GBV-C和HCV共同感染的研究

目的：了解GBV-C和HCV的共同感染率,及不同引物和自制DIG标记探针检测GBV-C的效果。方法：定量RT-PCR检测肝炎患者血清标本中的HCV,RT-nested PCR检测HCV RNA阳性标本中的GBV-C,分析部分标本扩增产物的棱苷酸和氨基酸序列,Southern杂交鉴定GBV-C扩增产物的特异性．结果：211例丙型肝炎病人血清标本中,GBV-C 5’-NCR和GBV-CNS3区检出率分别为31．8%和22．8%,总阳性率为35．1％．部分标本扩增产物的核苷酸序列分析证实,RT-nested PCR获得的检测结果可靠,但序列中存在较高频率的随机突变．自制的GBV-C 5‘-NCR和NS3 DIG标记探针有较高的特异性,可用于检测相应的扩增产物。结论：GBV-C 5‘-NCR引物的检测效果优于GBV-C NS3,GBV-C与HCV有较高的共同感染率。     

多重PCR检测HBV和HCV方法的建立

目的:建立可同时检测血清HBVDNA和HCVRNA的多重PCR。方法:利用已知的基因序列设计了对于不同亚型HBV保守的C基因区的一对引物HBV-P623及对于不同亚型HCV高度保守的位于5’端非编码区(5’-NCR)的两对引物HCV-P289和HCV-P174,扩增经基因释放剂(Genereleaser)处理的HBV和HCV阳性血清。结果:多重引物、逆转录套式PCR反应体系可同时扩增HBV DNA和HCV RNA,分别在623bp和174bp处出现特异DNA扩增带。该反应体系具有较高的特异和敏感性,受检血清中仅含有10fgHBV DNA和5CID HCV RNA即可检出。血清标本不需要提取核酸,可直接进行PCR。用此体系检测30例输血后病人血清,其中15例为HBV感染,8例为HCV感染,7例为阴性。结论:多重PCR检测HBV及HCV的方法具有简便性和实用性。     

丙型肝炎患者血清和外周血单个核细胞HCV-RNA检测

目的 :了解丙型肝炎患者血清和外周血单个核细胞 (PBMC)中HCV RNA存在情况及其意义。方法 :采用套式PCR检测 38例急性丙型肝炎和 36例慢性丙型肝炎患者血清和外周血PBMC中HCV RNA。结果 :74例丙型肝炎患者血清HCV RNA阳性 6 8例 ,PBMC阳性 44例 ;急性丙型肝炎患者PBMC中HCV RNA阳性 15例 (39.5 % ) ,慢性丙型肝炎患者PBMC中阳性 2 9例 (80 .6 % )。慢性丙型肝炎患者PBMC中HCV RNA检出率显著高于急性丙型肝炎患者 (P <0 .0 1)。 3例血清HCV RNA阴性 ,而PBMC中HCV RNA均阳性 ;8例患者血清抗 HCV阴性 ,而血清HCV RNA均阳性。结论 :PBMC可能为HCV肝外贮存和复制场所 ,PBMC中的HCV感染在丙型肝炎慢性化和慢性肝损害中可能起一定作用 ;血清HCV RNA检测有助于抗 HCV阴性丙型肝炎的诊断。     

丙型肝炎病毒母婴传播研究

目的：探讨HCV母婴传播的可能性及其在流行病学中的意义。方法：应用ELISA方法对2136名产前检查的孕妇进行了抗－HCV检测,抗－HCV阳性者进一步应用PCR检测其HCV－RNA并收集其婴儿脐血进行抗－HCV和HCV－RNA检测。结果：孕妇的抗－HCV阳性率为1.59%(34/2136),抗－HCV阳性母亲的HCV－RNA阳性率为47.06%(16/34),母亲HCV－RNA阳性者发生垂直传播率为53.3%。结论 ：应用抗－HCV评价母婴传播并不合和达,只有通过检测HCV－RNA方能证实感染的存在。HCV确实存在母婴传播,但在人群HCV流行中并非主要传播途径。母新肝功能异常是影响HCV母婴传播的一个重要因素。     

聚合酶链反应检测血清及肝脏中丙型肝炎病毒核糖核酸的研究

本文报道了简便快速检测血清及肝脏中丙型肝炎病毒核糖核酸(HCV RNA)的聚合酶链反应(PCR)方法。检测单浆献血员61例,其中抗-HCV阳性30例,检出血清HCV RNA阳性者17例;抗-HCV阴性31例,检出血清HCV RNA阳性者9例。检测6例血清HCV RNA阴性、抗-HCV阳性丙型肝炎患者的肝穿标本,发现4例HCV RNA阳性。说明本文所建立的PCR方法是诊断HCV感染的特异性强、敏感度高的一种新方法。检测肝组织内的HCV RNA可提高HCV RNA的检出率。本文还对标本的处理及如何避免假阳性等问题进行了讨论。     

Study of hepatitis C virus genotype in Guizhou area of southwestern China

OBJECTIVE: To determine the concordance in various hepatitis C (HCV) genotyping methods and to investigate the distribution of HCV genotypes in Guizhou area of Southwest China. METHODS: Serum samples from 206 patients (100 with chronic hepatitis and 106 with hemopathy) were detected for antibody of HCV by second generation enzyme-labelled immunosorbent assay (ELISA). Thirty-five anti-HCV positive samples were detected for HCV RNA by RT-polymerase chain reaction (PCR) and 30 HCV RNA positive samples were determined for their genotypes by three various genotyping methods [PCR with type-specific primers at the core region (primer-set), slot-blot hybridization with type-specific probes at NS5B region (blotting) and the restric fragment length polymorphism analysis of PCR products of 5' NC region (RFLP)]. Ten samples with the known genotype were analysed by the direct sequencing. RESULTS: Of 30 samples with positive HCV RNA, the types of 22 could be classified by three methods, and the genotypes determined by various methods had complete concordance. The types of 6 samples could be classified by two methods and 5 had agreement subtypes. The types of two samples could be classified only by RFLP. Overall, 27 (90.0%) had subtype 1b infection and 3 (10.0%) had subtype 2a infection. The nucleotide sequence of 8 samples with subtype 1b and one with subtype 2a were analysed by the direct sequencing. The subtypes determined by sequence analysis were in complete concordance with those decided by various genotyping methods. CONCLUSIONS: Subtype 1b is the predominent HCV genotype in Guizhou area, while subtype 2a is less common. There was a good concordance with the genotyping results obtained by various HCV genotyping methods.     

丙肝诊断的竞争定量PCR法的实验研究及应用

迫于丙型肝炎病毒（HCV）的基础研究与实际应用中定量病毒基因的需要，本文利用体外构建的野生型与突变型模板，建立HCVRNA的竞争性聚合酶链反应（PCR）定量检测，进行了敏感性、特异性一重复性实验，并试用于检测血清标本。结果表明，野生型与突变型模板的灵敏度达到RNA为100fg，DNA为10fg；同一条件下，野生型与突变型模板进行竞争反应存在良好的稳定的比例关系，通过已知量的参照模板可较准确地推算出血清标本中的原始浓度。因此，此野生型模板可作为HCVRNA的逆转录及PCR定性诊断中的金标准；而突变型模板则作为内参照用于HCVRNA的竞争性逆转录PCR定量。丙肝诊断从定性走向定量，在实际工作中具有重大意义。     

丙型肝炎病毒感染外周血单个核细胞对丙型肝炎的影响

为了研究丙型肝炎病毒(HCV)感染外周血单个核细胞(PBMC)对丙型肝炎的影响,运用非同位素原位杂交法(NISH)和链酶亲和素-生物素(SABC)法分别检测20例慢性丙型肝炎患者PBMC中的HCV-RNA及其T淋巴细胞亚群,同时检测这些患者的肝功能指标。结果显示8例(40．0％)HCV患者的PBMC中的HCV-RNA呈阳性结果。HCV-RNA呈散在颗粒状或弥漫分布,主要位于胞浆中。HCV-RNA阳性组和阴性组的CD+4T细胞比例低于正常对照组,CD+8T细胞比例高于正常对照组,CD+4／CD+8比值下降;而HCV-RNA阳性组的CD+4T细胞比例则又低于阴性组,CD+8T细胞比例高于阴性组,CD+4／CD+8比值出现倒置(P<0．01)。两组的肝功能检查结果之间无显著差异(P>0．05)。提示HCV感染PBMC后引起T淋巴细胞亚群发生变化,使CD+4和CD+8T细胞功能下降或不能很好地协调作用,从而成为HCV持续感染的重要原因之一。HCV感染PBMC对肝脏炎症程度的影响可能不大。     

树Qu对丙型肝炎病毒的易感性研究

目的：探讨树Ｑｕ对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的易感性。方法：对来自云南的树Ｑｕ接种含ＨＣＶ的病人血清,然后用ＰＣＲ方法检测树Ｑｕ血清的ＨＶＣ ＲＮＡ,用反向被动血凝法测定抗－ＨＣＶ抗体,用原位ＰＣＲ方法检测树Ｑｕ肝细胞内的ＨＶＣ ＲＮＡ。结果：３４．８％的树Ｑｕ（８／２３）在接种ＨＣＶ后,血清中检出ＨＣＶ ＲＮＡ,对４例抗ＨＣＶ阳性和谷丙转氨酶升高的树Ｑｕ的肝组织进行原位ＰＣＲ检测,结果在１例肝细胞中     

丙型肝炎患者外周血单个核细胞内HCV RNA的定量测定

目的：明确丙型肝炎患者外周血单个核细胞内是否可检测到HCV RNA,以及外周血清与PBMCs中HCV RNA载量的相关性。方法：通过SYBR Green Realtime PCR对丙型肝炎患者外周血单个核细胞内及血清中HCV RNA进行定量检测。结果：40例抗HCV阳性的患者中35例血清HCVRNA阳性,5例血清HCVRNA阴性,35例血清HCVRNA阳性的患者中30例PBMCs中可测定到HCVRNA,而5例血清HCVRNA阴性的患者中2例PBMCs中检测到HCVRNA。统计分析示患者外周血清与PBMCs中HCVRNA载量无相关性（P〉0.05）。结论：HCV患者PBMCs中可测定到HCV RNA,外周血清与PB-MCs中HCV RNA载量无相关性。     

丙型肝炎病毒核心抗原检测在临床诊断HCV感染的价值

目的:评估丙型肝炎病毒核心抗原(HCVcAg)诊断试剂在临床运用对HCV感染的诊断价值?方法:对临床214例确认HCV感染者?60例健康体检者?40例非HCV感染的其他肝炎患者同时检测HCVcAg?抗HCV和HCV RNA,并对78例HIV感染者进行HCV感染筛查,分析 HCVcAg试剂的敏感性?特异性?结果:214 例确认丙肝患者HCVcAg检测162例(75.7%)阳性,且HCV RNA水平越高,HCVcAg检出率也越高?当HCV RNA载量>106/ml时,HCVcAg与HCV RNA检测的符合率达98.7%;60例健康对照和40例非HCV感染的各种肝炎HCVcAg检测均为阴性,显示了HCVcAg对诊断HCV感染得高度特异性?对78份HIV感染者样本进行HCV RNA测定,有16例阳性,以HCVcAg法测定有15例阳性,以抗HCV法测定仅有9例阳性?结论:HCVcAg可作为HCV感染诊断的血清病毒标志物,也可用于使用免疫抑制剂,抗HCV产生受到抑制的患者,以及在一些不具备开展PCR的医院实验室作为HCV RNA检测的替代试验?     

用高度保守区引物和套式PCR扩增丙型肝炎病毒

采用套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法，以具有高度保守性的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ５＇端非编码区引物对，扩增１０例输血后肝炎血清，８例（８０％）阳性。并将逆转录与第一轮ＰＣＲ结合连续进行，使操作简便有效。间接证明了ＨＣＶ上海株与世界若干地区ＨＣＶ株５＇端非编码区核酸序列具有高度同源性和保守性。     

应用间接原位PCR诊断弓形虫淋巴结炎

目的:探讨间接原位PCR技术在弓形虫淋巴结炎病理诊断中的应用.方法:设计弓形虫B1基因1对引物进行原位扩增,选择弓形虫B1基因来源的地高辛标记探针进行扩增后原位杂交,应用间接原位PCR技术,检测三所医院共86例病理诊断为慢性非特异性淋巴结炎石蜡包埋切片组织中的弓形虫.结果:86例中47例弓形虫阳性,占54.65%.三所医院弓形虫阳性率经统计学处理无显著性差异(P>0.05).结论:在病理诊断为慢性非特异性淋巴结炎病例中,存在被误诊的弓形虫淋巴结炎病例.     

原发性肝细胞癌组织中丙型肝炎病毒的检出及其相关意义的研究

目的 探讨丙型肝炎病毒（HCV）感染导致肝细胞癌变的可能机理。方法 应用抗－HCVNS3单克隆抗体和地高辛标记的HCV全基因组cDNA探针,对19例伴单一HCV感染的肝细胞癌石蜡组织切片进行了HCAg的免疫组化和原位杂交检测。结果 两种方法的阳性检出率分别为89．5％（17／19）和57．9％（11／19）。HCAg主要分布于癌细胞和癌旁肝细胞的胞浆和胞核内,呈局灶或弥漫型分布,癌旁组织表达较癌巢显著,核型分布在癌旁组织中常见;HCV RNA仅见于癌或癌旁肝细胞的胞浆中,呈散在及局灶分布,弥漫型分布少见。结论 本研究结果支持HCV感染可能导致原发性肝细胞癌的观点。HCAg在癌旁肝细胞和癌细胞核中的存在提示其可能对肝细胞核产生基因调节作用,这是否是HCV感染导致肝细胞癌变的可能机理之一,值得进一步研究阐明。     

人肝癌细胞系7721与原代人胎肝细胞用于体外培养HCV的对比研究

目的 研究丙型肝炎病毒（HCV）在体外培养原代人胎肝细胞和人肝癌细胞系7721中复制和表达的异同,探讨HCV体外培养条件。方法 原代人胎肝细胞系7721分别与HCV感染血清共孵育后,用逆转录-聚合酶链反应、原位杂交、免疫组化检测细胞和培养上清中的HCV RNA和抗原表达。结果 从孵育的2～3天,即可在细胞内和/或培养上清中间断地检出HCV RNA（其中HCV在7721细胞株中的复制至少可达66d,HCV在 人胎肝细胞中的复制持续25d）;HCV抗原可在感染细胞内得到稳定表达,感染细胞内存在HCV负链RNA杂交信号,且多位于细胞浆。结论 两种肝细胞对HCV易感,尤其是7721细胞可以稳定地支持HCV体外复制,可用于HCV体外长期培养的靶细胞。     

Detection of Replicative Form of HCV RNA in Peripheral Blood Leukocytes and Its Clinical Significance

ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＲｅｐｌｉｃａｔｉｖｅＦｏｒｍｏｆＨＣＶＲＮＡｉｎＰｅｒｉｐｈｅｒａｌＢｌｏｏｄＬｅｕｋｏｃｙｔｅｓａｎｄＩｔｓＣｌｉｎｉｃａｌＳｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅＨＥＹｏｎｇ－ｗｅｎ（贺永文）；ＦｅｒｅｎｃｉｋＳ；ＬＵＯＤｕａｎ－ｄｅ（罗...     

实时荧光PCR检测丙型肝炎病毒核酸及其临床意义

目的：探讨实时荧光PCR检测技术在丙型肝炎病原诊断及在监测干扰素-α治疗慢性丙型肝炎早期病毒学应答反应(EVR)中的临床意义。方法：采用一种新的丙型肝炎病毒核酸(HCV—RNA)扩增(PCR)定量检测方法——实时荧光PCR检测HCV—RNA，对96例慢性丙肝(其中20例随机接受Pegasys或Referun-α治疗，每例思者分别采集治疗前后系列血清7份)、30例其它肝病、15例非肝病和86例健康献血员的血清标本进行HCV—RNA检测，部分血清标本与Amplicor(Roche)进行核对。结果：96例慢性丙肝患者血清HCV—RNA检出率85.4％(82／96)、其它肝病、非肝病和健康献血员中均未检出HCV—RNA；部分标本经与Amplicor核对呈较好相关性，r(log)＝0．91。随机接受Pegasys或Referon-α治疗的20例丙肝患者治疗前后EVR显示，前者的EVR似较后者明显，但因病例数太少，无明显统计学差异(G＝4.467,P＞0.05)。结论：实时荧光PCR检出的HCV—RNA载量可较客观地反映丙肝患者体内病毒复制水平，支持干扰素治疗慢性丙型肝炎EVR可用于预测长期疗效。     

丙型肝炎病毒母婴垂直传播的研究

目的了解丙型肝炎病毒(HCV)母婴垂直传播情况.方法采用酶联免疫法(ELISA)和聚合酶链反应(PCR)检测1047例肝病孕产妇血清丙型肝炎病毒抗体(抗～HCV)和丙型肝炎病毒基因(HCV～RNA),对HCV感染产妇血清进行HCV分型及半定量分析.再对HCV感染产妇的丈夫静脉血及新生儿脐血、出生后24小时内、1、6、12个月股静脉血进行抗-HCV、HCV-RNA和HCV分型的检测.结果1047例肝病孕产妇中有12例(1.15%)HCV感染,其丈夫血清抗-HCV、HCVRNA均为阴性,而12名新生儿中有3例脐血及出生后24小时内外周血均抗-HCV阳性,其中2例HCV-RNA同时阳性,仅1例婴儿在出生后1、6、12个月时检测抗-HCV与HCV-RNA均阳性,且与其母所感染的HCV基因型相同,其余2例婴儿出生后1个月均阴转.本组HCV母婴传播率为8.3%.结论支持我国存在HCV母婴垂直传播.     

HCV核心抗原检测技术的临床应用

目的:探讨丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法的临床应用价值。方法:采用丙型肝炎病毒核心抗原ELISA试剂盒对临床丙肝感染者血清进行检测,同时用HCV抗体ELISA检测试剂盒和HCV RNA基因扩增试验作为对照进行比较。结果:以HCV RNA PCR检测为对照,HCV抗原检测试剂盒的灵敏度为95.65%,特异性为100%,23例HCV RNA PCR检测阳性血清,用HCV抗体检测法进行检测,其中有3例阴性,将这3例阴性标本用HCV核心抗原检测法进行检测,其中2例为阳性。结论:丙型肝炎核心抗原ELISA检测方法能缩短窗口期,敏感性高,特异性好,费用低廉,在临床上具有很好的推广前景。     

多重实时荧光定量PCR检测急性肝炎患者HBV和HCV方法的建立与意义分析

目的建立一种新的可以快速筛查急性肝炎患者HBV和HCV感染的多重实时荧光定量PCR方法。方法收集596例急性肝炎患者血清或血浆样本,应用自主构建的多重实时荧光定量PCR方法同时检测HBV和HCV,同时应用HBV和HCV单管检测试剂进行检测分析。结果新建立的多重实时荧光定量PCR体系,可以有效地检测HBV和HCV的阳性质控品及阳性样本。多重实时荧光定量PCR体系特异性较好,检测HBV和HCV时,两者之间无交叉反应,且以多种血浆病毒的核酸样品为模板进行检测时结果全为阴性;多重实时荧光定量PCR体系检测HBV、HCV的灵敏度分别为20 IU/ml、50 IU/ml;多重实时荧光定量PCR体系精密度好,检测HBV、HCV的CV值分别为0.11%、0.096%。在检测临床样本时,多重复合体系检测血清或血浆中HBV和HCV的检出率与单独检测HBV和HCV具有很好的一致性,且HBV和HCV的一致率分别达到97.7%(k=0.952)、98.8%(k=0.976);同时有6例样本出现HBV和HCV共感染。结论新型多重实时荧光定量PCR方法对快速检测及筛查HBV和HCV较快捷,而且特异性好、灵敏度高、精密度好。因此多重实时荧光定量PCR方法对2种肝炎病毒的检测具有重要意义。