共信号分子CD40/CD40L质粒标准品的构建

背景：目前,对CD40/D40L的研究主要集中在可溶性和蛋白方面,对其在转录水平上的研究文献不多,可能与其无商品化质粒标准品有关。 目的：构建检测CD40/CD40L mRNA表达水平差异的标准品。 设计、时间及地点：单一样本实验,于2009-04在苏州大学附属第一医院检验科实验室完成。 材料：取手术切除的子宫肌瘤组织,经患者知情同意。 方法：以手术切除的子宫肌瘤组织细胞的总RNA为模板、Random 6mers为引物反转录合成cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人CD40/CD40L基因相应的cDNA片断,构建PMD-18-CD40/CD40L重组质粒,鉴定测序后,用荧光定量PCR制作标准曲线。 主要观察指标：①RNA质量检测结果。②扩增的目的片段电泳结果。③CD40/CD40L基因测序结果。④标准品的扩增情况。 结果：组织提取的总RNA完整性良好,构建的CD40/CD40L质粒经PCR扩增后分别得到136 bp,200 bp的清晰条带,测序结果与目的片段完全一致,且质粒的原始浓度为2.66×1013、2.45×1013 copies/mL,倍比稀释至2.0×106 copies/mL均能得到良好的标准曲线(R2=1)。 结论：实验成功构建了CD40/CD40L基因荧光定量PCR标准质粒。     

Taqman探针定量检测ICOS/ICOSL基因表达的方法

背景：近年来可诱导共刺激分子(inducible costimulator, ICOS)/可诱导共刺激分子配体(ICOS Ligand,ICOSL)在抗感染、抗移植反应、抗肿瘤、治疗自身免疫性疾病等多方面领域受到了越来越多的关注。目前对ICOS/ICOSL表达量的研究大多基于分子水平,国内外尚鲜见ICOS/ICOSL mRNA定量检测的报道。 目的：构建ICOS/ICOSL cDNA质粒标准品,建立Taqman探针检测ICOSL/ICOSL基因表达量的方法。 方法：以胃腺癌组织总RNA为模板、Random 9 mers为引物反转录合成cDNA,用该cDNA为模板聚合酶链反应扩增人ICOS/ICOSL基因相应的cDNA目的片段,构建PMD-18-ICOS/ICOSL重组质粒,鉴定测序后,用Taqman探针实时荧光定量聚合酶链反应制作标准曲线。 结果与结论：组织提取的总RNA完整性良好,构建的ICOS/ICOSL质粒测序结果与目的片段一致,质粒的原始浓度为6.10×1013,4.31×1013 copies/mL,倍比稀释后用Taqman探针荧光定量聚合酶链反应检测,在1012~1013 copies/mL线性关系良好(R2=1),提示成功建立了Taqman探针定量检测ICOS/ICOSL基因表达的方法。 关键词：共信号分子;可诱导共刺激分子;配体;mRNA;实时定量聚合酶链反应     

叉头转录因子1质粒标准品的构建

背景：研究表明叉头转录因子1是一种新的2型糖尿病易感基因,但2型糖尿病患者与健康人的叉头转录因子1基因在转录水平上差异性的研究不多。由于还没有商品化叉头转录因子1的质粒标准品,因此有必要构建其标准品。 目的：构建应用实时荧光定量-聚合酶链反应检测叉头转录因子1 mRNA的质粒标准品。 设计、时间及地点：单一样本重复实验,于2007-11/2008-03在苏州大学附属第一医院检验科实验室完成。 材料：SYBR ExScript TM反转录-聚合酶链反应Kit试剂盒,SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒,凝胶回收纯化DNA试剂盒,质粒DNA小量纯化试剂盒,PMD18-T Vector试剂盒等。 方法：从健康志愿者血标本中提取总RNA,反转录合成cDNA,以cDNA为模板应用聚合酶链反应扩增出目的片段,对其回收纯化连接到PMD18-T载体及转化JM109,阳性克隆经测序分析,确认重组质粒正确。抽提重组质粒,用紫外分光光度仪测定其浓度,再根据公式换算成拷贝浓度,最后稀释成梯度标准品。 主要观察指标：重组质粒聚合酶链反应和基因测序结果,标准品标准曲线的相关系数及标准品的重复性。 结果：成功构建了叉头转录因子1质粒标准品,通过聚合酶链反应及基因测序鉴定其目的片段已成功插入载体。各稀释度的标准品经荧光定量-聚合酶链反应扩增后,其循环阈值与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系,线性范围是2.39×(105~1012) copies/mL。各稀释度标准品的批内重复性好,其变异系数范围为0.29%~1.16%。 结论：实验成功构建了具有较好灵敏度和重复性的叉头转录因子1质粒标准品。     

阿尔茨海默病患者外周血APP mRNA水平的变化

目的建立荧光定量PCR方法检测Alzheimer病(AD)患者外周血中淀粉样蛋白前体 (APP)的 mRNA水平,并探讨该基因在AD患者外周血中的表达及意义。方法根据APP的基因序列,设计并合成引物和荧光标记探针。将PCR扩增目的片段用AT克隆的方法克隆入T载体,重组质粒经筛选、鉴定后,作为阳性模板,用于标准曲线的制定和样品检测。用该方法检测30例AD患者和 23例正常老年人对照组外周血中APP基因的mRNA水平。结果应用重组质粒制作的定量曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系。AD组APP基因平均表达水平为(2．54×105±1．53×105) copies/μgRNA,高于对照组(6．03×104±7．58×105)copies／μgRNA(P<0．001)。结论荧光定量PCR检测AD患者APP mRNA水平的方法较常规PCR技术更为简便、快速、准确。用该法测得APP在AD患者外周血中的mRNA水平有所增加。     

实时荧光定量RT-PCR法建立版纳微型猪近交系中厚皮创面转化生长因子表达体系*◆

背景：版纳微型猪近交系能较好的模拟人取皮区创面,构建动物模型,检测与创面愈合及瘢痕形成密切相关的转化生长因子的表达。 目的：观察创面愈合过程中转化生长因子β1基因的表达情况。 方法：利用版纳微型猪近交系4~6月龄猪构建了皮肤创面愈合动物模型,通过提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,对与创面愈合相关密切的转化生长因子β1基因进行了RT-PCR扩增。纯化目的片段并与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR。 结果与结论：建立的转化生长因子β1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法特异性较好,检测灵敏度可达103 拷贝/µL,线性范围达103~109拷贝/µL,阈值循环数与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在良好的线性关系(R2=0.988),扩增效率高(E=107.433%)。利用该检测体系检测了45份样品,效果良好,该方法可为研究TGF-β1基因在创面愈合过程中的作用机理奠定分子生物学基础。     

携带绿色荧光蛋白基因的APP695真核细胞表达载体的构建及鉴定

目的 构建大鼠淀粉样前体蛋白(APP)695基因真核细胞荧光表达载体,进行细胞转染、表达,为阿尔茨海默病(AD)治疗药物的研究提供一种有效的细胞模型.方法 设计并合成APP695基因的引物,以携带APP695基因的真核细胞表达载体pCB6质粒为模板,PCR扩增得到APP695基因全序列:将APP695基因连接到携带绿色荧光蛋白基因的载体pIRES2-EGFP上;应用酶切分析、PCR检测及DNA测序分析等鉴定所构建的真核细胞表达载体.结果 以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知APP695基因大小相同,酶切也得到目的 基因片段,测序结果显示与已知APP695基因序列相同.结论 成功构建了携带绿色荧光蛋白基因的APP695基因真核细胞表达载体,为AD治疗药物的研究提供了一种有效的分子工具.     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组腺病毒★

目的：AdEasy系统可在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒之间的高效同源重组，经抗生素培养板筛选重组体，然后转染293细胞获得重组病毒，极大简化了载体的构建过程。实验利用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组腺病毒。 方法：实验于2006-08/2007-05在青岛大学医学院病毒学实验室完成。①实验材料：清洁级SD大鼠5只，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV，骨架质粒pAdeasy-1，大肠杆菌BJ5183和DH10B，人胚肾293细胞均由青岛大学医学院微生物教研室罗兵教授惠赠。②实验方法：从脂多糖刺激培养的大鼠脾细胞中提取细胞总RNA，应用反转录多聚酶链反应技术扩增白细胞介素10 cDNA，定向亚克隆至pAdtrack-CMV中构建腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-IL-10，酶切线性化后转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌中，获得重组腺病毒质粒pAd-IL-10，Lipofectamin包装转染293细胞，获得重组腺病毒vAd-IL-10，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。将293细胞接种于96孔板中，每孔1×104个细胞，浓缩后的病毒贮存液按不同比例稀释加至培养板中，测定重组腺病毒滴度。用重组腺病毒vAd-IL-10感染293细胞3 d后，以TRIzol一步法提取细胞总RNA，所获RNA加入DNaseⅠ消化处理可能污染的DNA后，PCR产物行琼脂糖电泳检测白细胞介素10 mRNA的表达。 结果：①重组腺病毒的包装及滴度测定：经限制性内切酶转染293细胞16 h后，荧光显微镜观察到细胞中有GFP荧光，可间接反映目的基因的表达。将病毒上清反复感染293细胞扩增重组腺病毒，通常传至第4~5代于接种病毒后24~48 h，几乎可观察到所有细胞出现荧光，此时收获病毒，重组病毒命名为vAd-IL-10。vAd-IL-10滴度为5.5×108 pfu/mL，vAd-GFP滴度为9.0×108 pfu/mL。②目的基因RT-PCR产物的鉴定：提取重组腺病毒感染293细胞总RNA，RT-PCR扩增后琼脂糖电泳显示特异性580 bp预计大小的片段，表明该重组腺病毒可在293细胞中有效转录。 结论：利用AdEasy腺病毒载体系统成功构建了携带白细胞介素10基因的重组腺病毒载体，并制备出高滴度的重组腺病毒vAd-IL-10，可在293细胞中有效转录。     

靶向人端粒酶逆转录酶小片段干涉RNA表达载体的构建和表达

目的构建靶向人端粒酶逆转录酶（hTERT）的小片段RNA（siRNA）表达载体，为研究RNA干涉（RNAi）在哺乳动物细胞内抑制靶基因表达奠定基础。方法根据siRNA靶点设计的原则运用相关软件设计靶序列并合成其表达框，连接人质粒载体pRNAT-H1．1／Neo，转染293T细胞，荧光定量RT．PCR和Western blot法检测转染后293T细胞中hTERT表达。结果重组质粒经测序鉴定证明hTERTsiRNA转录模板完整、正确插入到pRNAT．H1．1／Neo质粒中，并筛选出一个抑制hTERT表达效率最高的序列，其hTERT表达仅达22．90％。结论利用基因重组和荧光定量PCR等技术能成功构建并筛选出一个抑制效率最好的靶向hTERT的siRNA表达载体，为以hTERT为靶点的肿瘤基因治疗的后续研究奠定基础。     

重组腺病毒载体pAdeasy-1/pAdtrack-CMV-GFP-β-NGF的构建和鉴定

目的构建携带绿色荧光蛋白(GFP)标记的小鼠β-NGF重组腺病毒载体。 方法利用RT-PCR法从小鼠颌下腺总mRNA中扩增β-NGF全长cDNA片断,定向克隆于腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV(已标记绿色荧光蛋白)中;在细菌中与缺陷型腺病毒基因组pAdeasy-1进行同源重组,构建Adeasy- 1/pAdtrack-CMV-GFP-β-NGF载体,并进行酶切鉴定。 结果成功获得小鼠-NGF全长扩增片段;pAdTrack-CMV-β-NGF测序验证含有目的基因;双酶切鉴定成功构建重组pAdTrack-CMV-β-NGF质粒;限制性内切酶的酶切分析结果证明成功构建同源重组的Adeasy-1/pAdtrack-CMV-GFP-β-NGF载体。 结论本实验所用方法可高效、安全构建腺病毒载体pAdeasy- 1/pAdtrack-CMV-GFP-β-NGF。     

人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达*★

目的：拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体，观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。 方法：通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因，PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因，分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上，构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和 pTrack-CMV-VEGF165，经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌，获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165，经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞，收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165。 结果：PCR﹑双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒，PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变；荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达，且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强；经多轮感染、扩增后，病毒效价可达（2.0~5.0）×1010 pfu/mL。转染48 h后，293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高（F=427.93，17.93，P < 0.05）。 结论：成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒，血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达。