γ-氨基丁酸抑制胆管癌细胞株QBC939增殖及其机制的研究

目的 观察γ-氨基丁酸(GABA)对胆管癌细胞QBC939增殖、凋亡和端粒酶活性的影响.方法 采用MTT比色法观察GABA对人系胆管癌细胞QBC939增殖的作用,流式细胞术检测GABA对胆管癌细胞QBC939凋亡的影响,PCR-ELISA法观察其对QBC939细胞端粒酶活性的影响,放射免疫分析法检测cAMP含量.结果 GABA抑制胆管癌细胞的增殖(抑制率由2.6%增至26.8%,P<0.05),促进细胞凋亡(凋亡率由4.8%增至28.03%,P<0.05),并且抑制癌细胞中端粒酶的活性(0.82±0.048 vs 0.56±0.054,P<0.05),同时促进胆管癌细胞内cAMP含量的增加[(0.59±0.049)nmol/L vs (0.82±0.033)nmol/L,P<0.05].结论 GABA可能通过受体后信息介导途径,诱导细胞凋亡,并抑制癌细胞端粒酶活性,从而抑制胆管癌细胞的增殖.     

光动力抑制胆管癌QBC939细胞生长的实验研究

目的研究血卟啉衍生物介导的光动力（HPD-PDT）抑制胆管癌细胞生长状况及其机制。方法 MTT法用于评估人胆管癌细胞（QBC939）的生长状态;Hoechst33258染色和流式细胞术检测细胞凋亡;WesternBlotting法用于探测QBC939细胞中细胞色素C的释放情况;Caspases酶活性测定用于测定caspase-3、-8、-9的活化情况。结果 HPD-PDT在体外能够抑制胆管癌QBC939细胞生长,这一效应主要是通过诱导QBC939细胞线粒体凋亡达到的,在凋亡过程中,出现了细胞色素C释放,caspase-9和-3的活化。结论 HPD-PDT体外能够抑制胆管癌细胞生长,诱导胆管癌细胞凋亡。     

三氧化二砷诱导人类胆管癌QBC939细胞凋亡的初步研究

目的研究三氧化二砷(As2O3)诱导人类胆管癌QBC939细胞凋亡。方法应用MTT法检测As2O3对胆管癌细胞的抑制作用；采用光镜、荧光显微镜观察细胞形态变化；流式细胞术检测Rhodamine 123染色并分析DNA含量及细胞周期。结果1～16μmol／L As2O3均能抑制人胆管癌细胞QBC939的生长，且抑制率具有浓度一时间依赖性。4μmol／L As2O3作用细胞后出现典型的凋亡形态特征，可检测到亚二倍体凋亡峰，Rhodamine 123荧光强度降低。结论As2O3能诱导QBC939细胞发生凋亡，其机制可能与线粒体膜电位去极化有关。     

光动力疗法对人胆管癌细胞QBC939凋亡的影响

目的 研究血卟啉衍生物(hematoporphyrin derivative,HPD)介导的光动力作用(photodynamic therapy,PDT)对人胆管癌细胞QBC939凋亡的影响及其作用机制.方法 体外培养人胆管癌QBC939细胞株,用不同浓度HPD处理,并用半导体激光治疗仪不同强度光照后,应用CCK8法检测PDT对QBC939细胞生长的相对抑制率.采用流式细胞术检测PDT作用前后QBC939细胞凋亡情况.应用RT-PCR检测PDT作用前后QBC939细胞中血管内皮细胞生长因子-C (VEGF-C)、环氧合酶-2 (COX-2)基因表达情况.用SP免疫细胞化学法测定PDT作用前后QBC939细胞质中VEGF-C、COX-2两种蛋白表达情况.用ELISA法测定PDT作用前后QBC939细胞上清中VEGF-C、COX-2两种蛋白分泌情况.结果 HPD-PDT在体外能够抑制QBC939细胞生长,HPD 10 mg/L经5 J/cm2光照强度时,实验组与空白组A值差异有统计学意义(P＜0.05),细胞生长抑制率达到70％.继续增加药物浓度或光照剂量,差异无统计学意义,细胞存活率降低不明显.流式细胞术显示HPD-PDT明显促进QBC939细胞早期凋亡.RT-PCR显示HPD-PDT能明显抑制QBC939细胞中VEGF-C、COX-2基因表达.SP免疫细胞化学法显示HPD-PDT能抑制QBC939细胞质中VEGF-C、COX-2两种蛋白表达.ELISA法显示HPD-PDT能抑制QBC939细胞VEGF-C、COX-2两种蛋白细胞外分泌.结论 HPD-PDT能抑制胆管癌QBC939细胞生长,促进胆管癌细胞早期凋亡.HPD-PDT对胆管癌QBC939细胞生长的抑制作用可能是通过促进早期凋亡实现的,而VEGF-C、COX-2从基因到蛋白水平低表达可能是促进胆管癌QBC939细胞早期凋亡的途径.     

siRNA下调NF-κB p65 基因表达影响人胆管癌QBC939细胞凋亡

目的运用RNA干扰技术下调胆管癌细胞株QBC939中核转录因子κB(NF-κB)p65基因表达对其肿瘤细胞生长的抑制作用。方法以阳离子脂质体Lipofectamine TM 2000作为转染试剂,将体外合成的人NF-κB p65的siRNA转染入胆管癌细胞QBC939。RT-PCR测定细胞内NF-κB p65 mRNA的表达。用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测NF-κB亚单位p65的DNA结合活性的改变。运用免疫组化、流式细胞仪、激光共聚焦法检测p65基因表达下调对QBC939细胞凋亡的影响。结果体外合成的人NF-κB p65 siRNA有效抑制了QBC939细胞中NF-κB p65 mRNA的表达(P0.01),同时ELISA结果显示,靶向NF-κB p65 siRNA组的p65亚单位与DNA结合活性明显低于对照组(P0.05),免疫组化DAPI核染色、流式细胞仪及激光共聚焦检测观察显示下调p65基因表达能够诱导QBC939细胞凋亡。结论 NF-κB p65的siRNA在胆管癌细胞QBC939调控方面起重要作用,通过沉默其表达可诱导胆管癌细胞凋亡抑制其生长增殖。     

MicroRNA-133a-5p调控c-met表达对胆管癌细胞迁移和侵袭的影响

目的:探讨MicroRNA-133(miR-133)在胆管癌细胞系中的表达,研究miR-133基因表达在胆管癌细胞迁移和侵袭过程中的作用。方法:利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术测定分析miR-133及其不同成熟体(miR-133b、miR-133a-3p、miR-133a-5p)在胆管癌QBC939细胞系中的表达。将胆管癌QBC939细胞系经转染后分为三组:自然生长组(空白对照组),细胞转染无关序列组(阴性对照组)以及细胞转染Anti-miR-133a-5p组(干扰组),利用RT-PCR检测各组胆管癌QBC939细胞系中miR-133a-5p、c-met的表达。然后利用Transwell小室法分别检测分析干扰miR-133a-5p基因表达对胆管癌QBC939细胞系迁移和侵袭能力的影响。结果:RT-PCR检测miR-133不同成熟体miR-133b(0.74±0.07)、miR-133a-3p(0.99±0.12)、miR-133a-5p(1.00±0.06)中的表达,其中miR-133a-5p在胆管癌QBC939细胞系中表达量最高(P0.05)。RT-PCR实验证实干扰组QBC939细胞系中miR-133a-5p(0.70±0.08)表达显著低于对照组(1.43±0.34);干扰组QBC939细胞系中c-met(0.09±0.02)表达也显著低于对照组(1.01±0.07),差异有统计学意义(P0.01)。Transwell小室实验证实干扰组中胆管癌QBC939细胞系迁移(69.5±8.3)和侵袭(19.3±3.3)能力明显低于对照组,差异均有统计学意义(P0.01)。结论:MicroRNA-133a-5p的低表达可以明显减弱c-met的表达,同时可以抑制胆管癌QBC939细胞系的迁移和侵袭能力,miR-133a-5p有可能成为胆管癌基因表达调控的新靶点。     

1,25二羟维生素D3对胆管癌细胞系QBC939增殖和凋亡的影响

目的 探讨1,25二羟维生素D3[1,25(OH)2 D3]对胆管癌细胞系QBC939的体外增殖及凋亡的影响.方法 将不同浓度的1,25(OH)2 D3与胆管癌细胞系QBC939共同培养,采用MTT法测定细胞增殖能力、显微镜观察细胞形态学的改变、流式细胞仪检测细胞周期与凋亡、免疫细胞化学观察bcl-2的表达.结果 0.1～0.5μmol/L的1,25(OH)2 D3对胆管癌细胞QBC939有抑制作用,呈剂量依赖性.经1,25(OH)2 D3作用72h后细胞G1期比例升高,S期比例下降,其中0.5μmol/L组细胞G1期由(50.3±1.0)%上升至(65.5±3.2)%,S期由(39.4±0.5)%下降至(23.6±0.7)%;并且可诱导细胞产生凋亡,0.5μmol/L组作用后细胞凋亡率由0.5%上升至24.6%;bcl-2的表达下调.结论 1,25(OH)2 D3能抑制胆管癌细胞系QBC939增殖并诱导细胞凋亡,其引起凋亡的机制可能与下调bcl-2的表达相关.     

γ-氨基丁酸对人胆管癌细胞株QBC939增殖和侵袭的影响

目的 观察抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)对人胆管癌细胞株QBC939生物学行为的影响.方法 采用MTF比色法观察GABA对人系胆管癌细胞QBC939增殖的作用,PCR-ELISA法观察其对QBC939细胞端粒酶活性的影响,Transwell小室分析GABA对胆管癌细胞侵袭能力的影响,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、明胶酶谱法分析GABA对QBC939细胞分泌的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)mRNA和酶活性的影响,数据采用单因素方差分析和Dunnett法处理.结果 GABA对人胆管癌细胞QBC939的增殖有抑制作用(抑制率由2.6%增至26.8%,P＜0.05);抑制癌细胞中端粒酶的活性(0.82±0.05)vs.(0.56±0.05)(P＜0.05);抑制胆管癌细胞穿透Matrigel胶的能力(在100 μmol/L浓度的GABA作用下,穿透细胞数由(60±10)个降至(43±4)个(P＜0.05),同时胆管癌细胞分泌的基质蛋白酶MMP-2和MMP-9的mRNA和活性下降,这三种效应均成浓度依赖性.结论 GABA抑制胆管癌细胞QBC939的生长并减弱侵袭转移能力,其机制可能与其抑制端粒酶活性和基质蛋白酶MMP-2和MMP-9的分泌和活性有关.     

埃罗替尼和塞来昔布协同抑制胆管癌细胞生长

目的:观察表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂埃罗替尼(erlotinib)与环氧合酶(COX-2)抑制剂塞来昔布(celecoxib)对胆管癌细胞生长的协同抑制作用。方法:采用甲基噻唑基四唑(MTT)比色法检测胆管癌细胞株QBC939增殖,流式细胞术检测用药前、后细胞凋亡和细胞周期的变化,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹方法观察用药前、后细胞中COX-2、EGFR下游信号及凋亡、细胞周期相关基因蛋白表达的变化。结果:QBC939细胞表达COX-2 mRNA和EGFR mRNA及相应蛋白。埃罗替尼、塞来昔布抑制QBC939细胞增殖,促进细胞凋亡,诱导细胞周期阻滞于G0/G1期。同时,塞来昔布增强了埃罗替尼抑制细胞生长、诱导细胞凋亡的作用。联合用药显著降低p-MAPK、p-Akt及PGE2表达。结论:塞来昔布和埃罗替尼均可抑制胆管癌细胞的生长,而联合用药具有协同作用,能同时阻断EGFR和COX-2信号通路。在胆管癌治疗中具有一定应用前景。     

GABA对胆管癌细胞株QBC939增殖及凋亡的影响

目的观察γ-氨基丁酸(GABA)对胆管癌细胞QBC939增殖及凋亡的影响。方法采用MTT比色法观察GABA对人系胆管癌细胞QBC939增殖的作用,流式细胞术检测GABA对胆管癌细胞QBC939凋亡及其细胞周期的影响,放射免疫分析法检测cAMP含量。结果GABA抑制胆管癌细胞的增殖,呈剂量依赖性,流式细胞仪检测结果显示,随药物浓度增加,细胞凋亡率显著增加(4.8%增至28.03%,P<0.05),同时促进胆管癌细胞内cAMP含量的增加。结论GABA抑制胆管癌细胞QBC939增殖,诱导细胞凋亡,可能机制是通过受体后信息介导的。     

阿托伐他汀对人胆管癌QBC939细胞系增殖及侵袭的影响

目的 探讨阿托伐他汀(ATV)对人胆管癌QBC939细胞系增殖、侵袭的影响及其可能作用机制方法 应用细胞培养技术培养QBC939细胞,经不同浓度的阿托伐他汀处理后,以MTF法检测阿托伐他汀对QBC939细胞的杀伤抑制率,以Matrigel侵袭实验、迁移实验和半定量RT-PCR检测阿托伐他汀对QBC939细胞的侵袭、运动能力和对细胞内RhoC,MMP-9,p27 mRNA表达的影响情况.结果 阿托伐他汀可明显抑制QBC939细胞的生长及增殖,且其抑制作用呈剂量-时间效应关系:IC50为25 μmoL/L,最强抑制作用时间为48h.Matrigel侵袭实验及迁移实验显示,经10 μmol/L,25 μmol/L,50 μmoL/L药物干预48h后的QBC939细胞,随着浓度的增加,其体外侵袭、运动能力明显减弱(P＜0.05);半定量RT-PCR测定显示,阿托伐他汀作用48h后,QBC939细胞中p27表达含量明显增高、MMP-9的表达降低,而RhoC的表达改变并不明显.结论 阿托伐他汀可抑制人胆管癌QBC939细胞的生长增殖,并减弱其体外侵袭、运动能力.     

RNA干扰诱导型一氧化氮合酶基因表达对人胆管癌细胞生长的影响

目的:探讨RNA干扰诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表达对人胆管癌细胞生长的影响。方法:针对iNOS设计并合成3种iNOS-siRNA序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3)及阴性对照siRNA序列后,分别转染人胆管癌细胞QBC939细胞,用荧光显微镜下观察转染效率,通过iNOS mRNA与蛋白的变化分析干扰效果,选择干扰效果最为明显的iNOS-siRNA序列,观察其干扰后QBC939细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的变化。实验以无处理的QBC939细胞为空白对照。结果:合成的3种iNOS-siRNA序列均可有效转染人胆管癌QBC939细胞,且转染后均能明显降低QBC939细胞中iNOS mRNA与蛋白的表达(均P0.05),其中siRNA2对iNOS的抑制作用最为明显,阴性对照siRNA序列对QBC939细胞中iNOS mRNA与蛋白的表达无明显影响(均P0.05)。转染siRNA2后,QBC939细胞增值明显降低、出现明显的G0/G1期阻滞、凋亡率明显增加(均P0.05);转染阴性对照siRNA序列的QBC939细胞无上述改变(均P0.05)。结论:RNA干扰能有效降低iNOS基因在胆管癌细胞中的表达,从而抑制胆管癌细胞的增殖,并促进其凋亡。     

Oddi括约肌成型术后患者胆汁促增殖活性的探讨

目的　观察经十二指肠Oddi括约肌成型术 (TS)后患者胆汁 (TSB)对人胆管癌细胞QBC 93 9生长的影响 ,探讨TS与胆管癌发生与发展的关系。方法　应用四唑蓝 (MTT)比色法检测 12份TSB和10份正常胆汁 (NB)对QBC93 9细胞增殖的影响 ,应用流式细胞仪测定细胞周期和凋亡。结果　TSB与NB比较 ,前者明显促进QBC 93 9细胞增殖 (P <0 .0 5 ) ;TSB处理 2 4h的QBC93 9细胞增殖指数显著上升 (P <0 .0 5 )。结论　TSB具有潜在的促增殖活性 ,TS与胆管癌的发生与发展关系密切。     

靶向survivin的shRNA对人胆管癌细胞体外增殖及凋亡的影响

目的：探讨靶向survivin的shRNA对人胆管癌细胞体外增殖及凋亡的影响。方法：合成具有互补序列的能够编码短发卡RNA（shRNA）的双链寡核苷酸并构建pSilencer2．1真核表达质粒,经稳定转染QBC939细胞后对转基因后胆管癌细胞的生物学行为进行观察。结果：neo基因稳定表达于转染阳性质粒及阴性对照质粒的QBC939细胞中。通过RT—PCR及westernblot检测证实shRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin表达率分别达68固％和613％。细胞计数及平板克隆形成实验显示转染细胞生长速度及细胞克隆明显减缓（P〈O．01）。流式细胞术测定细胞周期显示转染细胞G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少。DNAladder、透射电镜观察及流式细胞定量研究显示转染细胞凋亡明显增多。结论：靶向survivin的shRNA能有效抑制目的基因的表达,通过增加细胞凋亡在体外抑制人胆管癌细胞的生长,为胆管癌的基因治疗提供一定的实验基础。     

葡聚糖磁性纳米颗粒靶向rhNIS基因浓聚125Ⅰ对胆管癌细胞生长的影响

目的 观察基因载体葡聚糖磁性纳米颗粒(DMN)靶向rhNIS基因浓聚125Ⅰ对胆管癌细胞QBC939体外培养和体内接种生长状态的影响.方法 构建DMN-rhNIS-PDC316复合物并转染QBC939细胞,设立实验组(DMN-rhNIS-PDC316)、脂质体转染对照组(Liposome-rhNLS-PDC316)、空白对照组(PDC316),转染后加入3μg DMN-125Ⅰ复合物并外置300 mT磁场,流式细胞仪检测细胞凋亡率.45只胆管癌裸鼠瘤体模型随机分组(每组n=15),经裸鼠尾静脉注入3μg DMN-rhNIS-PDC316、3μg Liposome-rhNIS-PDC316和3μg PDC316并在瘤体设置300 mT磁场,半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定瘤体组织细胞内rhNIS-mRNA相对表达水平.另经尾静脉注入5μgDMN-125Ⅰ并外置500mT磁场,测定瘤体处125Ⅰ滞留率,观察治疗后瘤体大小变化.结果 流式细胞仪检测DMN-rhNIS-PDC316转染组细胞凋亡率为(20.12±1.62)%,明显高于其他两组(P<0.05),脂质体对照组凋亡率为(5.31±0.14)%,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),空白对照组凋亡率为(0.15±0.02)%;实验组瘤体细胞内rhNIS-mRNA表达水平较对照组明显增多;瘤体处125Ⅰ滞留率达到18.52%,明显高于对照组;125Ⅰ治疗后实验组抑瘤效应达到64.32%;瘤体体积明显小于对照组,其差异有统计学意义(P<0.05).结论 葡聚糖磁性纳米颗粒能有效靶向rhNIS基因转染胆管癌细胞并稳定表达,增加125Ⅰ的摄入量和滞留率,促进胆管癌细胞的凋亡,而且抑瘤效应明显.     

Survivin 抑制人胆管癌细胞凋亡相关信号通路的实验研究

目的:探讨survivin基因对人胆管癌细胞凋亡信号通路的调节机制.方法:构建针对survivin基因的siRNA和对照siRNA,将QBC939人胆管癌细胞分为3组,分别为siRNA-survivin转染组,对照siRNA转染组和未转染组.转染后,首先用Western blot检测未转染QBC939细胞和QBC939/siRNA(-)细胞及QBC939/siRNA(+)细胞中survivin的表达,验证干扰效果,继而分别用流式细胞仪,激酶活性测定和Western blot检测以上3种状态的QBC939细胞的凋亡情况,caspase-3的活性和caspase-3,caspase-9及procaspase-9凋亡信号分子的表达.结果:QBC939/siRNA(+)细胞survivin蛋白表达量明显低于未转染的QBC939细胞(P＜0.05),而QBC939/siRNA(-)细胞survivin蛋白表达量无明显改变(P＞0.05).与未转染的QBC939细胞比较,QBC939/siRNA(+)细胞凋亡明显增加,caspase-3活性明显升高,caspase-3和caspase-9表达明显上调,而procaspase-9表达降低(均P＜0.05);上述指标在QBC939/siRNA(-)细胞与未转染的QBC939细胞间的差异无统计学意义(均P＞0.05).结论:survivin基因可能通过促进procaspase-9的活化阻止caspase-3和caspase-9的激活,从而抑制胆管癌细胞的凋亡.     

尼美舒利对胆管癌QBC939细胞增殖的抑制作用

目的研究选择性环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制剂尼美舒利对人胆管癌细胞系QBC939细胞增殖的抑制作用。方法应用MTT比色法观察尼美舒利对QBC939细胞增殖的影响，细胞凋亡采用透射电镜及流式细胞仪检测，应用免疫组化法检测尼美舒利对QBC939细胞COX-2及增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达的影响。结果尼美舒利呈时间、剂量依赖性抑制QBC939细胞的增殖，降低QBC939细胞COX-2和PCNA的表达，流式细胞仪检测结果显示，随药物浓度增加，细胞凋亡率显著增加，透射电镜下可见典型的细胞凋亡形态学改变。结论尼美舒利显著抑制QBC939细胞的增殖，诱导其凋亡，且呈时间、剂量依赖性，其机理可能与其下调细胞内COX-2蛋白表达有关。     

幽门螺杆菌感染的成石胆汁促进人胆管癌细胞增殖的研究

目的探讨幽门螺杆菌感染的成石胆汁对人胆管癌细胞QBC939生长的影响，阐明幽门螺杆菌感染与胆管癌发生、发展的内在关系。方法应用噻唑蓝比色法检测20份幽门螺杆菌阳性胆管结石患者胆汁、20份幽门螺杆菌阴性胆管结石患者胆汁以及20份正常胆汁对QBC939细胞增殖的影响，运用流式细胞仪测定细胞周期与凋亡。结果与幽门螺杆菌阴性胆管结石患者胆汁和正常胆汁比较，幽门螺杆菌感染的成石胆汁明显促进QBC939细胞增殖（P〈0.05），用幽门螺杆菌感染的成石胆汁处理48h的QBC939细胞增殖指数显著上升（P〈0.01），S期细胞比例明显增高（P〈0.05），G0／G1期细胞比例明显降低（P〈0．05）。结论幽门螺杆菌感染的成石胆汁具有强大的潜在促增殖活性，胆道幽门螺杆菌感染与胆管癌的发生、发展关系密切。     

干扰X连锁凋亡抑制蛋白基因对人胆管癌QBC939细胞增殖及凋亡的作用

目的 观察反义寡核苷酸(ASODN)对人胆管癌QBC939细胞株X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)基因的抑制作用及对癌细胞增殖及凋亡的影响.方法 脂质体法将ASODN转染入QBC939细胞中,转染12、24、48 h后荧光显微镜观察转染后细胞状态及转染率,应用噻唑蓝(MTT)比色法、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法和流式细胞仪法测定1.11μmol/L时细胞生长抑制率、XIAP mRNA表达和细胞周期及凋亡率.结果 转染效率可达95%;与对照组比较,1.11μumol/L细胞抑制率为(27.63±1.15)%(24 h),(42.95±1.07)%(48 h);mRNA下调23%(P<0.05);G_0/G_1期细胞、凋亡率高于对照组约27.34%、9.94%(P<0.05).结论 ASODN能有效下调QBC939细胞XIAP基因表达,抑制细胞增殖并诱导凋亡.