黑龙江立克次体的分子生物学鉴定

为对我国东北地区分离的斑点热群立克次体分离株作鉴定，建立并应用了分子立克次体学方法，包括单克隆抗体、SDS－PAGE、免疫印迹、DNA酶切图谱、PCR／RFLP、PCR／SSCP及DNA序列分析等。结果表明：①在种的水平上研究了黑龙江分离株（代表株HLJ－54、36），从分类学上确定其属立克次体属、斑点热群的一个新种，命名为黑龙江立克次体（R.heilongjiangii)；②发现从疑似病人血液分离的H－5株的分子生物学特征与黑龙江立克次体一致，证实了其对人的致病性。     

黑龙江立克次体及斑点热调查研究的现状和展望

斑点热立克次体病是由斑点热群立克次体（spotted fever group rickettsiae，SFGR）引起的蜱、螨传播疾病。该病广泛分布于世界各地。我国自1962年从黑龙江省虎饶地区东方田鼠分离到第1株斑点热群西伯利亚立克次体以来，广泛开展了流行病学调查和病原学的研究工作，证明由西伯利亚立克次体引起的北亚蜱传斑点热病（北亚热）在我国分布较广，发现了北亚热感染的病人，从病人、蜱、蜱卵以及啮齿动物体内共分离出20余株该立克次体。     

斑点热群新种——黑龙江立克次体

斑点热群黑龙江立克次体(R.heilongjiangii,R.hei)是引起黑龙江蜱传斑点热的病原体。1982年在黑龙江省发现R.hei,1996年从病人血液分离到R.hei,从而证实了对人的致病性。2003年俄罗斯亦发现R.hei感染的急性蜱传斑点热患者。经过近20年国内外学者的共同努力,R.hei已被正式确定为斑点热群立克次体(spotted fever groupRickettsiae,SFGR)新种。本文就该新种立克次体及所引起的黑龙江蜱传斑点热的有关情况介绍如下。1斑点热群立克次体分类SFGR是立克次体属中一群立克次体,与斑疹伤寒群、恙虫病群立克次体并列。SGFR种类繁多,据Bergey细…     

PCR／RFLP用于黑龙江立克次体的鉴定

为探讨应用聚合酶链反应／限制性片段长度多态性图谱分析(PCR／RFLP)用于立克次体鉴定的高效性和特异性，将PCR／RFLP用于2株黑龙江立克次体的鉴定，并与以往其它鉴定黑龙江立克次体的分析结果作比较。结果表明，结论一致，均可鉴定出黑龙江立克次体为斑点热群立克次体的一新种。结论：PCR／RFLP以其简便、可信，采用菌体少等优点．适合在实验室进行立克次体研究时广泛应用。     

斑点热群黑龙江立克次体分离株的限制性片段分析

为探讨和比较黑龙江克次体与相关斑点热群９ＳＦＧ）立克次体不同种间在基因组上的差异，应用限制性核酸内切酶对黑龙江立克次体５４株和３６株、国内参考株精河株与呼盟株及国际参考株西伯利亚２４６株、康氏Ｓｉｍｋｏ株、小蛛Ｋａｐｌａｎ株等ＳＦＧ立克次体的ＤＮＡ进行限制性片段分析。结果发现，黑龙江立克次体的限制性自理图谱与ＳＦＧ立克次体的国内参考株及国际标准株均不相同，表明其基因组存在差异，而精河株和呼盟株与西     

斑点热黑龙江立克次体蜱株与人分离株的血清型和基因型研究

为比较斑点热黑龙江立克次体054株与从病人血液分离的H-5株,采用微量免疫荧光方法和聚合酶链反应/限制性片段长度多态性分析技术。结果表明,二者间的血清反应模式一致,表明有相同的抗原结构。同时,用立克次体190kD抗原基因设计的一对引物扩增两株立克次体DNA后,用Pst I消化经PAGE,其电泳图谱的酶切带的数量和迁移完全一致,说明基因组相同。结论:从抗原性和基因型两方面证实斑点热054株与H-5株二者一致。     

结核分枝杆菌异烟肼耐药基因katG点突变的快速检测

目的：探讨快速检测结核分枝杆菌异烟肼（INH）耐药基因型的分子药敏方法。方法：用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）检测了30株INH敏感菌株及30株耐药株的katG基因，随后用SSCP方法鉴定扩增产物有无突变，以结核分枝杆菌H37Rv作对照。结果：所有INH敏感株均观察到katG基因扩增产物，30株INH耐药株中28株观察到katG基因扩增产物。以H37Rv标准株为对照，30株敏感株SSCP带谱与对照相同；28株INH耐药株中13株与对照相同，15株有不同程度的差异。与药敏试验比较，PCR－SSCP检测INH耐药结核菌的敏感性为57%，特异性为100％。结论：多数结核分枝杆菌耐INH是由于katG基因突变所致，用PCR－SSCP筛选突变株可达到快速检测结核分枝杆菌INH耐药基因型的目的。     

结核分支杆菌耐喹诺酮分子机制的研究

目的了解结核分支杆菌耐喹诺酮药物的分子机制，建立快速的药敏的方法。方法通过16S rRNA聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR—SSCP)技术分析77株分支杆菌临床分离株；通过PCR—SSCP和直接测序技术(PCR—DS)分析结核分支杆菌的gyrA基因突变的情况。结果75株为结核分支杆菌复合群。以结核分支杆菌标准菌株H37Rv和卡介苗为对照．30株喹诺酮敏感株的gyrA基因的SSCP图谱均泳动正常，测序分析与对照株相同。45株耐喹诺酮的菌株中，34株(75．6％)gyrA基因SSCP图谱泳动异常；测序证实10株为90位密码子的突变，24株为94位密码子突变，所有gyrA突变株的氧氟沙星4μg／ml≤MICs≤32vg／ml，左氧氟沙星2μg／ml≤MICs≤16vg／ml。结论gyrA基因突变，尤其90位和94位密码子突变是结核分支杆菌耐喹诺酮的主要分子机制，PCR—SSCP可能成为测定部分结核分支杆菌喹诺酮耐药基因型的简便、快速的方法，并有望直接用于临床标本喹诺酮敏感性试验。     

PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG,ahpC基因突变的研究

目的：应用PCR－SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG及ahpC基因突变,评价此方法用于结核分杆菌利福平（RFP）及异烟肼（INH）耐药性试验的意义。方法：以结核分支杆菌H37Rv为对照,30例耐RFP（单耐或多耐）、21例耐INH（单耐和多耐）的结核分枝杆菌临床分离株及10例敏感菌株;39例菌阳肺结核患者及30例非结核 性肺部疾病患者痰标本,采用PCR－SS－CP技术检测痰标本和菌株中的结核杆菌rpoB,katG,ahpC基因突变,并与药敏试验对照。结果：PCR－SSCP检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG及ahpC基因突变的阳性率分别为79％（31／39）、46％（18／39）及5％（2／39）.结论：PCR－SSCP可望成为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平及耐异烟肼的快速方法。     

结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分子机制的研究

目的　了解结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分子机制 ,建立快速分子药敏试验方法。方法　通过聚合酶链反应 (PCR) -单链构象多态性 (SSCP)、PCR-限制性片段长度多态性 (RFL P)和 PCR-直接测序 (DS)技术分析 10 7株结核分枝杆菌临床分离株 emb B基因。结果　以 H3 7Rv标准株为对照 ,10 7株结核分枝杆菌临床分离株的 16 S r DNA SSCP电泳图谱均与结核分枝杆菌标准相同。 38株药物敏感株的 emb B基因、SSCP均泳动正常 ,RFL P和 DS分析与对照株相同。 6 9株耐乙胺丁醇 (EMB)分离株中 ,2 5株 (36 .2 % ) emb B基因 SSCP泳动异常 ;8株 RFL P分析异常 ;DS分析 2 5株均为 30 6位密码子突变 ,其中 1株合并有 2 74位 CGC→ CCC突变 ,其 EMB MICs均≥ 2 0 μg/ml;8株为 30 6位 ATG→ATA或 ATT突变 ,17株为 ATG→GTG或 CTG突变 ,后者 EMB MICs均≥ 30μg/ml。结论　部分结核分枝杆菌耐乙胺丁醇是由于其 emb B基因 (尤其是 30 6位密码子 )突变所致 ,PCR- SSCP技术可能成为测定部分结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药基因型的简便、快速的方法     

恙虫病东方体黑龙江分离株基因型的PCR／SSCP分析

为鉴定恙虫病东方体(0t)黑龙江分离株型别，采用聚合酶链反应／单链构象多态性分析(PCR／SSCP)技术对分离自黑龙江省密山地区的6株恙虫病东方体目的基因进行分析研究。结果表明，6株分离株呈现出3种不同的单链构象图谱。结论黑龙江密山地区恙虫病东方体分离株存在Gilliam、Karp和Kato3种型别。     

超广谱β-内酰胺酶CTX-M-3和SHV-12在临床分离阴沟肠杆菌中的流行

目的：了解临床分离的阴沟肠杆菌中产ESBLs菌株的发生率，流行特征以及ESBLs的表型和基因型。方法：1999年2月至2001年3月期间解放军总医院临床临床分离到106株阴沟肠杆菌，研究对象为其中对第三代头孢菌素或氨曲南敏感性减低的42株阴沟肠杆菌，通过等电聚焦电泳和接合试验分析ESBLs的表型特征；PCR扩增TEM型、SHV型和CTX－M型β－内酰胺酶的编码基因并对其进行DNA测序，以确定ESBLs的基因型，有杉ERIC－PCR分型方法分析我院产ESBLs阴沟肠杆菌的流行特征。结果：在42株对第三代头孢菌素或氨曲南敏感性降低的阴沟肠杆菌中，有25株产生ESBLs，占我院同期临床分离的全部阴沟肠杆菌的23．6％（25／106）。其中18株产CTX－M－3，7株产SHV－12，分别占同期我院临床分离的全部阴沟肠杆菌的17．0％（18／106）和6．6％（7／106），这是国内首次报道CTX－M－3和SHV－12在阴沟肠杆菌中广泛流行，产CTX－M－3或SVH－12的阴沟肠杆菌均呈多克隆构成模式，仅个别病区内发生过产CTX－M－3阴沟肠杆菌引起的小型克隆传播。结论：在临床分离的阴沟肠杆菌中，由ESBLs介导的耐药已经成为严重总是。ESBLs的基因型主要为CTX－M－3，而SHV－12也不少见。CTX－M－3和SHV－12在我院的流行主要由其编码基因在不同克隆株之间水平传播引起，克隆传播居次要地位。     

临床分离铜绿假单胞菌喹诺酮耐药株gyrA基因突变及其对β-内酰胺类药物敏感性研究

利用PCR、限制性片段多态性分析（RFLP）、DNA单链构像多态性分析（SSCP）和DNA测序等方法，对10株成都地区临床分离耐喹诺酮类药物铜绿假单孢菌gyrA基因进行研究。结果表明，成都地区耐喹诺酮类药物铜绿假单胞菌gyrA的喹诺酮耐药决定区编码等83位氨基酸密码子表现出高频单点突变（10株中有8株），其突变方式为ACC→ATC。gyrA的PCR扩增产物SacII酶切片段与测序结果一致。SSCP的带谱与测序结果比较，除1株（PSA2）的SSCP带谱与标准株相同，但测序结果有点突变外，其余菌株与测序结果一致。因此，利用PCR－SSCP－RFLP系统，可快速、准确的检测耐喹诺酮类药物的铜绿假单胞菌gyrA中至少一个碱基的差异。用二倍稀释法测定喹诺酮和β－内酰胺类药物对耐药突变株体外抗菌活性，结果表明，铜绿假单胞菌gyrA基因突变株对诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢他啶、亚胺培南和哌拉西林表现出不同的敏感性。试验所用8株突变株对诺氟沙星和环丙沙星表现出高水平抗性；3株对左氧氟沙星敏感；3株对头孢他啶和哌拉西林表现出耐药，2株对亚胺培南耐药。     

单管半套式PCR-SSCP用于结核分支杆菌rpoB基因突变的研究

目的 ①证明单管半套式聚合酶链反应(PCR)是检测结核分支杆菌的特异性方法;②研究结核分支杆菌rpoB基因突变与利福平耐药性的关系。方法 设计三条针对结核分支杆菌的特异性引物,采用单管半套式PCR-单链构象多态性(SSCP)方法对结核分支杆菌、其它分支杆菌和富含GC碱基的细菌进行分析。结果 ①结核分支杆菌标准菌株H_(37)Rv和55株临床分离株均扩增出一条193bp片段,其特异性为100％,敏感性约为10pgDNA;15株非结核分支杆菌和8株富含GC的细菌均未得到扩增;②55株结核分支杆菌临床分离株193bp扩增片段SSCP图谱特点:以H_(37)Rv为对照,15株利福平敏感株均无区别;40株耐药株除6株外其余34株SSCP图谱有明显区别,检测阳性率为85％。结论 单管半套式PCR检测结核分支杆菌简便、敏感、特异,结合SSCP可检出耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变,此突变与利福平耐药关系密切。     

铜绿假单胞菌临床分离株gyrA基因突变与喹诺酮类药物耐药关系研究

目的:研究铜绿假单胞菌临床分离株gyrA基因突变与喹诺酮类药物耐药关系,并对聚合酶联反应(PCR)-限制性片段长度多态性(RFLP)-DNA单链构象多态性(SSCP)分析铜绿假单胞菌临床分离株gyrA基因突变的可行性进行评估。方法:以铜绿假单胞菌临床分离株gyrA基因序列为靶序列,用PCR、PCR-RFLP、PCR-SSCP、DNA测序等方法对铜绿假单胞菌ATCC27853及16株临床分离株gyrA基因突变进行对比研究。结果:在8株耐环丙沙星铜绿假单胞菌中,有6株gyrA基因的83位表现出单点突变,其突变方式全为ACC→ATC,导致氨基酸苏氨酸→异亮氨酸的改变;gyrA基因的PCR扩增产物SacⅡ酶切片段与测序结果一致;SSCP分析结果显示,16株细菌中仅2株gyrA带型与ATCC27853相同,其它菌株gyrA带型与ATCC27853均不同。结论:临床分离的铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物耐药的分子机制主要表现为gyrA基因83位氨基酸密码子突变,应用PCR-RFLP-SSCP系统可快速、准确地检测耐喹诺酮类药物的铜绿假单胞菌gyrA中碱基的变异。     

用分子生物学技术快速检测耐多药结核分枝杆菌

目的：用PCR—SSCP技术检测耐INH、RFP、SM结核分枝杆菌分离株KatG、rpoB、rpsL基因突变，评价其在快速检测结核分枝杆菌耐药性方面的临床价值。方法：以结核分枝杆菌H；vRv为对照，20株耐多药菌株和20株敏感株，分别用PCR—SSCP方法检测KatG、rpoB、rpsL基因突变，并将SSCP结果与药敏试验结果作对照分析。结果：PCR—SSCP方法检测20株敏感株SSCP带语均与H37RV标准株相同，而20株耐多药结核分枝杆菌KatG、rpoB、rpsL基因突变的阳性率分别为70％，100％和75％。发现20株耐多药菌株中有11株(55％)共INH、RFP、SM3种耐药遗传标志均发生突变，7株(35％)有2种耐药遗传标志突变，2株(10％)只有RFP耐药标志突变。结论：PCR—SSCP方法敏感、特异，可快速检测结核分枝杆菌KatG、rpoB、rpsL耐药基因突变，有利于耐多药结核分枝杆菌耐药性的快速检测。     

肺炎克雷伯菌呼吸道分离株头孢菌素β-内酰胺酶检测

目的了解我院肺炎克雷伯菌（KP）呼吸道分离株头孢菌素β-内酰胺酶（AmpC）的携带情况、基因型特点及耐药状况。方法收集我院2005～2007年呼吸道分离的54株KP,以头孢西丁（FOX）耐药筛选耐药株;用碱裂解法提取耐药株质粒;采用PCR扩增AmpC基因,并对其产物进行测序以确定其基因型;对FOX耐药株进行超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）表型确证试验;用K-B法进行药物敏感试验。结果54株KP中29株FOX耐药;22株AmpC阳性,测序后均为DHA-1型;24株ESBLs表型确证试验阳性;AmpC阳性KP对碳氢霉烯类100%敏感,对其他抗生素均有不同程度耐药。结论KP呼吸道分离株AmpC酶检出率高,流行基因型为DHA-1,产AmpC酶菌株的ESBLs携带率高,耐药情况严重。     

碳青霉烯类抗菌药物敏感性下降肠杆菌科细菌耐药基因型研究

目的 研究碳青霉烯类抗菌药物敏感性下降肠杆菌科细菌的耐药情况及产碳青霉烯酶基因型。方法 对临床分离到非重复的36株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌,应用改良Hodge试验进行产碳青霉烯酶的表型确证,PCR扩增技术分析产碳青霉烯酶基因型。结果 药敏试验显示36株碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌具有对第3,4代头孢菌素、碳青霉烯类、氟喹诺酮类和酶抑制剂复合制剂等多重耐药。36株菌株中有16株改良Hodge试验阳性;PCR结果10株细菌携带bla_KPC,未检出bla_IMP、bla_VIM、bla_GIM、bla_SIM、bla_NDM-1基因条带。结论 产KPC酶是台州医院碳青霉烯类抗菌药物敏感性下降肠杆菌科细菌的主要耐药机制,其中KPC是主要基因型。     

结核病临床分离株及痰标本中embB基因型的快速测定

目的建立快速测定结核病耐乙胺丁醇(EMB)分离株和痰标本中结核分枝杆菌EMB耐药基因型的方法，以期为患者提供及时、有效地化验结果。方法应用16S rDNA聚合酶链反应(PCR)-单链构象多态性(SSCP)和PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)对11株耐EMB分离株和46例结核病痰标本进行分子菌种鉴定和embB基因突变的部位与性质分析。结果以结核分枝杆菌H37Rv标准株为对照，11株耐EMB分离株和46例临床痰标本经16S rDNA PCR-SSCP分析电泳图谱均与结核分枝杆菌标准株相同；限制性内切酶NlaⅢ消化embB基因扩增产物显示，11株耐EMB分离株中4株(36．4％)不被NlaⅡ消化；46例结核病痰标本中10例(21．7％)不被NlaⅡ消化。结论部分结核分枝杆菌耐EMB是由于embB基因突变所致。采用PCR-SSCP和PCR-RFLP方法可直接快速测定结核病耐EMB分离株和痰标本中结核分枝杆菌耐EMB基因型。     

结核分支杆菌rpoB基因突变与耐利福平的临床应用

目的：研究结核分支杆菌耐利福平（RFP）分离株rpoB基因突变情况并评价其应用价值。方法：采用聚合酶链反应一单链构象多态性（PCR—SSCP）方法对355株结核分支杆菌临床分离株（其中敏感株109株，耐RFP或含耐RFP株246株）rpoB基因进行检测，并对其中17株耐药株用双氧末端终止法进行测序分析。结果：以结核分支杆菌H37RV为对照，109株药物敏感株的rpoB基因均无突变，特异性100％；246株耐药株中，225株rpoB基因SSCP图谱异常，其敏感性91．5％。17株耐药株（其中SSCP异常11株，正常6株）PCR扩增产物经测序证实，11株在531位密码子TCG-TTG，4株在526位密码子CAC-TAC，1株在516位密码子GAC—GTC，1株未改变。结论：rpoB基因突变是耐RFP结核分支杆菌耐药性的主要分子机制；其最常见的突变位点是531位色氨酸和526位组氨酸，应用PCR—SSCP技术可快速检测结核分支杆菌对RFP的耐药性。