耳蜗Deiters细胞的形态学和电生理研究近展

Deiters细胞是哺乳动物耳蜗内的一种支持细胞 ,与外毛细胞 (OHC)的关系非常密切。单离的Deiters细胞大多呈倒立的逗点状〔1〕,分为体、细柄和指突三部分〔2〕,核位于体部中央。在大部分哺乳动物的耳蜗中 ,Deiters细胞呈平行的三排排列 ,与OHC相对 ;每个 Deiters细胞以其体部之底锚定于基底膜 ,逗点的弯曲侧承载 OHC,顶端由指突构成网状层之一部分〔3〕。换言之 ,Deiters细胞的指突面对内淋巴液 ,细柄和体部与临近的 OHC体部则浸浴于外淋巴液中。Spicer等〔3〕研究了蒙古沙土鼠耳蜗 Deiters细胞的超微结构 ,发现胞浆中具有独特的玫瑰…     

豚鼠耳蜗外毛细胞和Deiters细胞的同时分离法

目的：探讨豚鼠耳蜗外毛细胞（OHC）和Deiters细胞（DC）同时分离的方法。方法：选健康杂色豚鼠，解剖出耳蜗基底膜，采用酶消化后机械分离。结果：可以同时获得一定数量，活性良好，长短不一的OHC和DC。结论：熟悉耳蜗的解剖特性，保持Corti器的完整及掌握机械吹打的力度是同时获取活性良好的OHC和DC的关键。     

外毛细胞的主动运动及其病理生理意义

近年来听觉生理的重要进展之一是耳蜗主动机制的提出,很多学者认为耳蜗的主功机制与外毛细胞(OHC)的运动有关。本文就 OHC 内的运动结构、影响 OHC 运动的因素、OHC 运动的机制及 OHC 运动的病理生理学意义进行了综述。     

豚鼠耳蜗单离外毛细胞和Deiters细胞的钾离子电流及其生理功能

目的 研究豚鼠耳蜗单离外毛细胞(OHC)和Deiters细胞的钾离子电流及其特性，观察乙酰胆碱(ACh)和三磷酸腺苷(ATP)对离子电流的影响。方法 运用全细胞膜片钳技术，分别记录单离OHC和Deiters细胞的离子电流。结果 OHC的长度不同，其钾离子电流表达具有差异性，短OHC具有较大外向电流和内向电流。ACh对短OHC钾离子电流的影响较大，其作用是使0HC超极化。ATP介导的0HC内向电流是非选择性的阳离子电流。ATP介导Deiters细胞出现内向离子电流。结论 K^ 电流在OHC的电谐振中非常重要。Deiters细胞能够通过减少K^ 外流、增加K^ 内流来缓冲周围环境中K^ 浓度的变化。ACh和ATP对OHC离子电流的影响在耳蜗机制中起重要作用。     

硫酸庆大霉素对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响

为观察硫酸庆大霉素对培养的小鼠耳蜗螺旋神经节细胞（SGC）的细胞生存数和细胞突起长度的影响，在单离培养的出生1～5d的NIH小鼠SGC培养液中，加入不同浓度的硫酸庆大霉素（25，50，100mg／L）。培养14d后，标本用4％多聚甲醛固定，甲苯胺蓝染色，在光镜下计数SGC生存数，目镜测微尺下测量细胞突起长度。结果显示，实验组与对照组间、不同浓度实验组间的细胞生存数及细胞突起长度无明显差异（P＞0．05）。提示硫酸庆大霉素对小鼠耳蜗SGC的生存和生长无明显影响，氨基糖甙类抗生素对SGC的影响可能是继发性的。     

豚鼠耳蜗各回外毛细胞的分离

目的 :探讨豚鼠耳蜗各回外毛细胞 (OHC)的分离方法。方法 :选豚鼠 8只 ,解剖耳蜗各回组织 ,获得Corti器并采用酶消化后机械分离。结果 :各回均可获得一定数量、活性良好的 OHC,第 1、2、3、4回单离 OHC的长度依次为 2 3.81、34.5 0、6 0 .48和 71.37μm。结论 :熟悉耳蜗各回解剖、组织特性并按操作要点进行是成功分离出各回 OHC的关键。     

豚鼠耳蜗单离Hensen细胞的分离技术及其钾通道

目的　探讨适合膜片钳技术的单离Hensen细胞的分离及对其钾通道的研究。方法　取豚鼠耳蜗 ,获得Corti器 ,采用酶消化和机械分离方法对Hensen细胞进行分离 ,并采用传统全细胞膜片钳技术 ,记录单离Hensen细胞的钾电流。结果　每只耳蜗可以获得活性良好的单离Hensen细胞 12± 3个。Hensen细胞的钾电流呈明显的外向整流性 ,只有迟电流 (IK) ,没有峰电流 (IA)。结论　酶消化结合机械分离的方法可获得适用于膜片钳技术研究的单离Hensen细胞 ,并用于讨论了所记录到的Hensen细胞钾电流     

强噪声暴露后大鼠听觉电生理及形态学改变

目的:观察强噪声暴露后大鼠听觉电生理及形态学的改变,为探讨噪声性聋的发病机制提供实验依据.方法:大鼠随机分为对照组和实验组,实验组暴露于中心频率为4 kHz的窄带噪声中,给声强度为120 dBSPL,暴露时间为4 h.观察2组听觉脑干诱发电位(ABR)及耳蜗形态学的变化.结果:实验组出现ABR反应阈上升,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);暴露后第1天,基底膜铺片经DNA荧光染料碘化丙锭染色后示;实验组3排外耳毛细胞(OHC)中可出现不同的毛细胞细胞核形态变化(正常、凋亡、坏死和缺失),而第21天未见明显的细胞凋亡;OHC的缺失2组差异有统计学意义(P<0.01),螺旋神经节细胞计数2组差异无统计学意义(P>0.05).扫描电镜示;实验组OHC纤毛异常(散乱、倒伏)及OHC的缺失,以第3排OHC最严重.结论;所应用的强噪声能引起大鼠听觉系统的损害,产生永久性阈移(PTS).该噪声条件下,耳蜗毛细胞的死亡模式在暴露后早期包括凋亡和坏死,而晚期则主要是坏死;PTS的产生可能和OHC纤毛异常及OHC的缺失有关.     

顺铂对耳蜗单离听觉细胞一氧化氮合酶表达的影响

目的 探讨顺铂对耳蜗单离听觉细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS／NOSⅡ)表达的影响。方法 以单离毛细胞和单离螺旋神经节神经元为模型,用免疫组化方法(ABC法)研究顺铂对细胞内NOSⅡ表达的影响。结果 在1mM顺铂平衡盐溶液中室温下培养两小时的外毛细胞及培养半小时的单离螺旋神经元与对照组相比显示了对NOSⅡ抗体较强的免疫反应。结论 提示顺铂诱导了单离外毛细胞及单离螺旋神经元内NOSⅡ的合成增加,NO可能参与了顺铂的耳毒作用。     

缺氧对体外培养耳蜗螺旋神经节细胞及神经纤维的影响

目的:建立耳蜗器官体外培养模型,详细观察缺氧对体外培养耳蜗螺旋神经节细胞(SGC)及神经纤维的影响。方法:分离生后3 d Wistar大鼠耳蜗基底膜,平铺在含有DMEM培养液的培养基内(每盘6条基底膜),2盘为1组,随机分为5组。4组作为实验组,按不同时间段(6 h、12 h、24 h、48 h)进行缺氧(37℃,90%N2,5%CO2,5%O2)培养。1组作为对照组放置在37℃、5%CO2培养箱。用抗神经丝蛋白作为一抗,对耳蜗SGC及神经纤维进行免疫荧光染色。激光共聚焦显微镜下观察缺氧时耳蜗SGC及神经纤维形态变化并计数单位面积(24 mm×36 mm)SGC数即细胞密度。结果:缺氧早期(6 h)神经纤维局灶性水肿,SGC变化不明显。12 h神经纤维局灶性断裂及崩解,SGC减少,细胞密度与对照组相比差异有显著性(P<0.01)。随缺氧时间延长,神经纤维崩解和SGC缺失逐渐加重,48 h神经纤维完全崩解破坏,SGC严重缺失,细胞密度与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。结论:缺氧造成体外培养耳蜗SGC及神经纤维损伤,神经纤维对缺氧更敏感。     

外毛细胞基底侧膜动力蛋白分布均一性的研究

目的 探讨OHC基底部是否存在动力蛋白(Prestin)的表达及其在侧膜三层结构中的定位.方法 分别取正常C57小鼠、Wistar大鼠及豚鼠耳蜗的单离外毛细胞,在激光共聚焦显微镜下,利用Prestin特异性抗体与细胞膜标记di-8-ANEPPS双染,对Prestin在单离OHC上的表达与分布情况进行观察.结果 ①OHC基底侧膜存在Prestin抗体的阳性染色,OHC底端亦见阳性染色;②与细胞膜标记di-8-ANEPPS染色相比,Prestin抗体的阳性染色位于细胞膜的外侧;③经低渗细胞外液处理后,OHC侧膜中的质膜层可与内层表皮下池(subsurfac cisternae,SSC)和中层质膜下小梁(cortical lattice,CL)分离,在激光共聚焦显微镜下,外毛细胞膜最外层的质膜层上可见明显的Prestin抗体阳性染色.结论 动力蛋白(Prestin)分布于外毛细胞膜中最外层的质膜层上,在细胞基底部细胞膜上亦有表达.     

条件声暴露后豚鼠耳蜗外毛细胞丝束肌动蛋白表达的改变

目的：观察豚鼠耳蜗丝束肌动蛋白的表达及分布情况以及条件声暴露后耳蜗毛细胞丝束肌动蛋白的表达有无改变,初步探讨耳蜗“坚韧化”现象的发生机制。方法：实验用豚鼠分组后,采用中心频率为1kHz、强度为95dBSPL的倍频程噪声对动物进行条件声暴露。条件声暴露结束后按实验设计的时间处死动物并进行耳蜗铺片及免疫荧光染色。应用激光扫描共聚焦显微镜观察柯替器荧光染色情况并对1kHz频率感音区的第3回柯替器外毛细胞（OHC）的荧光强度进行定量分析。结果：豚鼠耳蜗柯替器丝束肌动蛋白主要分布在内外毛细胞的静纤毛、表皮板,OHC顶部细胞侧壁,柱细胞头板。在底回柯替器OHC基底部,Deiters细胞指突,外柱细胞的胞体亦含有丰富的丝束肌动蛋白。不同时期的条件声暴露后,除条件声暴露1d组加休息5d组外,其他2组动物OHC的荧光强度均有明显变化。结论：①一定剂量的条件声暴露可导致耳蜗柯替器丝束肌动蛋白表达的改变。②除内外毛细胞的静纤毛、表皮板,柱细胞头板等既往报道的部位外,豚鼠耳蜗柯替器的外柱细胞胞体中也含有丰富的丝束肌动蛋白。③条件声暴露后耳蜗OHC丝束肌动蛋白浓度的减低可能与耳蜗“坚韧化”现象的产生有关。     

耳蜗螺旋神经节细胞的电生理实验研究现状

耳蜗螺旋神经节细胞(spiral gaaglion cell，SGC)，可将毛细胞的信号传向听觉中枢，在听觉信息的传导中起着极其重要的作用。目前，应用全细胞记录膜片钳技术，证实了SGC细胞膜上可表达多种离子通道，如电压门控离子通道，ATP控制的离子通道，神经递质受体介导的离子通道等，而各种病理状态下的SGC均伴有某些特定离子通道的电变化。对这些电变化的研究，将为我们在细胞和分子水平上诊断和治疗许多由内耳疾病所导致的耳聋和听力障碍提供可能。     

耳毒性药物致耳蜗螺旋神经节细胞损伤机制

耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells,SGC)是听觉系统的第一级神经元,对听觉形成和言语识别至关重要,研究耳毒性药物对该类细胞的损伤机制颇具意义.目前的研究主要从自由基细胞毒性、细胞凋亡、细胞膜离子通道变化等方面探讨耳毒性药物对螺旋神经节细胞的损伤机制.本文从自由基细胞毒性、细胞凋亡、细胞膜离子通道等方面对SGC在药物中毒性聋中的损伤机制进行综述.     

脑源性神经营养因子延迟应用对感音神经性聋影响的实验研究

目的探讨药物致聋后,延迟给予脑源性神经营养因子(brain-drived neurotrophic factor,BDNF)对耳蜗病理及听觉生理的影响。方法药物致聋大鼠20只,随机平均分为人工外淋巴液(artifical perilymph,AP)组和BDNF组。左侧耳蜗为实验侧,右侧耳蜗为对照侧。致聋30天后通过微渗透压泵向鼓阶内持续灌注AP或BDNF,期间进行电诱发听性脑干反应(electrically auditory brainstem response,EABR)阈值检测。持续给药28天后取耳蜗进行病理检查,观察Rosenthal管内螺旋神经节细胞(spiral ganglion cell,SGC)胞体密度及骨螺旋板缰孔内神经纤维密度。结果EABR阈值AP组持续升高,BDNF组阈值初期上升缓慢,后期开始下降,用药治疗14～28夭阈值低于AP组(P<0.01);耳蜗病理变化,SGC胞体密度及神经纤维密度左右侧对比,AP组双侧无差异(P>0.05),BDNF组左侧明显高于右侧(P<0.01);两组左侧比较,BDNF组高于AP组(P<0.01)。结论大鼠药物致聋30天后,鼓阶内BDNF持续给药对SGC胞体及树突均有保护作用,并可以相应改善电听觉敏感性。     

内毛细胞的分离和形态学特点

目的　探讨内毛细胞 (innerhaircells ,IHC)的分离技术和形态学特征。方法　从豚鼠耳蜗制备基底膜活体铺片 ,微分干涉倒置显微镜下用显微分离结合酶消化的方法单离IHC。高倍显微镜下 ,用两个钨丝电极沿IHC和第一排外毛细胞 (outerhaircells,OHC)之间的Corti隧道显微切割 ,游离的IHC团被吸引至玻璃微吸管内。结果　从每只豚鼠耳蜗可分离到 3 0～ 5 0个活性良好的单离IHC ,并存活 2h左右。典型的IHC胞体具有特征性 ,呈梨状或长颈的烧瓶形状 ,胞体中间可见大的圆形细胞核。胞体内包含较多细胞器 ,颗粒状 ,粗糙感。大部分可观察到静纤毛 ( 93 / 98)。静纤毛分布沿表皮板一侧 ,排列呈线状或“C”形。部分细胞可观察到明显狭窄的颈部 ( 61/ 98)。IHC的表皮板一般为倾斜状 ,凹面向上 ,较厚。另外 ,IHC的表皮板通常与细胞胞体长轴成锐角或钝角。豚鼠耳蜗IHC长度为 13～ 3 1μm ,平均 ( 2 2 45± 4 14) μm ( x±s,n =98,下同 ) ;直径为 7～ 15 μm ,平均 ( 11 95±1 5 9) μm。静纤毛长度为 2～ 7 5 μm ,平均 ( 5 2 1± 1 0 0 ) μm。 结论　本研究成功建立一种能够分离到大量的、生物活性好的IHC的技术 ;内、外毛细胞单离后在形态学上的鉴别要点是表皮板 ,尤其是表皮板与细胞胞体长轴的成角特征     

硫酸链霉素对豚鼠螺旋神经节细胞膜钙内流的影响

目的 观察硫酸链霉素是否影响耳蜗螺旋神经节细胞（spiral ganglion cells,SGC)胞膜去极化时细胞内游离钙离子浓度（[Ca^2 ]i）升高的能力，并观察这种影响在不同药物浓度下以及相同药物浓度对蜗轴不同部位的螺旋神经节细胞的作用的异同，旨在深入探讨硫酸链霉素急性耳毒性的分子生物学机制。方法 豚鼠全身麻醉后断头活杀，酶－机械法分离获得单离的SGC。10umol/L的钙敏荧光探针Fluo-3/AM负载30min后用ACAS Utima型激光扫描共聚焦显微镜观察各种条件下SGC[Ca^2 ]i的动态变化。结果 ①SGC[Ca^2 ]i在标准细胞外液灌流过程中保持稳定。②150mmol/L的高钾细胞上液灌流导致12／14个细胞的[Ca^2 ]i明显升高，而高钾无钙细胞外液灌流仅有1／10个细胞[Ca^2 ]i明显的升高。③经1mmol/L、 0.1mmol/L、0.01mmol/L硫酸链霉素作用 后，再灌流高钾细胞外液则分别有0／9、6／14、7／13个细胞[Ca^2 ]i升高。④经0.02mmol/L硫酸链霉素作用后，对来源于顶回和底回的 S GC灌流高钾细胞外液分别有5／10和0／15个细胞[Ca^2 ]i升高.结论 高钾细胞外液灌流SGC[Ca^2 ]i明显升高，钙升高的来源为细胞外钙离子的内流。硫酸链霉互可以阻断这种钙离子的内流，其阻断作用具有浓度和部位依赖性。     

豚鼠耳蜗单离外毛细胞钙波的观察

目的：观察豚鼠耳蜗单离外毛细胞（outer hair cell,OHC)内游离钙浓度（[Ca^2]i)是否存在波动，即有无钙波。方法：健康豚鼠10只断头处死，在无Ca^2的dHanks液和含Ca^2的Hanks液中酶－机械法分离获得单离活性OHC，钙荧光抗体Fluo-3孵育后，分别加入乙酰胆碱或空白对照，用MRC－1024型激光扫描共聚焦显微镜（Bio-Rad，英国）观察OHC约50min内[Ca^2]i的变化。结果：dHanks液中加ACh组的5个OHC，[Ca^2]i呈明显的规律性的波动，即产生了钙波，钙波的周期约600s;Hanks液中加ACh组的6个OHC的[Ca^2]i均迅速升高，无钙波出现，在dHanks液和Hanks液中不加ACh分别观察了3个OHC，[Ca^2]i呈平坦型，无钙波，结论：ACh能刺激诱发豚鼠耳蜗单离OHC产生钙波。     

水杨酸钠对豚鼠耳蜗单离外毛细胞游离钙浓度影响及其调控机制研究

目的　观察水杨酸钠对豚鼠耳蜗外毛细胞 (outerhaircells,OHC)内游离钙浓度 [Ca2 ]i的影响 ,并对钙通道调控药物的拮抗作用进行观察 ,以深入探讨水杨酸钠耳毒性的分子生物学机制。方法　豚鼠全身麻醉后断头活杀 ,酶 机械法分离获得耳蜗单离OHC。 10 μmol/L的Fluo 3/AM负载30min后用ACASUltima型激光扫描共聚焦显微镜观察不同药物灌流下OHC[Ca2 ]i的变化。结果　OHC在标准细胞外液灌流过程中 [Ca2 ]i保持稳定。 1mmol/L水杨酸钠灌流致 8/ 10个细胞的 [Ca2 ]i明显升高。无钙细胞外液中灌流亦有 10 / 10个细胞 [Ca2 ]i明显的升高。经 3mmol/L利多卡因作用1h后 ,水杨酸钠灌流不能使细胞 [Ca2 ]i升高 (n =10 )。盐酸氟桂嗪可以明显阻断水杨酸钠导致的OHC[Ca2 ]i升高效应 (3/ 12细胞的 [Ca2 ]i升高 ) ,而尼莫地平无此效应 (7/ 7细胞的 [Ca2 ]i升高 )。结论　水杨酸钠可以导致OHC[Ca2 ]i明显增加 ,OHC[Ca2 ]i升高来源于细胞内钙库的动员和释放。使细胞内 [Ca2 ]i升高可能是水杨酸钠的耳毒性机制之一。     

利诺吡啶对豚鼠耳蜗外毛细胞和支持细胞钾电流的影响

目的　观察KCNQ家族钾通道特异性阻滞剂利诺吡啶 (linopirdine)对豚鼠耳蜗单离外毛细胞和Deiters细胞 (支持细胞 )总钾电流的影响 ,初步探讨KCNQ家族钾通道在耳蜗外毛细胞和Deiters细胞的分布。方法　运用膜片钳技术 ,在全细胞模式下记录正常细胞外液中 8个外毛细胞和5个Deiters细胞的总钾电流 ,并观察 10 0 μmol/L利诺吡啶对外毛细胞和Deiters细胞总钾电流的影响。结果　在正常细胞外液中 ,单离外毛细胞可记录到四乙基二乙胺敏感的外向性钾电流和静息膜电位附近激活的内向性钾电流 (theK+ currentactivatedatnegativepotential,IKn)两种钾电流 ,而单离Deiters细胞中只记录到外向整流性钾电流。加入 10 0 μmol/L利诺吡啶后 ,外毛细胞中的四乙基二乙胺敏感的钾电流减小 ,IKn被完全抑制 ;而Deiters细胞中的外向整流性钾电流大小无变化。结论KCNQ家族钾通道存在于豚鼠耳蜗外毛细胞 ,其介导的钾电流是四乙基二乙胺敏感的钾电流的组成部分 ,并构成全部的IKn;但KCNQ家族钾通道不存在于豚鼠耳蜗Deiters细胞。