃＡｂ与天然γ－干扰素均产生交叉反应，对重组的人γ－干扰素均具有中和活性．其中３Ｆ９和３Ｄ３培养上清对重组人γ－干扰素亦有明显的中和活性。用３Ｆ９ＭｃＡｂ与溴化氢活化的ＳｅＰｈａｒｏｓｅ４Ｂ偶联制备了亲和层析柱，用其纯化粗提的γ－干扰素纯度达到９５％以上，比活性达１．９×１０７ＩＵ／ｍｇ蛋白．     

人Fcα/μR和Poly Immunoglobulin Receptor多克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗人Fcα/μR和Poly Immunoglobulin Receptor(pIgR)的多克隆抗体.方法:在Escherchia coli中分别表达人Fcα/μR的ECl2和pIgR的DI结构域,均以包含体形式存在.从SDS-PAGE中切胶纯化,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体.ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体的特异性,抗原柱吸收交叉和纯化多抗.结果:抗体滴度分别是1:6 4000和1:25 6000,经Western blot检测特异性良好,抗人Fcα/μR和pIgR的多抗相互没有交叉.结论:在E.coli中成功表达了人Fcα/μR的EC12结构域和pIgR的DI结构域,并制备了无交叉的多克隆抗体,为进一步研究其功能和相互关系奠定基础.     

牛IgG2Fc受体（boFcγ2R）胞外区基因原核表达载体的构建及其表达

目的：构建牛Fcγ2R胞外区基因的原核表达载体，并在E.coli BL21（DE3）中表达。方法：提取健康成年牛的白细胞总RNA，经RT-PCR扩增牛Fcγ2R胞外区基因片段，并将其克隆到载体pGEM-TEasy，经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切鉴定及序列测定后，再将其亚克隆入原核表达载体pET28a中，构建重组质粒pET-2R，转化E.coli BL21（DE3）经LPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果：获得682bp的编码牛Fcγ2R胞外区基因片段。以构建的重组质粒pET-2R转化E.coli BL21（DE3）后，经IPTG诱导，表达出相对分子质量（Mr）约为30000的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示，表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coli BL21（DE3）的胞质中，Western blot检测表明该蛋白能和牛IgG2结合。结论：成功地构建了原核表达载体pET-2R，并表达出重组蛋白。为研究牛IgG和受体的相互作用机制及其介导的免疫反应打下了基础。     

人IgE抗体的Fc段第二受体及其降解物(文献综述)

<正> IgE抗体的Fc段受体(Fc epsilon re-ceptor,Fc_eR)有2种,即Fc_eRⅠ及Fc_eR Ⅱ。前者位于嗜碱性细胞及肥大细胞上,后者存在于多种血细胞上。因其与IgE亲和力不同,Fc_eRⅠ及Fc_eRⅡ又分别称为IgE的高亲和力与低亲和力受体。此两者编码基因不同,其抗原性亦不一样。近年对Fc_eRⅡ的结构及生物学研究进展迅速,并产生了抗Fc_eRⅡ单克隆抗体(MabER),这对Ec_eRⅡ研究工作的蓬勃兴起更为有利。本文重点介绍人B     

FcγR与自身免疫性疾病的相关性及免疫靶向干预治疗

IgG Fc受体（FcγR）是免疫应答中重要的膜性调节分子,表达于几乎所有白细胞的表面,是连接体液免疫和细胞免疫的桥梁。FcγR不仅介导免疫细胞的活化和效应的发挥,而且在特定条件下参与免疫损伤,构成某些免疫相关性疾病的病理机制。近年来,FcγR及其基因多态性在自身免疫性疾病发生发展中的作用及免疫靶向干预引起了国内外学者的关注。     

U937细胞ClqR介导对酵母多糖颗粒的吞噬及其与FcγR的协同作用

在证实了人Ｍφ系Ｕ９３７细胞ＣｌｑＲ在生理离子强度（Ｉ０．１５）下可与１２５Ｉ－Ｃｌｑ结合的基础上研究了ＣｌｑＲ对Ｕ９３７细胞吞噬酵母多糖颗粒（Ｚ）的调节作用。该细胞不吞噬Ｚ，但可吞噬Ｃｌｑ或ＩｑＧ调理的Ｚ（ＣＺ、ＩＺ），若以Ｃｌｑ和ＩｇＧ调理（ＩＣＺ），吞噬指数分别是ＣＺ和ＩＺ的６倍和２．５倍。将调理颗粒热灭活，或加入兔抗人ＣｌｑＦ（ａｂ’）２，或以高浓度Ｃｌｑ或抗人ＣｌｑＲｍＡｂＥ８预处理Ｕ９３７细胞，均可不同程度地抑制对ＣＺ或ＩＣＺ的吞噬，但Ｃｌｑ预处理却使对ＩＺ和Ｚ的吞噬增强。资料表明，Ｕ９３７细胞通过ＣｌｑＲ介导对酵母多糖颗粒的吞噬，且与ＦｃγＲ有协同作用。     

Fcγ受体Ⅱa多态性与系统性红斑狼疮关联性及连锁证据研究

目的：探讨中国南方汉族人群中Ｆｃγ受体Ⅱａ（ＦｃγＲⅡａ）多态性与系统性红斑狼疮的关联及连锁关系。方法：应用聚合酶链反应－特异性寡核苷酸杂交的方法,对７１例系统性红斑狼疮（ｓｙｓｔｅｍ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ,ＳＬＥ）患者、６４名健康对照和１５例ＳＬＥ患者及其父母进行了基因分析。对ＦｃγＲⅡａ１３１基因多态性进行了研究。结果：⑴携带ＦｃγＲⅡＡ－Ｒ１３１等位基因和ＦｃγＲⅡａ－Ｒ／Ｒ１３１基因型者发生ＳＬＥ的危险性大（ＯＲ＝２．０６,Ｐ＜０．０１;ＯＲ＝４．１７,Ｐ＝０．０１３５）;⑵种族间ＦｃγＲⅡａ－１３１多态性存在差异,中国汉族人与日本人等位基因频率相似;⑶家系关联分析和传递不平衡分析结果无统计学意义,可能与样本量小有关。结论：ＦｃγＲⅡａ－１３１多态位点是中国南方汉族人群中ＳＬＥ患者的易     

猪FcγR ⅡB多种剪接异构体的基因克隆与序列分析

目的:研究猪FcγRⅡB受体基因选择性剪接的多样性。方法:根据GenBank中猪FcγRⅡB(swFcγRⅡB)cDNA基因序列(DQ026064),应用Primer5.0软件设计合成了一对特异性引物,应用RT-PCR技术,从不同个体的猪肺泡巨噬细胞中扩增FcγRⅡB基因并进行测序分析,在GenBank中查找猪FcγRⅡBDNA序列(NW-001886241.1),并用相关软件分析其外显子组成。结果:共克隆出6个转录体,其中转录体2,4在信号肽部分都有一个丙氨酸的缺失。转录体5,6是两个新型的FcγRⅡB转录体,转录体5胞外区只有一个Ig结构域,转录体6是一个只含有一个Ig结构域的推导性可溶性Fc受体。结论:猪FcγRⅡB的表达因RNA选择性剪接方式不同而呈现出多样性。     

小鼠FcγRⅢ原核表达、纯化及鉴定

目的: 制备纯化重组蛋白mFcγRⅢ,并鉴定其生物学活性.方法: 从克隆载体mRⅢ-T中扩增mFcγRⅢ胞外区,构建原核表达载体pETmRⅢ,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot对重组表达蛋白进行鉴定;表达产物通过包涵体纯化后用稀释方法复性;ELISA检测复性蛋白活性.结果: 成功构建了重组表达质粒pETmRⅢ,纯化和复性了重组蛋白mFcγRⅢ;复性的重组蛋白mFcγRⅢ具有较强的体外活性.结论: 原核重组蛋白mFcγRⅢ复性后具有较强的体外结合配体特性,为探索重组蛋白治疗自身免疫病奠定了基础.