PCR-SSCP银染技术筛检HBV基因突变实验方法的建立

为了对乙肝患者ＨＢＶ基因突变进行大样本大面积筛检,我们建立了良好简便快速的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染色筛检ＨＢＶ基因突变的实验方法,结果显示本法具有很高的特异性和较高的敏感性,ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染技术筛检出的ＨＢＶ基因突变的阳性标本经直接测序证实全部存在ＨＢＶ基因突变,并证实该方法能特异性的检出１８９８位或１９０１位发生了Ｇ→Ａ出现了ＴＡＧ终止密码的突变,具有一定的推广应用价值。     

家族性高胆固醇血症患者低密度脂蛋白受体基因新的突变类型一例

目的：分析一例家庭性高胆固醇血症患的低密度脂蛋白受体基因突变位点。方法：以患儿的基因组DNA为模板，用聚合酶链反应（PCR）扩增该基因的18个外显子。用单链构象多态性（SSCP）方法分析检测PCR产物，对电泳结果异常进行DNA测序。结果：单链构象多态性分析发现患儿第10外显子存在一异常条带。DNA测序证实患儿第10外显子发生N515S纯合错义突变。结论：该病例为一个新的LDLR突变位点；聚合酶链反应－单链构象多态性分析（PCR－SSCP）可用于该突变位点的诊断。     

X-连锁隐性遗传的腓骨肌萎缩症与Cx32基因突变

目的：探讨X－连锁隐性遗传的腌骨肌萎缩症（CMTXR）与Cx32基因突变的关系。方法：应用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）结合DNA序列方法检测了一个X－连锁隐性遗传的腌骨肌萎缩症家系中4名患者,9名有血缘关系的正常人及家系外50名无血缘关系的正常人。结果：发现该家系中4例患者及3名有血缘关系的正常人均出现异常SSCP条带,经测序证实为Arg15Gln突变。结论：Cx32基因突变可以导致X－连锁隐性遗传的腓骨肌萎缩症。应用PCR－SSCP结合DNA序列分析方法可对由Cx32基因突变所致的X－连锁隐性遗传的腓骨肌萎缩症进行基因诊断。     

慢性乙型肝炎HBV前C区基因突变研究(摘要)

目的:观察HBV前C区变异与患者病情轻重及血清e系统的关系,探讨改进的聚合酶链反应一单链构象多态性分析(PCR—SSCP)银染技术用于筛选HBV前C区突变的可行性和效果。方法:用酚—氯仿抽提法提取血清HBV DNA,根据adr亚型HBV基因核苷酸序列,选择Pre-C起始密码上游及C区保守序列设计引物P_1、P_2进行聚合酶链反应(PCR),使全前C基因区段(876p)增幅,用甲酰胺     

焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒多个基因型耐药突变方法的建立及初步评价

目的建立焦磷酸测序(Pyrosequencing,PyroS)法检测HBV反转录酶基因区(rt区)与核苷(酸)类似物(NAs)耐药相关基因突变的检测方法。方法针对HBVDNArt区10个已知常见耐药突变位点的12种突变形式,分别构建野生型和突变型质粒作为标准品;设计通用PCR扩增引物和针对不同突变位点的焦磷酸测序引物,建立基于PyroS技术的HBV耐药突变检测方法。分别采用传统的双脱氧测序法和我们构建的PyroS法对接受/未接受NAs治疗的慢性乙型肝炎患者95份血清标本进行检测比较,并采用克隆测序法进行结果验证。结果 1.构建了HBVrt区常见耐药突变的野生株和变异株标准质粒,并建立了能对12种常见NAs耐药突变同时进行检测的PyroS方法;证实当标准质粒浓度≥1000拷贝/mL时,PyroS法对耐药突变位点的检出率、特异性和重复率均可达100%;2.对95份临床血清标本共检测了950个耐药相关氨基酸置换位点,PyroS法检测结果与直接测序法相符位点939个(符合率98.84%),PyroS法较直接测序法多检出8份标本中共11个变异位点,克隆测序法证实了焦磷酸测序法结果。结论成功建立了能同时定量检测10个已知NAs相关耐药基因突变的PyroS技术,可用于临床抗病毒疗效的监测、及早发现基因型耐药突变,并指导治疗方案的及时调整。     

RER阳性与RER阴性脑胶质瘤TGF—βⅡR基因突变差异的研究

目的：研究RER阳性与RER阴性脑胶质瘤中TGF－βⅡR基因突变的差异,探讨TGF－βⅡR基因突变在胶质瘤发生中的作用。方法：运用PCR－MIA,PCR－SSCP,PCR－直接测序技术测定40例脑神经胶质瘤手术切除标本中,复制错误阳性组（RER阳性）与RER阴性组之间TGF－β-ⅡR基因突变的差异,结果：原发性脑胶质瘤40例中8例（20％）表现为TGF－βⅡR基因异常,其中RER阳性8例中6例（75．0％）,RER阴性32例中2例（6．3％）,表现TGF－βⅡR基因异常,二者有显著差异（P＝0．0002）。结论：TGF－βⅡR基因突变在RER阳性星形细胞瘤中发生率较高,TGF－βⅡR基因异常可能是III,IV级星形细胞瘤发生的重要因素。     

结核分支村菌耐药分子机制及快速检测的研究

目的：研究结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药的分子机制，探索快速检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药性的分子生物学方法。方法：应用聚合酶反应－单链构象多态性（PCR-SSCP）检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药株与katG基因、rpoB基因突变。结果：46株结核分支杆菌临床分离株均未发现katG基因序列的缺失，30株异烟肼耐药株中，17株检测到katG基因突变，耐药株中katG基因的突变率为57％；87株结核分支杆菌利福平耐药临床分离株的PCR－SSCP结果显示，所有39株利福平敏感菌无突变检出，48株利福平耐药菌中，36株高度利福平耐药菌和7株低度利福平耐药菌检测量到rpoB基因突变；利福平耐药株中rpoB基因的突变检出率为89．6％。结论：证实katG和rpoB基因突变分别是结核分支杆菌异烟肼和利福平耐的主要分子机制。应用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）可快速检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药性。     

家族性高胆固醇血症患者低密度脂蛋白受体基因新突变一例

目的 分析中国家族性高胆固醇血症（FH）患儿低密度脂蛋白受体（LDL－R）基因突变的情况，并为在婴幼儿时期此病的症前筛查提供确诊方法。方法 以患儿及其父母的基因组DNA为模板，首先用聚合酶链反应（PCR）扩增该基因的启动子和全部18个外显子，然后用单链构象多态性（SSCP）方法分析PCR产物，最后对电泳结果异常进行DNA测序。结果 在1个家系中检测出患儿和其父亲LDL－R基因的一种新突变，即在第4外显子的444位碱基发生杂合突变（T→A），相应的氨基酸由半胱氨酸变成终止密码子，其母亲LDL－R基因正常。结论 LDL－R基因此位点的突变可引起FH，PCR－SSCP方法可用于筛查出的高危人群的确诊。     

单项抗-HBe阳性患者中的隐匿性乙型肝炎病毒感染

目的 研究抗-HBe单项阳性患者中隐匿性HBV的感染情况及发生的可能原因.方法 收集HBV血清学标志物检测结果中抗HBe单项强阳性[吸光度(A)值≤0.1]的新鲜血清标本61份,采用实时定量PCR进行HBV DNA含量检测.对于HBV DNA定量阳性的标本,采用雅培试剂复测HBV血清学标志物,采用PCR扩增,并进行克隆测序.结果 61份标本中,2份HBVDNA定量阳性,HBsAg血清学漏检率为3.3％.其中l份标本经雅培试剂复测为抗-HBc单项阳性,其前S区缺失突变和前S2区起始密码子突变,并存在不同突变株混合感染;另1份标本经雅培试剂复测发现,除抗HBe强阳性外,HBsAg和抗- HBc为极弱阳性,未发现前S/S区突变.结论 抗HBe单项阳性患者中存在隐匿性HBV感染和HBsAg血清学漏检情况,后者不仅与前S/S区突变有关,而且与外周血中HBsAg低水平也有一定关系.     

高胆固醇血症低密度脂蛋白受体基因点突变的研究

目的：建立低密度脂蛋白－受体（ＬＤＬ－Ｒ）基因点突变监测方法,从基因水平对３０例原发性高胆固醇血症患者进行筛选、明确诊断。 方法：将聚合酶链式反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）与银染技术相结合,用１９对引物对ＬＤＬ－Ｒ基因的全部１８个外显子进行检测,３０例患者中,对筛查出的突变用ＰＣＲ产物直接测序或克隆测序的方法明确突变的性质和位置。 结果：确立的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ条件稳定,银染方法灵敏度高、重复性好,且避免了同位素污染。３０例患者中,发现１例定位于外显子１４的杂合子点突变患者,ＰＣＲ产物直接测序证实第６７１位密码子发生错义突变：ＣＣＣ→ＣＧＣ,导致脯氨酸→精氨酸;１例纯合子家族性高胆固醇血症患者外显子７发生点突变,克隆测序证实密码子３０８位发生错义突变：ＴＡＣ→ＴＧＣ,导致半胱氨酸→酪氨酸;２例杂合子患者外显子４的３’部分ＳＳＣＰ出现相同异常带型。查阅文献,测序证实的突变皆是新的突变。 结论：建立的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法可用于高胆固醇血症患者ＬＤＬＲ基因点突变的筛检。研究结果从基因水平证实中国家族性高胆固醇血症患者ＬＤＬ－Ｒ基因突变具有多样性的特点。     

基因芯片检测HBV基因突变的临床意义--81例慢性乙型肝炎患者HBV前C区和BCP区突变的临床资料分析

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因组前C区变异和基本核心区启动子(basic core promoter.BCP)变异的临床意义以及基因芯片在慢性乙型肝炎(慢乙肝)临床检测中的应用.方法:用基因芯片法检测HBV DNA阳性慢乙肝患者的血清标本,根据HBV血清标志物的实验结果将受试者分为HBeAg( )组和HBeAg(-)组,比较分析两组患者的临床资料,并根据变异在不同类型慢乙肝患者中的检出状况,以评定HBV前C区和BCP区变异的临床意义.结果:81例血清HBV DNA阳性患者中检出前C区变异51例,突变检出率为63.0%,检出BCP区变异60例,突变检出率为74.1%,其中HBeAg(-)者变异的检出率均明显高于HBeAg( )者,突变株的检出以慢性重型肝炎最高,其次是慢乙肝重度、中度患者,慢乙肝轻度患者最低,表明HBV前C区突变与病情轻重及e系统血清标志有关,而与性别、年龄无关.结论:基因芯片定量检测HBV基因突变高效可靠,对于判断慢乙肝患者病情轻重、预后好坏和指导用药,具有一定临床参考价值.     

芯片技术检测慢性乙肝患者HBV-DNA基因突变的临床研究

目的研究HBV-DNA多点基因变异在慢性乙肝中的临床意义，为临床诊断和治疗提供依据。方法对102例慢性乙肝患者采用DNA芯片技术，检测HBV—DNA基因序列及6个位点的自然变异。结果102例慢性乙肝患者均存在HBV-DNA位点变异，其中前C区1896G-A变异率为23.6％，e抗原阳性者占6．9％，e抗体阳性者占45．4％，后者变异株显著高于前者，此突变有助于HBV逃避免疫攻击而形成慢性感染状态；前C区1814变异率为4％；基本C区启动子1762变异率为55．9％，1764变异率为54％，且两种变异常同时出现，与重型肝炎、肝硬化和肝癌的发生相关；P区：528变异率9．3％，552M-I变异率38．3％，552M-V变异率10．8％，552变异与核苷类似物耐药相关。结论基因芯片技术是检测基因突变、基因测序的高效方法之一，具有极高的灵敏性和可靠性。HBV-DNA位点变异对于判定疾病的稳定与进展及病情转归有重要作用。     

检测乙型肝炎病毒"a"决定簇热点突变基因芯片的制备和初步应用

目的为快速、高通量检测HBV"a"决定簇热点突变,制备基因芯片,并进行了初步应用。方法应用HBV基因保守序列设计PCR扩增引物,针对"a"决定簇突变设计简并探针,制备了检测126A、126S、144A、145R、145E、144A 145R和144A 145E突变的基因芯片。通过对质粒参考品或样本进行测定,以评价芯片的特异性、灵敏度、重复性和检测劣势株的能力,并对45例乙型肝炎患者的血清样本同时应用基因芯片和PCR产物直接测序法进行检测比较。结果所制备的基因芯片能特异性检测出质粒参考品,灵敏度为5×103拷贝/μl。同一样本检测10次,芯片内和芯片间变异系数均小于15%。当劣势株占HBV毒株10%以上时,基因芯片即可检出。芯片法测得45例样本中126A、126S-1和126S-2的阳性率(分别为46.67%、35.56%和24.44%)显著高于PCR产物直接测序法(分别为9.00%、4.44%和2.22%;P值分别为0.000、0.000和0.002),克隆测序验证了基因芯片法的特异性。结论基因芯片法可快速、有效地检测HBV特定位点突变株,为HBV突变的大规模筛查提供了方法。     

Detection of mutations in the human insulin gene by single strand conformation polymorphisms.

Single strand conformation polymorphisms (SSCP) is the method by which mutations can be detected in DNA amplified by the polymerase chain reaction (PCR). This method utilizes the fact that the electrophoretic mobility of single stranded DNA under nondenaturing condition depends not only on its size but also on its conformation. We examined whether this technique could detect five mutations that had previously been identified in the insulin genes of patients with abnormal insulin or familial hyperproinsulinemia. Five mutant insulin genes were constructed by site directed mutagenesis, and the cloned mutant insulin genes were amplified by PCR. All five mutations were detected because they were associated with shifts in the electrophoretic mobility of the DNA fragments. In addition, we analyzed amplified genomic DNA from a patient who is heterozygotes for the Insulin Wakayama mutation A3(Val----Leu). This mutation was also detected by the SSCP technique. We conclude that PCR-SSCP method is a simple, fast, and efficient method for detection of mutations in the human insulin gene.     

应用基因阵列法快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的　研制一种新型的基因阵列 ,用于结核分枝杆菌耐利福平分离株rpoB基因突变的快速检测。方法　根据结核分枝杆菌rpoB基因序列设计寡核苷酸探针并制作基因阵列 ,用生物素标记的引物扩增结核分枝杆菌rpoB基因突变热点的目的片断 ,与基因阵列杂交 ,同时以聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)技术及DNA测序法为对照。结果　 111株结核分枝杆菌临床分离株经PCR SSCP分析 ,4 1株RFP敏感株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同 ;70株耐RFP菌株中 ,6 3株(90 % )SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株不同 ,其余 7株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同。基因阵列检测结果 4 1株RFP敏感株杂交图谱与标准株完全相同 ,70株耐RFP临床分离株中 ,6 3株检测到rpoB基因突变 ,检出率为 90 % ;其中 37株 (5 3% ) 5 31位丝氨酸 (Ser)置换 ,15株 (2 1% ) 5 2 6位组氨酸(His)置换 ,11株 (16 % )其他位置的氨基酸置换。基因阵列检测结果与PCR SSCP及测序结果一致。结论　用基因阵列法可简便、快速、准确地检测出大多数结核分枝杆菌耐利福平分离株的rpoB基因突变。     

乙型、丁型肝炎病毒诊断基因芯片制备的初步实验研究

目的 制备联合检测乙型、丁型肝炎病毒基因芯片并进行杂交验证。方法利用Primer 5.0软件分别针对乙型、丁型肝炎病毒基因保守区域设计多对PCR引物，纯化PCR扩增产物，扩增后的产物克隆至pMD18-T载体，提取阳性克隆质粒进行测序分析及鉴定。用芯片点样仪将PCR产物点到玻片上制备成基因芯片。样品标记采用限制性显示技术，样品标记后进行杂交。结果运用PCR技术，得到多个乙型、丁型肝炎病毒特异性基因片段。序列分析表明，所扩增的片段均属于HBV、HDV特异基因。杂交结果显示，样品和乙型、丁型肝炎诊断基因芯片杂交的敏感性和特异性均佳。结论利用PCR扩增产物制备乙型、丁型诊断基因芯片是一种快速、简便的实用方法，有着广阔的应用前景。另外，利用限制性显示技术标记样品可为进一步更多种肝炎病毒的混和检测奠定基础。     

结核分支杆菌利用福平药物敏感性的直接快速检测

探讨利用分子生物 学方法直接快速检测临床标本结核分支杆菌利福平（ＲＦＰ）药物敏感性的可行性。方法自行设计针对ｒｐｏＢ基因特异扩增的引物（扩增产物为１８３ｂｐ片段）,运用聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）银染色法,检测４５株结核分支杆菌临床分离株,对其中部分菌株进行ｒｐｏＢ基因ＤＮＡ序列分析,运用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染色法对７０份结核病患痰标本进行直接快速检测,并与药敏试验结果做对照分     

乙型肝炎病毒基因组转基因小鼠模型的制备与鉴定

目的 建立一种新的乙型肝炎病毒(HBV)基因组高效复制与表达转基因小鼠模型,以用于抗HBV药物筛选和乙型肝炎发病机制的研究。方法 以加长的ayw亚型HBV全基因组作为目的基因,采用显微注射技术,转导于小鼠受精卵细胞雄原核,然后将受精卵细胞移植于受体假孕母鼠输卵管内,发育产生子代小鼠。鼠尾组织聚合酶链反应(PCR)筛选、Southern印迹鉴定后,再用酶链免疫吸附法(ELISA)检测血清乙型肝炎表面抗原及e抗原,Southern印迹检测血清HBV DNA。结果 实验获子代小鼠61只,鼠尾组织经PCR筛选、Southern印迹鉴定18只阳性,血清乙型肝炎表面抗原及e抗原、HBV DNA呈阳性反应7只。结论 1.3倍加长的HBV全基因组转基因小鼠具有较高的复制、表达效率。     

Ligase chain reaction (LCR®) assay for semi-quantitative detection of HBV DNA in mononuclear leukocytes of patients with chronic hepatitis B

Summary. A ligase chain reaction (LCR®)-based approach to detect hepatitis B virus (HBV) DNA in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. Using this new amplification technique, we determined semi-quantitatively the amount of a short HBV S-gene fragment in PBMC lysates of 25 patients with different forms of chronic hepatitis (group A ( n = 8), hepatitis B s antigen (HBsAg)+/hepatitis B e antigen (HBeAg)+; group B ( n = 9), HBsAg+/HBeAg-; group C ( n = 8), HBsAg-/HBeAg-). The LCR results were compared with the findings obtained with polymerase chain reaction (PCR) amplification of three distinct HBV gene regions (preS1/2, S and C) and related to the serological profiles of the patients. Depending on the primer pair used for PCR amplification, sensitivity of HBV LCR in PBMC was equivalent or slightly superior to PCR. The highest positivity rate for HBV DNA was observed in the HBeAg+ and HBV DNA seropositive group (8/8) and was lower in the other patient groups B (4/9) and C (1/8). Interestingly, HBV gene sequences could also be detected in the lymphocytes of an HBsAg negative patient and in two patients from group B who were both negative for serum viral particles by PCR. The rapid LCR® procedure represents a reliable alternative to PCR for the sensitive detection of HBV DNA in PBMC samples. In combination with the automated IMx™-system the new amplification technique may be routinely used for screening for HBV in whole blood samples and thus may help to better evaluate the risk of HBV reinfection in liver transplant recipients.