bcl-2反义寡核苷酸对小细胞肺癌细胞NCI-H69放射敏感性的影响

目的研究bcl-2反义寡核苷酸对人小细胞肺癌细胞NCI-H69放射敏感性的影响。方法将NCI-H69细胞培养传代,然后将细胞分为反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组和空白对照组,通过脂质体将不同寡核苷酸导入细胞中,用Western-Blot法检测Bcl-2蛋白的表达。采用直线加速器分别以不同剂量（0、2、4、6、8、10 Gy）X线照射4组细胞。收集照射后的细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率,MTT法测定细胞存活分数。结果Western-Blot杂交显示反义寡核苷酸组无Bcl-2蛋白表达,相对正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组及空白对照组Bcl-2蛋白表达明显受到抑制（F=7.24-15.31,q=5.03-7.80,P〈0.01）。细胞经X线照射后,反义寡核苷酸组细胞凋亡率明显高于空白对照组,差异具有显著性（F=7.24-15.31,q=5.03-7.80,P〈0.01）;正义寡核苷酸组和无义寡核苷酸组与空白对照组相比无统计学差异。4组细胞接受辐射后,反义寡核苷酸组在未照射和照射不同剂量后的存活分数均低于空白对照组,差异有统计学意义（F=11.04-45.56,q=5.10-14.75,P〈0.01）,而正义寡核苷酸和无义寡核苷酸组与空白对照组比较则无统计学差异。结论bcl-2反义寡核苷酸能有效封闭bcl-2基因的表达,增强小细胞肺癌细胞NCI-H69对X线的敏感性。     

bcl-2反义寡核苷酸增强NCI-H460细胞对紫杉特尔和放射线的敏感性

目的:研究bcl-2反义寡核苷酸作用于非小细胞肺癌细胞株NCI-H460后,细胞对紫杉特尔、放射线敏感性的变化.方法:紫杉特尔与bcl-2反义寡核苷酸或无义寡核苷酸联合作用NCI-H460细胞后,MTT法测紫杉特尔半数抑制率(IC50);NCI-H460经bcl-2反义寡核苷酸或无义寡核苷酸作用后,再用放射线照射,MTT法测定细胞生长抑制率;免疫荧光标记观测细胞Bcl-2蛋白水平.结果:靶向bcl-2 mRNA蛋白编码区反义寡核苷酸与紫杉特尔联合作用于NCI-H460细胞后紫杉特尔的IC50值为(0.101±0.009) μmol/L,与不加寡核苷酸组紫杉特尔的IC50值[(0.183±0.018) μmol/L]或无义寡核苷酸联用紫杉特尔的IC50值[(0.179±0.016) μmol/L]相比,统计学上具有显著性差异(P＜0.05).bcl-2反义寡核苷酸与放射线联合作用NCI-H460细胞,显著抑制细胞的生长,并呈时间依赖性,分别与单用放射线及bcl-2无义寡核苷酸联合放射线组相比,统计学上有显著性差异(P＜0.05).bcl-2反义寡核苷酸分别与紫杉特尔、放射线作用于NCI-H460细胞后显著抑制Bcl-2蛋白表达,分别与单用紫杉特尔、放射线或无义寡核苷酸联用紫杉特尔、放射线相比,统计学上具有显著性差异(P＜0.05).结论:靶向bcl-2 mRNA的反义寡核苷酸能增强NCI-H460细胞对紫杉特尔、放射线的敏感性.     

Bcl-2反义寡核苷酸对放射治疗诱导肺癌细胞凋亡的促进作用

目的通过体外试验,研究Bcl-2反义寡核苷酸对放射治疗诱导肺癌细胞凋亡的促进作用。方法NCI-H446肺癌细胞株分5组,分别为空白对照、单纯照射组、脂质体加照射组、无义序列加照射组、反义寡核苷酸加照射组。培养至6h、12h、24h、48h和72h,分别收集各组细胞,瑞吉染色做细胞形态学分析,应用RT-PCR半定量测定p53、Bcl-2和PTEN基因的mRNA表达,流式细胞仪检测各组细胞DNA倍体,分析细胞凋亡指数。结果Bcl-2反义寡核苷酸联合照射后p53和PTEN表达明显增加,Bcl-2mRNA表达则明显降低。流式细胞仪检测照射后72h空白对照组、照射组、脂质体加照射组、无义序列加照射组、反义寡核苷酸加照射组凋亡率分别为0.14±0.09,13.17±2.47,11.84±1.76,13.72±1.4,21.26±2.97,反义寡核苷酸加照射组与其余4组比较差别有显著性意义(P<0.01)。结论Bcl-2反义寡核苷酸对放射治疗诱导肺癌细胞凋亡有促进作用;细胞凋亡受p53和Bcl-2基因调控,p53基因的表达促进了细胞的凋亡,而Bcl-2基因的高表达抑制细胞的凋亡,PETN的表达与凋亡也有相关性。     

Bcl-2反义寡核苷酸联合照射对肺癌细胞的抑制作用

[目的]研究Bcl-2反义寡核苷酸联合照射对肺癌细胞的抑制作用。[方法]NCI-H446肺癌细胞株分5组:空白对照、单纯照射组、反义寡核苷酸加照射组、无义序列加照射组、脂质体加照射组。相应组照射10GY后24、48、72小时,MTT法检测各组的细胞增殖抑制率和联合相互作用。[结果]照射组、反义寡核苷酸加照射组、无义序列加照射组、脂质体加照射组均有细胞抑制,并呈时间依赖关系。其中Bcl-2反义寡核苷酸联合照射组抑制率明显高于其它三组(P<0.01),联合作用指数(CDI)=0.86。[结论]Bcl-2反义寡核苷酸促进了照射对NCI-H446肺癌细胞的增殖抑制作用,两者有协同作用。     

抑制c-raf-1基因对人宫颈癌细胞放射敏感性影响的实验研究

目的:探讨用反义技术抑制癌基因c-raf-1对宫颈癌细胞(HeLa)放射敏感性的影响.方法:设立空白对照组、c-raf-1正义寡核苷酸组和脂质体组(仅加入等量的脂质体)作对照,用RT-PCR检测宫颈癌细胞处理前后c-raf-1表达水平的变化.用集落形成试验检测各实验组照射后人宫颈癌HeLa细胞株集落形成率,AO/EB荧光染色法检测细胞凋亡率的变化,流式细胞仪测定Bcl-2蛋白的表达.结果:c-raf-1反义寡核苷酸能有效抑制c-raf-1癌基因的表达,经脂质体介导的c-raf-1反义寡核苷酸作用的宫颈癌细胞经60Coγ射线照射后其集落形成率较正义寡核苷酸组及单纯照射组明显下降,而凋亡率明显增加,Bcl-2蛋白的表达显著下调,与对照各组比较有显著差异(P＜0.01).结论:c-raf-1反义寡核苷酸通过抑制c-raf-1基因降低人宫颈癌HeLa细胞放射抗性.其辐射增敏作用可能与c-raf-1反义寡核苷酸抑制了辐射抵抗信号转导途径,增加照射后肿瘤细胞的凋亡率有关.     

抑制ANGPTL4基因对舌癌细胞放射敏感性的影响

目的:探讨利用反义技术抑制ANGPTL4基因后对舌癌细胞放射敏感性的影响及机制。方法:采用舌癌细胞Tca8113为研究对象,设ANGPTL4反义寡核苷酸(ASODN)组、ANGPTL4正义寡核苷酸(SODN)组、脂质体组以及空白对照组。转染ANGPTL4 ASODN后检测各组舌癌细胞ANGPTL4表达水平,6MV X线照射后用RT-PCR法检测ANGPTL4表达水平,集落形成试验检测舌癌细胞生长抑制率,荧光染色法检测细胞凋亡率,流式细胞仪测定Bcl-2蛋白表达。统计学处理采用单因素方差分析。结果:转染ANGPTL4 ASODN后,ASODN组ANGPTL4基因的表达被抑制,较空白对照组下降约44%,而其他三组之间无明显差异。X线照射后,ANGPTL4 ASODN组集落形成率较SODN组、脂质体组及空白对照组明显下降(F=38.782,P<0.001);凋亡率明显增加(F=156.320,P<0.001);Bcl-2蛋白表达明显下调(F=302.895,P<0.001)。结论:ANGPTL4ASODN抑制ANGPTL4基因表达后能增加舌癌细胞放射敏感性。其机制可能与ANGPTL4 ASODN下调舌癌细胞Bcl-2基因表达、增加X线照射后肿瘤细胞凋亡率有关。     

联合转染Survivin和Bcl-2反义寡核苷酸对裸鼠胆囊癌生长的抑制作用

目的探讨联合转染Survivin和Bcl-2反义寡核苷酸（AsODN）对裸鼠胆囊癌生长抑制作用。方法建立裸鼠胆囊癌皮下移植瘤模型,选择36只裸鼠随机分为3组：对照组、正义寡核苷酸（sODN）组和AsODN组,裸鼠瘤体内分别注射PBS、Survivin和Bcl-2sODN、Survivin和Bcl-2AsODN,12d后处死裸鼠,测量瘤体体积及质量,计算抑瘤率;苏木精-伊红染色观察瘤体组织学变化;免疫组织化学方法检测Survivin及Bcl-2蛋白的表达。结果AsODN组裸鼠瘤体平均体积显著低于对照组、sODN组（F=24.469,q=8.802、7.569,P〈0.01）,其体积抑瘤率为55.53%,sODN组为9.90%;AsODN组裸鼠瘤体平均质量显著低于对照组、sODN组（F=25.376,q=3.168、20.737,P〈0.01）,其质量抑瘤率为56.24%,sODN组为8.47%。AsODN组瘤体中可见大量的凋亡细胞。免疫组化证实AsODN组Survivin表达明显降低,同sODN组相比差异有显著意义（F=15.103,q=5.883、7.191,P〈0.01）;Bcl-2表达亦明显降低,同sODN组相比差异有显著性（F=6.632,q=4.793、4.030,P〈0.05）。结论联合转染Survivin和Bcl-2AsODN可下调Survivin和Bcl-2表达,诱发细胞凋亡,从而抑制裸鼠胆囊癌种植瘤的生长。     

bcl-2基因表达与小细胞肺癌对抗机体免疫所致细胞凋亡的关系

目的 观察小细胞肺癌细胞侏bcl-2基因表达与其耐受肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）免疫攻击的关系，探索应用bcl-2硫代反义寡核苷酸（bcl-2 SON）治疗肺癌的途径。方法 bcl-2 SON处理小细胞肺癌细胞株NCI-H69，Western blotting检测其对bcl-2表达作用；分别把bcl-2表达不同的小细胞肺癌细胞株与肺癌标本分离出来的TIL共同培养，并通过JAM试验观察TIL诱导肺癌细胞凋亡的情况。结果 经bcl-2 SON处理后NCI-H69细胞的bcl-2表达明显受抑制。JAM试验结果显示，bcl-2SON处理的H69细胞及尢bcl-2表达的NCI-H82细胞在与TIL混合培养中，随着TIL浓度增加．凋亡细胞也增加；对照的NCI-H69可见bcl-2表达，JAM试验中随着TIL浓度增加，凋亡细胞的量无明显变化。结论 表达bcl-2的肺癌细胞可对抗肿瘤浸润淋巴细胞的免疫攻击，bcl-2 SON呵作为治疗肺癌的新途径。     

bcl-2基因表达与小细胞肺癌对抗机体免疫所致细胞凋亡的关系

目的 观察小细胞肺癌细胞株bcl-2基因表达与其耐受肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)免疫攻击的关系,探索应用bcl-2硫代反义寡核苷酸(bcl-2SON)治疗肺癌的途径。方法 bcl-2SON处理小细胞肺癌细胞株NCI-H69,Westernblotting检测其对bcl-2表达作用;分别把bcl-2表达不同的小细胞肺癌细胞株与肺癌标本分离出来的TIL共同培养,并通过JAM试验观察TIL诱导肺癌细胞凋亡的情况。结果 经bcl-2SON处理后NCI-H69细胞的bcl-2表达明显受抑制。JAM试验结果显示,bcl-2SON处理的H69细胞及无bcl-2表达的NCI-H82细胞在与TIL混合培养中,随着TIL浓度增加,凋亡细胞也增加;对照的NCI-H69可见bcl-2表达,JAM试验中随着TIL浓度增加,凋亡细胞的量无明显变化。结论 表达bcl-2的肺癌细胞可对抗肿瘤浸润淋巴细胞的免疫攻击,bcl-2SON可作为治疗肺癌的新途径。     

β1整合素反义寡核苷酸对人结肠癌细胞黏附和侵袭抑制作用

目的 研究β1整合素反义寡核苷酸(ASODN)对人结肠癌HT-29细胞侵袭的抑制作用.方法 以脂质体为载体将硫代磷酸修饰的β1整合素ASODN及无义寡核苷酸(NSODN)转染人结肠癌HT-29细胞,通过RT-PCR及Western-Blot试验,分别测定ASODN组、NSODN组和空白对照组β1整合素mRNA和蛋白的表达,MTT法和Transwell小室法分别测定其黏附力和侵袭力.结果 与NSODN组和空白对照组相比较,ASODN 组中β1整合素 mRNA 和蛋白表达强度明显降低;ASODN组和NSODN组转染的人结肠癌HT-29细胞侵袭力均下降,但前者下降较为明显.结论β1整合素ASODN转染HT-29细胞后,通过降低其β1整合素mRNA和蛋白表达水平,从而抑制其对细胞外基质的侵袭.     

c-erbB2反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞放射敏感性的影响

目的 :探讨癌基因c -erbB2的反义寡苷酸对人卵巢癌细胞放射敏感性的影响。方法 :设立c -erbB2正义寡核苷酸组和非处理组作对照 ,用RT -PCR检测卵巢癌细胞处理前后c -erbB2表达水平的变化。用MTT法及平板克隆形成试验检测人卵巢癌细胞株SKOV3在脂质体c-erbB2反义寡核苷酸作用前后受60 Coγ射线不同剂量照射后的细胞存活分数和集落形成率。结果 :c -erbB2反义寡核苷酸能抑制c-erbB2癌基因的表达 ,经脂质体介导的c-erbB2反义寡核苷酸作用的卵巢癌细胞经γ射线照射后其存活分数和集落形成率较转染正义寡核苷酸组及单纯照射组明显下降 (P <0 .0 1) ,而转染c -erbB2正义寡核苷酸组的存活分数和集落形成率与单纯照射组相比无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论 :c -erbB2反义寡核苷酸通过抑制c -erbB2的表达降低人卵巢癌细胞株SKOV3放射抗拒性。该作用可能与c-erbB2反义寡核苷酸抑制了引起细胞辐射抗拒的细胞信号转导途径有关。     

芹菜素对人肺癌NCI-H460细胞增殖及凋亡的影响

目的研究芹菜素对人肺癌NCI-H460 细胞增殖及凋亡的影响。方法应用10~80 μmol/L 芹菜素处理NCI-H460 细胞,
MTT法检测细胞增殖抑制率;Hoechst 33258细胞核染色法观察细胞凋亡的形态学改变;流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染色
法检测细胞凋亡率;Western blotting检测凋亡相关信号分子Bax、Bcl-2和caspase-3的蛋白表达水平。结果芹菜素对NCI-H460
细胞的增殖抑制作用呈浓度和时间依赖性;芹菜素处理组细胞出现核固缩、染色质凝集和核碎片化等典型的细胞凋亡特征;
NCI-H460细胞凋亡率随着芹菜素浓度增加逐渐增高;芹菜素处理组细胞Bax和caspase-3蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达降低。
结论芹菜素能够抑制人肺癌NCI-H460细胞的增殖,并诱导其凋亡,其机制可能与上调Bax和下调Bcl-2的表达,导致Bcl-2/Bax
比值下降,caspase-3活化有关。
     

姜黄素通过影响NF-κB信号通路促进肺癌细胞的放射敏感性

目的 探讨姜黄素联合放射治疗对肺癌NCl-H460细胞的活性及肺癌小鼠放射敏感性的影响.方法 把肺癌NCI-H460细胞分为4组:空白对照组、姜黄素组、γ射线组及γ射线照射与姜黄素的联合组;然后对各组分别应用噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖,Annexin-V/PI染色法检测细胞周期分布及凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax的表达,RT-PCR检测核因子κB(NF-κB)基因表达情况.另外,建立小鼠肺癌模型同样分为对应的4组,姜黄素按照1 mg/kg经尾静脉注射于小鼠,肿瘤局部进行剂量为5 Gy射线照射,处理28 d后,比较不同处理组小鼠瘤体体积.结果 与空白对照组、姜黄素组和γ射线组比较,联合组NCI-H460增殖率明显降低(P＜0.05),凋亡率明显增加(P＜0.05),抑凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低(P＜0.05),促凋亡蛋白Bax表达明显增高(P＜0.05),NF-κB mRNA表达明显降低(P＜0.05),并且肿瘤的体积有明显减少(P＜0.05).结论姜黄素可通过抑制γ射线处理条件下NF-κB的表达并促进细胞的G2/M期阻滞来增强肺癌NCI-H460细胞对γ射线的敏感性.     

PLA激活JNK信号通路促进NCI-H292细胞凋亡

目的 探讨多聚左旋精氨酸(PLA)诱导NCI-H292细胞凋亡的信号通路及分子机制.方法 将加入PLA 的浓度梯度分5组:0、10、20、40、60 mg/L,作用NCI-H292细胞24 h后Western blot法检测每组c-Jun氨基末端激酶( JNK)的磷酸化水平;设对照组、PLA 组(40 mg /L)、SP组(加入特异性JNK通路抑制剂SP600125)、PLA+SP组,加药24 h后流式细胞仪检测每组NCI-H292细胞凋亡率,Western blot法检测各组NCI-H292细胞内凋亡相关蛋白 Bcl-2/Bax、Caspase-3、P-JNK/JNK和β-actin蛋白的表达水平.结果 对照组、PLA组、SP组、 PLA+ SP组 NCI-H292细胞凋亡率分别为(5.13 ±1.07)%、(22.62 ± 1.66)%、(5.69 ± 0.14)%、(8.99 ± 3.73)% ;Western blot 法检测 PLA 诱导 NCI-H292 细胞内BCL-2/Bax比值降低( P＜0. 01),Caspase 3 表达升高( P＜0. 001),PLA诱导NCI-H292 细胞JNK 磷酸化水平增加(P＜0.001 ), SP600125 抑制 PLA 诱导 JNK 磷酸化( P ＜0.001).结论 PLA可能介导JNK信号通路引起NCI-H292细胞凋亡水平增加.     

survivin、caspase-3在脑胶质瘤的表达及suvivin ASODN对U251细胞的影响

目的：观察脑胶质瘤患者脑组织survivin、caspase-3的表达情况及survivin ASODN对脑胶质瘤U251细胞survivin和caspase-3表达的影响,探讨两者与脑胶质瘤发病及预后的相关性。方法：免疫组化法检测脑胶质瘤患者survivin和caspase-3蛋白表达,RT-PCR检测脑胶质瘤组织survivin mRNA表达,以脑胶质瘤U251细胞为研究对象,转染不同剂量survivin ASODN（100nmol/L、300nmol/L、500nmol/L）,并于培养不同时间（24h、48h、72h）后,RT-PCR检测U251细胞survivin和caspase-3的表达。结果：脑胶质瘤患者脑组织survivin蛋白高表达（阳性率69.6%）,而caspase-3低表达（阳性率50.7%）,且两者表达的阳性率与肿瘤的恶性程度有关。U251细胞在不同浓度survivin ASODN转染不同时间后,以500nmol/L survivin ASODN转染72h对U251 survivin mRNA的抑制率达62.06%,与对照组及不同浓度组间比较差异均有统计学意义（P〈0.05-P〈0.01）。免疫组化结果显示转染后survivin表达下调,而caspase-3表达上调。结论：脑胶质瘤患者脑组织高表达survivin蛋白,而低表达caspase-3蛋白,survivin ASODN可诱导U251细胞株survivin mRNA及蛋白表达下调,而caspase-3蛋白表达水平上调。     

Inhibition of Bcl-2 enhances the efficacy of epirubicin chemotherapy in PC-3 prostate cancer cells

Background  Overexpression of Bcl-2 protein in cancer cells can inhibit programmed cell death and engender chemoresistance. Bcl-2 antisense oligonucleotide (G3139) has shown its antitumor effects enhanced in preclinical models when combined with taxol-based chemotherapy. This study aimed to investigate the efficacy of G3139 combined with epirubicin in the androgen-independent prostate cancer.

Methods  PC3 prostate cancer cell line was cultured and treated with epirubicin and Bcl-2 antisense oligonucleotide alone or in combination. The effects of therapeutic agents on cells were determined by the MTT assay. Expression of Bcl-2 mRNA and protein was documented by RT-PCR and Western blotting. Apoptosis induction was confirmed by flow cytometric analysis.

Results  Bcl-2 antisense oligonucleotide alone produced no cytotoxic effects and the combination of Bcl-2 antisense oligonucleotide with epirubicin sensitized PC-3 cells to the killing effects of chemotherapy. A marked down-regulation of Bcl-2 mRNA and protein was observed after antisense and epirubicin cotreatment. A statistically significantly higher fraction of apoptotic cells was detected by flow-cytometric analysis after epirubicin treatment with prior antisense Bcl-2 transfenction, as compared with mono antisense Bcl-2 or epirubicin treatment.

Conclusion  These data suggested that inhibition of Bcl-2 expression combined with epirubicin may be an attractive therapeutic strategy in hormone-refractory prostate cancer.

     

BAG-1、Bcl-2双靶区反义RNA重组载体诱导SGC-7901细胞凋亡

目的 构建BAG-1、Bcl-2双靶区反义RNA重组载体并初步探讨其对SGC-7901细胞增殖活性的影响.方法 从SGC-7901细胞总RNA中逆转录扩增包括全部编码序列的BAG-1和Bcl-2 cDNA,利用生物工程技术,反向插入真核细胞双表达载体pVITR02的多克隆位点中,转染SGC-7901细胞,MTT法检测对细胞增殖的影响,RT-PCR法观察对细胞BAG-1和Bcl-2 mRNA表达水平的变化,流式细胞术检测对细胞周期的影响.结果 限制性内切酶和测序分析表明,双表达质粒pVlTR02-AsBAG-1-Bcl-2构建成功.MTT法检测显示pVITR02-AsBAG-1-Bcl-2载体抑制SGC-7901细胞增殖,并旱时间依赖性,其中以72 h转染组抑制作用最显著(P＜0.01);与对照组比较,pVITR02-AsBAG-1-Bcl-2组BAG-1和Bcl-2mRNA表达水平下降(P＜0.05),细胞捌亡比例升高(P＜0.01).结论 成功构建反义双靶区重组载体pVITR02-AsBAG-1-Bcl-2,并发现其能抑制SGC-7901细胞增殖并引起细胞凋亡.