氧化苦参碱对人非小细胞肺癌A549细胞凋亡的影响及其机制

目的 观察氧化苦参碱(OXY)对人非小细胞肺癌A549细胞凋亡的影响并探讨其机制.方法 噻唑蓝(MTT)法测定OXY对A549人肺癌细胞活力的作用.流式细胞术测定A549细胞凋亡率.荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和Westem blot方法测定OXY对A549细胞B淋巴细胞/白血病-2(bcl-2)、bcl-2相关X蛋白(bax) mRNA和蛋白表达的影响.Western blot方法测定OXY对A549细胞的细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基端激酶(JNK)、p38丝裂原活化激酶(p38MAPK)、磷酸化ERK(p-ERK)、p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表达的影响.结果 OXY可抑制A549细胞增殖.与对照组[(5.63±0.76)％]比较,OXY组细胞凋亡率[(13.26±2.15)％]上升(P＜0.01);与对照组(1.02±0.27、0.23±0.04)比较,OXY组bax mRNA(1.61±0.19)和蛋白(0.71±0.10)表达上升(P＜0.05,P＜0.01);与对照组比较(0.94 ±0.14、0.64±0.09),OXY组bcl-2mRNA(0.42±0.05)和蛋白(0.21±0.04)表达下降(P＜0.01).与对照组(0.29±0.03)比较,OXY组p-JNK表达水平(0.66 ±0.06)明显升高(P＜0.01),其他蛋白表达均无明显变化.与OXY组(0.66±0.07、0.28±0.03、0.65±0.08)比较,同时给予OXY和p-JNK抑制剂SP600125组bax蛋白表达(0.39±0.05)下降,bcl-2表达(0.50±0.08)上升,p-JNK蛋白(0.26 ±0.04)表达下降(P＜0.01).结论 OXY碱可诱导A549细胞凋亡,可能与升高p-JNK水平有关.     

醛固酮-WNK4途径参与盐负荷对上皮钠通道的调节

目的 通过建立生理条件下的盐负荷饮食大鼠模型,观察醛固酮和WNK4在水盐代谢调节中的作用。 方法 将SD大鼠分为5组：高盐组（H,4% NaCl）、正常盐组（N,0.4% NaCl）、低盐组（L,0.07% NaCl）、高盐加醛固酮组（H+A,4% NaCl+1 mg&#8226;kg-1&#8226;d-1醛固酮）、低盐加螺内酯（L+S,0.07% NaCl+0.1 g&#8226;kg-1&#8226;d-1螺内酯）,所有大鼠自由饮水,喂养2周。用放射免疫法检测血浆醛固酮的变化。应用实时定量PCR和Western印迹法检测大鼠肾脏上皮钠通道γ亚基（γENaC）、WNK4的mRNA和蛋白的变化。 结果 H组大鼠血浆醛固酮水平低于N组（P < 0.05）,H+A组高于H组（P < 0.05）;L组大鼠血浆醛固酮水平高于N组（P < 0.05）,显示SD大鼠造模成功。L组大鼠肾脏γENaC蛋白表达高于N组,但是L+S低于L组;同时H组低于N组,H+A组高于H组,差异均有统计学意义（P < 0.05）。mRNA变化趋势和蛋白变化趋势一致。H组肾脏WNK4的蛋白表达高于N组,但是H+A组低于H组;同时L组低于N组,L+S组高于L组,差异均有统计学意义（P < 0.05）。mRNA的变化趋势和蛋白的变化趋势一致。 结论 饮食中的盐可以调节γENaC在肾脏的蛋白表达,醛固酮和WNK4都参与了机体对盐的调节,WNK4受到醛固酮的负调节作用。     

泛连接蛋白1通道对睾丸癌Tcam-2细胞侵袭迁移的调控作用及可能机制

目的:探讨泛连接蛋白1(Panx1)在睾丸癌Tcam-2细胞侵袭迁移中的作用及可能机制。方法:用100μmol/L甘珀酸(CBX)和200μmol/L的丙磺舒(PBN)处理Tcam-2细胞后,采用实时荧光法检测细胞间荧光传递能力,化学发光法检测细胞外ATP浓度,Transwell法检测Tcam-2细胞的侵袭迁移能力,Western印迹法检测Panx1蛋白在睾丸间质细胞TM3和睾丸癌细胞Tcam-2中的表达及细胞外调节蛋白酶激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、波形蛋白、基质金属酶蛋白9 (MMP-9)和E-钙黏蛋白的表达。结果:Western印迹结果显示,与睾丸间质细胞TM3相比,Panx1蛋白在睾丸癌Tcam-2细胞中表达量显著增高[2.79±0.17 vs 1.00±0.06,P<0.05];用CBX和PBN处理Tcam-2细胞后,实时荧光法和化学发光结果显示,与对照组[(99.50±3.12)%]相比,CBX和PBN显著抑制荧光传递能力[分别下降至(61.54±3.30)%和(68.06±4.03)%,P<0.01]和降低细胞外ATP水平[(110±8.16)%vs(57.06±5.80)%、(56.42±7.70)%,P<0.01];Transwell法和细胞划痕法结果显示,与对照组相比,CBX和PBN显著抑制睾丸癌Tcam-2细胞迁移[(331.00±30.80)个vs(11.5±1.11)、(8.25±1.23),P<0.05)]和侵袭[细胞数目为(89.00±13.09)vs(11.75±3.77)、(11.5±3.5)个,P<0.01];Western印迹法结果显示,与对照组表达水平(0.98±0.03、1.093±0.09、1.00±0.09、1.13±0.04)相比,CBX和PBN显著抑制p-ERK1/2 (0.538±0.05、0.476±0.02,P<0.05)、波形蛋白(0.541±0.09、0.705±0.07,P<0.01)、MMP-9蛋白表达(0.439±0.08、0.557±0.065,P<0.01),增强E-钙黏蛋白表达(3.896±0.06、3.551±0.04,P<0.01)。结论:Panx1通道蛋白在睾丸癌Tcam-2细胞中表达量增高,CBX和PBN抑制Panx1通道后,Tcam-2细胞侵袭迁移能力降低     

丹参酮ⅡA通过抑制磷酸肌醇3激酶-蛋白激酶B-雷帕霉素靶蛋白-p70S6激酶1通路促进胃癌细胞在体外的自噬

目的 探讨丹参酮ⅡA(TanⅡA)体外对人胃癌SGC7901细胞自噬的影响及机制.方法 不同浓度(0.5、1、2和4 mg/L) TanⅡA作用体外培养的胃癌SGC7901细胞24、48、72 h后,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖活力的改变;TanⅡA(1、2和4mg/L)作用48 h,流式细胞术检测细胞自噬小体的含量;Western blot检测自噬相关蛋白Beclin-1和微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅱ的蛋白的表达水平及磷酸肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-p70S6激酶1(p70S6K1)的活性.结果 0.5 mg/L TanⅡA对胃癌SGC7901细胞没有明显的生长抑制作用,1、2和4 mg/L TanⅡA对胃癌SGC7901细胞则有明显的生长抑制作用,且抑制作用呈剂量和时间依赖性(P＜0.05);流式细胞分析结果显示,1、2和4 mg/L TanⅡA组细胞内酸性自噬小体含量分别为(9.77±1.92)、(13.28 ±2.95)和(16.54±3.28)％,与对照组(4.16±0.64)％比较,差异有统计学意义(P＜0.05);Westem blot结果显示,1、2和4 mg/L TanⅡA作用后胃癌SGC7901细胞中Beclin-1的相对表达量为0.62±0.12、0.71±0.11和0.85±0.13,与对照组(0.37±0.05)比较,差异有统计学意义(P＜0.05);1、2和4 mg/L TanⅡA作用后胃癌SGC7901细胞中LC3-Ⅱ的相对表达量为0.48±0.06、0.65 ±0.11和0.86 ±0.14,与对照组(0.31±0.03)比较,差异有统计学意义(P＜0.05);此外,1、2和4 mg/L TanⅡA作用后胃癌SGC7901细胞PI3K-Akt-mTOR-p70S6K1活性则下降(P＜0.05).结论 TanⅡA可通过抑制PI3 K-Akt-mTOR-p70S6K1信号通路促进人胃癌SGC7901细胞自噬.     

表皮生长因子对人小细胞肺癌细胞Survivin表达的影响及其机制

目的 探讨表皮生长因子(EGF)对人小细胞肺癌NIC-H446细胞中凋亡抑制因子Survivin表达的影响及其调控Survivin的机制.方法 噻唑蓝(MTT)法测定EGF对细胞增殖率的作用.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(Western blot)方法测定EGF对NIC -H446细胞Survivin表达的影响.Western blot方法测定EGF对NIC-H446细胞p38丝裂原活化激酶(p38MAPK)、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、c-Jun氨基端激酶(JNK)、磷酸化JNK (p-JNK)、细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、磷酸化ERK(p-ERK)信号通路蛋白的表达影响.结果 EGF可促进NIC-H446细胞增殖,具有浓度-时间依赖性.与对照组(0.36±0.06、0.57 ±0.15)比较,EGF组Survivin mRNA(0.69±0.12)和蛋白(0.89±0.19)表达明显升高(P＜0.01).与对照组(0.29±0.08)比较,EGF组p-p38MAPK蛋白表达水平(0.68±0.27)明显上升(P＜0.01),其他蛋白表达均无明显变化.EGF+ SB203580组Survivin蛋白表达(0.56±0.17)、p-p38MAPK蛋白表达(0.41±0.11)显著低于EGF组(0.92 ±0.21、0.72 ±0.19,P＜0.01),与对照组比较差异无统计学意义.结论 EGF通过活化p38MAPK信号通路上调小细胞肺癌细胞中Survivin的表达,促进细胞增殖,这可能是小细胞肺癌发展的重要机制.     

S期激酶相关蛋白2调控大鼠系膜细胞增殖

目的 探讨S期激酶相关蛋白2（Skp2）表达变化对系膜细胞增殖的影响。 方法 设计合成大鼠Skp2 siRNA和对照siRNA、pIRES-GFP-Skp2质粒和pIRES-GFP质粒。采用脂质体转染法进行细胞转染。半定量PCR和Western印迹法检测Skp2的mRNA、蛋白表达。原代培养的大鼠系膜细胞以每孔3000个接种于96孔板,分为以下6组：（1）无血清组;（2）20％胎牛血清（FCS）组;（3）10％FCS+pIRES-GFP质粒转染组;（4）10％FCS+pIRES-GFP-Skp2质粒转染组;（5）20％FCS+对照siRNA组;（6）20％FCS+Skp2 siRNA组。四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞相对活力和相对细胞数;BrdU标记法检测S期细胞;流式细胞仪检测细胞周期。 结果 半定量PCR法结果显示,与阴性对照siRNA组相比,Skp2 siRNA转染后Skp2 mRNA表达显著下调。Western印迹结果显示,与pIRES-GFP质粒转染组相比,pIRES-GFP-Skp2质粒转染后Skp2蛋白表达显著上调。MTT、BrdU和细胞周期分析显示,与相应对照组相比,Skp2质粒转染后相对细胞数增加（A值：0.419±0.088 比 0.305±0.036,P ＜ 0.01）、S期细胞数增多（BrdU 阳性细胞：0.21±0.04比0.15±0.03,P ＜ 0.01;S期细胞数：20.18±0.64比14.33±0.37,P ＜ 0.01）;Skp2 siRNA转染后相对细胞数减少（A值：0.328±0.069比0.482±0.133,P ＜ 0.01）;S期细胞数减少（BrdU 阳性细胞：0.17±0.01比0.24±0.00,P ＜ 0.01;S期细胞数：16.52±0.75比23.81±1.25,P ＜ 0.01）。 结论 Skp2过表达促进系膜细胞增殖,下调Skp2表达可抑制系膜细胞增殖。     

异氟醚和七氟醚对人肺腺癌A549细胞迁移及细胞分裂周期蛋白42、成束蛋白表达的影响

目的 观察异氟醚和七氟醚对人肺腺癌A549细胞迁移及细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42,Cdc42)和成束蛋白( Fascin)表达的影响.方法 人肺腺癌A549细胞接种于培养板,培养24 h后,按随机数字表法分为3组(每组6例):对照组(C组)、2.3％异氟醚组(Iso组)、3.4％七氟醚组(Sev组).Iso组和Sev组的A549细胞分别暴露于2.3％异氟醚或3.4％七氟醚2、4、6h.C组不接受异氟醚或七氟醚处理.3组处理结束后,继续培养24 h.于24 h时,采用Transwell法检测各组A549细胞处理2、4、6h后的迁移细胞数目,蛋白印迹法检测各组A549细胞处理4h的Cdc42和Fascin表达水平.结果 与C组和Iso组比较,Sev组的迁移细胞数目降低[(102±21)、(97±19)、(105±30)、(104±27)、(92±20)、(90±18) vs(81±16)、(65±11)、(42±9)](P＜0.05)；与C组和Iso组比较,Sev组的Cdc42表达下调[(75±l6)％,(79±13)％vs(31±7)％](P＜0.05)；与C组和Iso组比较,Sev组的Fascin表达下调[(71±13)％、(77±18)％vs(40±8)％](P＜0.05).结论 七氟醚能抑制人肺腺癌A549细胞的迁移,该效应可能与抑制Cdc42和Fascin表达有关.异氟醚无抑制A549细胞迁移的效应.     

二氢青蒿素对胃癌细胞株SGC7901增殖的影响

目的 观察二氢青蒿素(DHA)对胃癌细胞株SGC7901增殖的影响及作用机制.方法 SGC7901细胞分为DHA组和对照组,DHA组分别加入浓度为6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/LDHA的培养基,对照组加入等体积含0.1％ DMSO的培养基.不同浓度DHA处理SGC7901细胞24、48和72 h后,MTT法检测细胞的增殖情况.不同浓度DHA处理SGC7901细胞24h后,流式细胞仪测定细胞周期的分布;100 μmol/L DHA处理细胞24h后,采用Western blot法测定细胞周期蛋白A(Cyclin A)、Cyclin D1、Cyclin E、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和P16蛋白的表达水平;免疫共沉淀检查CDK4与Cyclin D1和P16之间的相互作用.采用单因素方差分析和t检验进行统计学分析.结果 6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L DHA分别处理SGC7901细胞24、48和72 h,均明显抑制细胞增殖(F =78.66,235.37,93.75,P＜0.05);与对照组比较,不同浓度DHA组G0/G1期细胞比例均明显上升(F=18.42,P＜0.05);100.00 μmol/L DHA处理细胞24h,Cyclin D1和CDK4蛋白的相对表达量分别为0.17±0.05、0.24±0.06,较对照组的0.67±0.15、0.64 ±0.18明显下降(t=7.746,5.164,P＜0.05);DHA组Cyclin E蛋白的相对表达量为0.35 ±0.06,较对照组的0.42±0.06也有下降,但差异无统计学意义(t=2.021,P＞0.05);DHA组和对照组Cyclin A蛋白的相对表达量分别为0.38 ± 0.08和0.35 ±0.09,两组比较,差异无统计学意义(t=1.266,P＞0.05);与对照组P16蛋白相对表达量(0.29±0.07)比较,DHA组P16蛋白相对表达量(0.54±0.12)显著升高(t=4.408,P＜0.05).免疫共沉淀结果示DHA处理SGC7901细胞后,CDK4与Cyclin D1结合减少,与P16结合增加.结论 DHA将SGC7901细胞周期阻滞于G0/G1期,其主要机制可能与下调Cyclin D1和CDK4表达、上调P16表达,抑制Cyclin D1与CDK4的结合,促进P16与CDK4的结合有关.     

BK通道对大鼠脑缺血再灌注损伤神经细胞内钙离子浓度及凋亡的影响

目的 观察BK通道对脑缺血再灌注损伤神经细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)和对神经元凋亡的影响。方法 将108只SD大鼠随机分为假手术组(SS组,n=36)、脑缺血再灌注组(IR组,n=36)、脑缺血再灌注且脑室内Iberiotoxin(IBTX)处理组(IBTX组,n=36),分别比较各组在不同再灌注时间后神经功能缺损评分、脑梗死面积,利用激光共聚焦显微镜技术测定各组[Ca2+]i浓度,免疫组织化学和TUNEL法分别检测BK通道表达和神经元细胞凋亡。结果 IBTX处理组在再灌注24h后神经功能缺损评分为(2.17±0.44)明显高于IR组(1.83±0.42,P＜0.05);脑梗死体积(27.97±5.84)％明显大于SS组(22.83±4.74)％(P＜0.05);激光共聚焦显微镜结果显示:IBTX处理组24h点[Ca2+]i为(914.50 ±86.57) nmol/L较SS组(732.09 ±51.30) nmol/L明显升高(P＜0.01),TUNEL细胞凋亡检测显示IBTX处理组24h神经细胞凋亡率为(15.20±6.11)％,与IR组(10.49±1.91)％比较差异有统计学意义(P＜0.05),免疫组织化学结果显示缺血再灌注损伤后BK通道的表达增加,但组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论 在缺血状态下,BK通道对神经细胞具有保护作用,其机制很可能是通过降低神经细胞内钙离子浓度和减少细胞的凋亡。     

血管内皮生长因子对关节软骨细胞基质金属蛋白酶-13表达的影响

目的 观察血管内皮生长因子(VEGF)对体外培养的关节软骨细胞基质金属蛋白酶-13(MMP-13)表达的影响.方法 体外培养SD乳鼠关节软骨细胞,分为4组,每组加入不同处理因素进行干预,A组:(对照组)不加任何处理因素;B组:10 μg/L VEGF;C组:10 μg/L白细胞介素(IL)-1β;D组:10 μg/L VEGF+ 10 μg/L IL-1β.采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测MMP-13 mRNA的表达,蛋白免疫印迹法检测MMP-13蛋白的表达.结果 B组(0.88±0.47)、C组(3.69 ±0.45)及D组(3.85 ±0.48)的MMP-13 mRNA表达水平均显著高于A组(0.73±0.56),D组软骨细胞MMP-13的mRNA表达水平明显高于B组(P＜0.01)及C组(P＜0.05).与A组(0.36 ±0.17)比较,B组(0.63±0.21)、C组(0.76±0.24)及D组(0.99±0.26)的MMP-13蛋白表达水平显著升高,D组MMP-13的蛋白表达水平明显高于B组(P＜0.05)及C组(P＜0.05).结论 在骨关节炎的发病过程中VEGF可能通过上调软骨细胞MMP-13的表达发挥重要作用.     

Effects of WNK3 kinase on regulation of large-conductance calcium-activated potassium channels and its mechanisms

Objective To investigate the effects of WNK3 kinase on the regulation of large-conductance calcium-activated potassium channels (Maxi K channels) on African green monkey kidney fibroblast-like cells (Cos-7 cells) and its mechanisms. Methods (1) Cos-7 cells were transfected with 0, 0.6, 1.2, 1.8 μg WNK3 plasmid+0.5 μg Maxi K plasmid. The total protein expression of Maxi K channel and the phosphorylation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) extracellular regulated kinase-1 and-2 (ERK1/2) were detected by Western blotting. (2) Cos-7 cells were divided into the control group (2.5 μg Maxi K plasmid) and the experimental group (2.5 μg WNK3 plasmid+2.5 μg Maxi K plasmid). Cell surface biotinylation was used to investigate the cell surface protein expression of Maxi K channel in Cos-7 cells. Immunoprecipitation and Western blotting were used to detect the ubiquitination of Maxi K channel protein. (3) WNK3 kinase was knocked down by WNK3 siRNA. The lysosomal degradation pathway was blocked by the proton pump inhibitor (Baf-A1). Cos-7 cells were divided into Maxi K+negative control siRNA group, Maxi K+WNK3 siRNA group and Maxi K+WNK3 siRNA+Baf-A1 group. The protein expression of Maxi K channel protein was detected by Western blotting. Results (1) Compared with those in 0 μg WNK3 plasmid groups, in 0.6, 1.2, 1.8 μg WNK3 plasmid groups the total protein expression of the Maxi K channel increased and the phosphorylation level of MAPK ERK1/2 reduced on a dose-dependent manner (all P＜0.01). (2) Compared with those in the control group, the total protein expression and cell surface membrane protein expression of the Maxi K channel increased in the experimental group (P＜0.01), while the ubiquitination of the Maxi K channel protein reduced (P＜0.01). (3) Compared with the Maxi K+negative control siRNA group, the expression of Maxi K protein reduced in the Maxi K+WNK3 siRNA group (P＜0.01), but did not change in the Maxi K+WNK3 siRNA+Baf-A1 group (P＞0.05). The expression of Maxi K protein in Maxi K+WNK3 siRNA+Baf-A1 group was higher than that in Maxi K+WNK3 siRNA group (P＜0.01). Conclusions WNK3 kinase inhibits the lysosomal degradation pathway of Maxi K channel protein by reducing the ubiquitination of Maxi K channel, and promotes the expression of Maxi K channel protein in cells and on cell membrane. These effects may be achieved by suppressing MAPK ERK1/2 signal transduction pathway.     

WNK4 kinase regulates surface expression of the human sodium chloride cotransporter in mammalian cells

Pseudohypoaldosteronism type II (PHA II) is caused by mutations of two members of WNK ((with no lysine (k)) kinase family. WNK4 wild type (WT) has been shown to inhibit the activity and surface expression of sodium chloride cotransporter (NCC) when expressed in Xenopus oocytes. Here, we have studied NCC protein processing in mammalian cells in the presence or absence of WNK4 WT and its mutants, E562K and R1185C, by surface biotinylation, Western blot, co-immunoprecipitation (Co-IP) and immunostaining. WNK4 WT significantly reduced NCC surface expression in Cos-7 cells (58.9+/-6.8% vs 100% in control, P<0.001, n=6), whereas its mutant E562K has no significant effect on NCC surface expression (92.9+/-5.3% vs 100%, P=NS, n=6). Another mutant R1185C still partially reduces surface expression of NCC (76.2+/-11.8% vs 100%, P<0.05, n=6). The reduction of NCC surface expression by WNK4 WT (62.9+/-3.3% of control group) is not altered by WT dynamin ((61.8+/-3.7% (P=NS)) or its mutant K44A ((65.4+/-14.1% (P=NS)). A Co-IP study showed that both WNK4 WT and WNK4 E562K interact with NCC. Furthermore, a proton pump inhibitor, bafilomycin A1, partially reverses the inhibitory effect of WNK4 WT on NCC expression. Our data suggest that WNK4 WT significantly inhibits NCC surface expression, which is not owing to an increase in clathrin-mediated endocytosis of NCC, but likely results from enhanced degradation of NCC through a lysosomal pathway.     

WNK1 Activates Large-Conductance Ca2+-Activated K+ Channels through Modulation of ERK1/2 Signaling

With no lysine (WNK) kinases are members of the serine/threonine kinase family. We previously showed that WNK4 inhibits renal large-conductance Ca²⁺-activated K⁺ (BK) channel activity by enhancing its degradation through a lysosomal pathway. In this study, we investigated the effect of WNK1 on BK channel activity. In HEK293 cells stably expressing the α subunit of BK (HEK-BKα cells), siRNA-mediated knockdown of WNK1 expression significantly inhibited both BKα channel activity and open probability. Knockdown of WNK1 expression also significantly inhibited BKα protein expression and increased ERK1/2 phosphorylation, whereas overexpression of WNK1 significantly enhanced BKα expression and decreased ERK1/2 phosphorylation in a dose-dependent manner in HEK293 cells. Knockdown of ERK1/2 prevented WNK1 siRNA-mediated inhibition of BKα expression. Similarly, pretreatment of HEK-BKα cells with the lysosomal inhibitor bafilomycin A1 reversed the inhibitory effects of WNK1 siRNA on BKα expression in a dose-dependent manner. Knockdown of WNK1 expression also increased the ubiquitination of BKα channels. Notably, mice fed a high-K⁺ diet for 10 days had significantly higher renal protein expression levels of BKα and WNK1 and lower levels of ERK1/2 phosphorylation compared with mice fed a normal-K⁺ diet. These data suggest that WNK1 enhances BK channel function by reducing ERK1/2 signaling-mediated lysosomal degradation of the channel.     

Six同源盒蛋白4蛋白在肝癌组织的表达及其对肝癌细胞恶性细胞生物学行为的影响

目的探讨Six同源盒蛋白4(Six homeobox 4,Six4)蛋白在肝癌中表达及对肝癌细胞增殖、迁移和上皮-间充质转化的影响。方法选取2018年6月到2019年6月新乡医学院第一附属医院收集的169例肝癌组织和对应的癌旁组织作为研究对象,采用免疫组织化学分析肝癌组织和癌旁组织中Six4蛋白表达水平;采用常间回文重复序列丛集-Cas9(CRISPR-Cas9)在人类肝癌细胞HepG2中建立Six4敲除细胞系,命名为对照组和SIX4 KO组。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色分析两组细胞增殖;采用Transwell分析两组细胞迁移;采用蛋白质印迹法(Western blot)分析上皮间质标志物上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达水平,计量数据比较采用t检验。结果肝癌组织中Six4蛋白表达水平(169.59±18.59)高于癌旁组织(79.43±10.43),差异有统计学意义(t=4.179,P<0.05)。本研究成功构建Six4敲除细胞系。Six4 KO组细胞吸光值(1.21±0.19)低于对照组(2.15±0.28),差异有统计学意义(t=3.441,P<0.05)。对照组细胞EdU染色阳性率(76.45±8.90)%明显高于Six4 KO组细胞(31.63±7.43)%,差异有统计学意义(t=4.693,P<0.05)。Six4 KO组细胞迁移数量(65.64±9.99)个低于对照组(119.48±12.08)个,差异有统计学意义(t=3.748,P<0.05)。Six4 KO组细胞E-cadherin相对表达水平(1.49±0.21)高于对照组(0.33±0.11),差异有统计学意义(t=5.184,P<0.05)。Six4 KO组细胞间质标记物N-cadherin和Vimentin相对表达水平(0.58±0.11、0.68±0.23)低于对照组(1.74±0.28、1.89±0.26),差异均有统计学意义(t=4.274、4.109,P<0.05)。结论SIX4蛋白在肝癌组织中呈高表达,参与肝癌细胞增殖、迁移和上皮-间充质转化等恶性细胞生物学行为。     

瞬时感受器电位离子通道香草素受体4在睾丸缺血再灌注损伤中对GC-1细胞增殖及凋亡的作用及其机制

目的探讨瞬时感受器电位离子通道香草素受体4(TRPV4)在睾丸缺血再灌注损伤(IRI)中对GC-1细胞增殖和凋亡的作用及其机制。方法建立睾丸GC-1细胞缺氧复氧模型,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测不同复氧损伤时间点TRPV4的表达变化;分别采用噻唑蓝(MTT)实验、流式细胞术检测转染TRPV4对GC-1细胞增殖和凋亡的影响;采用Western blot法检测睾丸组织中转染TRPV4对GC-1细胞中半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3和细胞色素C(Cyt-C)表达的影响,组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果对照组及缺氧复氧组(0、6、12、24、48和72 h)TRPV4的蛋白表达水平分别为0.19±0.02、0.35±0.03、0.42±0.04、0.46±0.04、0.62±0.05、0.54±0.05、0.45±0.04。缺氧复氧组TRPV4表达显著高于未缺氧GC-1细胞的对照组,并在复氧24 h达到峰值(F=6.898,P<0.05),差异有统计学意义;缺氧复氧组中细胞增殖水平明显低于对照组(52.32±4.58比100.00±7.63,t=-9.280,P<0.05),差异有统计学意义,细胞凋亡水平高于对照组(15.60±1.72比4.08±0.87,t=10.352,P<0.05),差异有统计学意义;过表达TRPV4组中细胞增殖水平低于其对照组(23.65±3.98比51.35±4.67,t=-7.820,P<0.05),差异有统计学意义,细胞凋亡水平高于其对照组(26.93±2.15比14.62±1.68),t=7.814,P<0.05),差异有统计学意义;沉默TRPV4组中细胞增殖水平高于其对照组(72.49±6.21比53.18±5.14,t=4.150,P<0.05),差异有统计学意义,细胞凋亡水平低于其对照组(9.71±1.25比15.07±1.64,t=-4.502,P<0.05),差异有统计学意义。缺氧复氧组中Caspase-3和Cyt-C表达水平高于对照组(0.70±0.06比0.20±0.02,t=13.693,P<0.05;0.74±0.07比0.26±0.03,t=10.917,P<0.05),差异有统计学意义;过表达TRPV4组中Caspase-3和Cyt-C表达水平高于其对照组(1.25±0.11比0.69±0.07,t=7.439,P<0.05;1.38±0.14比0.72±0.07,t=7.303,P<0.05),差异有统计学意义;沉默TRPV4组中Caspase-3和Cyt-C表达水平低于其对照组(0.46±0.05比0.68±0.06,t=-4.879,P<0.05;0.45±0.05比0.72±0.06,t=-5.988,P<0.05),差异有统计学意义。结论TRPV4在GC-1细胞中高表达,其可能通过改变GC-1细胞的增殖和凋亡能力,从而影响睾丸IRI的发生发展。     

微小RNA-142-3p靶向CD133对肝癌细胞增殖、侵袭和干细胞特性的影响

目的:观察微小RNA(miR)-142-3p靶向CD133对肝癌细胞增殖、侵袭和干细胞特性的影响。方法:选取郑州大学第二附属医院2017年6月至2019年12月手术切除的肝癌组织和对应的癌旁组织作为研究对象。采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析癌旁组织和肿瘤组织miR-142-3p表达水平。采用慢病毒在MHCC97H...     

微小RNA-200c对人胰腺癌干细胞上皮-间充质转化的作用

目的观察微小RNA-200c(miR-200c)在人胰腺癌干细胞上皮-间充质转化(EMT)中的作用。方法应用流式细胞术(FACS)在人胰腺癌细胞株PANC-1中分选出以CD24⁺CD44⁺ESA+作为标志物的胰腺癌干细胞。将miR-200c前体片段和阴性对照片段分别转染到胰腺癌干细胞中。应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)和miR-200c的表达。Transwell试验检测细胞的侵袭能力。采用t检验。结果人胰腺癌细胞株PANC-1中分选出CD24⁺CD44⁺ESA+细胞(0.8%)。miR-200c在胰腺癌干细胞中的相对表达值(0.15±0.01)显著低于PANC-1细胞(1.00±0.09),差异有统计学意义(t=3.306,P<0.05)。胰腺癌干细胞平均穿膜细胞数[(321.00±7.62)个]明显高于PANC-1细胞[(70.00±16.47)个],差异有统计学意义(t=2.152,P<0.05)。转染miR-200c前体片段24 h后的胰腺癌干细胞中miR-200c的相对表达值(3.70±0.42)明显高于转染阴性对照片段的胰腺癌干细胞中miRNA-200c的相对表达值(0.22±0.21),差异有统计学意义(t=2.073,P<0.05)。E-cadherin、vimentin、ZEB1 mRNA在转染miRNA-200c前体片段的胰腺癌干细胞中的表达分别为(3.12±0.02)×10^-4、0.36±0.15、(0.38±0.07)×10^-4,在转染阴性对照片段的胰腺癌干细胞中的表达分别为(1.31±0.05)×10^-4、1.16±0.08、(1.13±0.03)×10^-4,两组比较差异有统计学意义(t=1.941、2.165、2.308,P<0.05)。转染miR-200c前体片段后的胰腺癌干细胞的平均穿膜细胞数[(80.00±5.35)个]明显低于转染阴性对照片段的干细胞[(310.00±19.41)个],两组比较差异有统计学意义(t=2.613,P<0.05)。结论miR-200c过表达可以抑制胰腺癌干细胞的上皮-间充质转化,逆转其侵袭能力。     

Cellular mechanisms of WNK4-mediated regulation of ion transport proteins in the distal tubule

Gene mutations in WNK4 kinase cause a genetic form of hypertension by affecting multiple ion transport pathways through different mechanisms. Cai et al. report that the inhibitory effect of WNK4 on the thiazide-sensitive sodium-chloride cotransporter occurs through the lysosomal degradation pathway in mammalian cells.     

环状RNA-7靶向微小RNA-7促进食管鳞癌细胞放疗抵抗的实验研究

目的:探讨环状RNA-7(circularRNA, ciRS)-7在食管鳞癌细胞放疗抵抗中的作用及生物学机制。方法:采用慢病毒转染食管鳞癌细胞系KYSE410和KYSE510构建ciRS-7敲降细胞系(分为正常对照组和sh#1组、sh#2组)。不同剂量射线(2 Gy组、4 Gy组、8 Gy组)照射上述细胞,收集各组细胞...     

多囊蛋白1氨基段融合蛋白对肾小球系膜细胞细胞外基质及其降解基因表达的影响

目的研究多囊蛋白-1氨基段（PC-INF）融合蛋白对大鼠肾小球系膜细胞（RMC）Ⅳ型胶原及其降解调控基因表达的影响。方法用实时荧光定量RT-PCR法检测PC-1NF融合蛋白对RMCIV型胶原和细胞外基质（ECM）降解调控基因基质金属蛋白酶、金属蛋白酶1组织抑制剂（MMP-2、TIMP-1）表达的作用。ELISA方法检测培养的细胞上清液中Ⅳ型胶原含量的变化。免疫细胞化学方法观察融合蛋白对细胞核因子c-jun和c-fos表达的影响。Western印迹检测融合蛋白对蛋白激酶C（PKC）-α信号转导通路的影响。结果4mg／LPC-1NF融合蛋白作用48h后，RMCⅣ型胶原mRNA从（103±16）降至（82±11）拷贝，106GAPDH，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05），培养上清液中的IV型胶原含量也明显降低；MMP2mRNA从（1150±90）升至（2770±）拷贝，106GAPDH，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01），而TIMP-1mRNA从（5530±480）降至（3040±370）拷贝，106GAPDH，与对照组差异有统计学意义（P〈0．01）。DAB染色显示，融合蛋白作用后，RMC的c-jun和c-fos表达受到明显抑制。RMC经不同浓度PC-1NF融合蛋白作用48h后，随着融合蛋白浓度升高。PKC-α的表达逐渐减弱。结论PC-1NF融合蛋白可通过上调促进ECM降解的MMP-2和抑制ECM降解的TIMP-1之间的比值而促进Ⅳ型胶原降解；还可能通过PKC-α信号转导通路，抑制c-ju．和c-fos表达，从而抑制RMC的增殖和ECM的合成。