针对人STAT1基因的RNA干扰有效靶点的设计与筛选

目的:设计并筛选针对人STAT1基因有效的RNA干扰靶点。方法:根据人STAT1基因序列,设计3个干扰序列,将oligo退火成双链并连接穿梭载体pLKO-1-EGFP-puro-shRNA,构建shRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5a,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L的STAT1过表达瘤株(MHCC97L-stat1),用Real-timePCR检测干扰效果。结果:测序证实3个STAT1基因RNAi病毒载体质粒构建成功;慢病毒载体经293T细胞包装成功;3个慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L-stat1瘤株48h后,STAT1基因在mRNA水平表达均受到抑制,其中MHCC9-L-stat1-shRNA-1序列效果最佳,对STAT1基因表达的干扰效率可达81.4%。结论:成功构建并筛选了人STAT1基因RNAi慢病毒载体及有效靶点,为进一步深入研究STAT1基因与抗肿瘤药物药效关系奠定基础。     

人VEGF基因慢病毒介导RNA干扰有效靶点的设计及筛选

目的:设计并筛选人血管内皮生长因子(VEGF)有效RNA干扰片段,构建VEGF慢病毒表达载体。方法:对人VEGF基因编码区分析,筛选序列3条,阴性对照序列l条,通过连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测干扰效果。结果:测序证实3个VEGF基因RNAi慢病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度分别为3.23×109、3.30×109、3.73×109TU/mL。3个慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L后,VEGF基因在mRNA水平受到抑制,其中miR-200序列效果最佳,对VEGF基因表达的干扰效率可达72%。结论:成功构建并筛选了人VEGF基因RNAi慢病毒载体及有效靶点,为进一步深入研究VEGF基因与抗肿瘤药物药效关系提供实验基础。     

介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定

目的：构建介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif,为进一步包装慢病毒载体奠定基础.方法：以大鼠Ppif基因为靶基因,根据RNA干扰（RNAi）序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif中,构建4个含靶基因片段的重组慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif,并对质粒进行PCR及测序鉴定.结果：Ppif的短发夹RNA（shR-NA）片段被成功克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,4对插入序列与设计的靶基因片段完全一致.结论：构建了能够表达4个含Ppif靶基因片段的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装介导Ppif基因沉默的慢病毒载体奠定了基础.     

CCL20基因敲低型组织工程皮肤种子细胞的克隆筛选及其干扰效果

目的 采用重组慢病毒CCL20基因特异性shRNA载体感染人永生化角质形成细胞系(HaCaT),筛选出稳定干扰CCL20基因表达的细胞克隆并检测其干扰效果.方法 用CaCl2法将已构建好的3种pHSER-CCL20-shRNA-GFP载体(pHCG-1和pHCG-2为CC120基因特异性,pHCG-3为CCL20基因错配)转染293FT包装出慢病毒颗粒,流式细胞术测定其病毒滴度.用G418压力筛选慢病毒感染的HaCaT,荧光定量RT-PCR和ELISA法分别检测CC120基因mRNA和蛋白的表达水平,以判断其特异性干扰效果.结果 三种慢病毒载体所包装出的慢病毒滴度分别为7.08×105转导单位(TU)/ml、1.88×105TU/ml和2.08×105TU/ml;感染后的HaCaT经过G418筛选5～8周,获得4株CCL20基因特异性的细胞克隆(HaCaT-1、HaCaT-2、HaCaT-3和HaCaT-4)及2株CCL20基因错配对照的细胞克隆(HaCaT-5和HaCaT-6).经荧光定量PCR和ELISA法检测显示,4株CCL20基因特异性细胞克隆均具有稳定干扰效果,不仅能显著地下调CCL20基因的mRNA表达(其抑制率分别为81.0%、89.0%、81.3%、77.2%),而且明显地减少CCL20蛋白分泌(其抑制率分别为70.0%、86.1%、88.1%、90.7%).结论 采用重组慢病毒CCL20基因特异性shRNA载体感染HaCaT可以筛选出具有长期稳定表达RNA干扰效应的CCL20基因敲低型人永生化角质形成细胞克隆,将可能为低免疫排斥反应异基因组织工程皮肤的构建提供种子细胞.     

慢病毒介导的RNA干扰沉默Wip1基因对人脑胶质母细胞瘤细胞生长的影响

目的 构建人Wip1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默人胶质瘤U251细胞的Wip1基因并观察其对细胞生长的影响.方法 设计并合成3条Wip1基因特异性RNAi靶序列,构建到慢病毒pFU-GW-iRNA载体中.慢病毒包装转染HEK293T细胞,获得病毒上清并测定其滴度;感染U251细胞,实时定量聚合酶链反应(PCR)及Western blot鉴定RNA干扰效率;筛选出基因沉默效率最高的慢病毒感染U251细胞,CCK-8法检测细胞的增殖,Western blot检测RNA干扰后的bcl-2蛋白表达.结果 PCR扩增和测序表明成功构建Wip1慢病毒干扰载体,病毒载体包装获得的病毒上清滴度在3×10~8～8×10~8 TU/ml.可以有效地沉默U251细胞中Wip1基因的表达,构建的RNAi慢病毒载体感染U251细胞后Wip1基因的mRNA表达量同对照组比较分别为36.3%、32.9%、23.8%.稳定Wip1 RNA干扰后的U251细胞4 d后细胞增殖能力下降35.1%.结论 慢病毒介导的RNA干扰可以高效稳定地沉默基因表达,Wip1基因促进了U251细胞的增殖.     

人生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1基因重组慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定

目的 探讨构建人类生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1(Gab1)基因重组慢病毒RNA干扰载体的方法,研究其对人脐静脉血管内皮细胞株EA.hy926的沉默效率.方法 针对人类Gab1基因设计5个靶点的小干扰RNA (siRNA)序列,并分别合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I限制性内切酶双酶切后的GV118载体连接,产生Gab1-RNA干扰(RNAi)转化子,聚合酶链反应(PCR)筛选阳性克隆并进行测序鉴定.将测序正确的Gab1-RNAi、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染239T细胞,包装产生LV-Gab1-RNAi慢病毒并测定其滴度.将获得的慢病毒分别转染EA.hy926细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,测定其转染效率;通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后的EA.hy926细胞中Gab1 mRNA表达水平来验证慢病毒干扰载体的基因沉默效率.结果 经PCR分析和测序证实,成功构建LV-Gab1-RNAi慢病毒载体;病毒滴度为3×109 TU/ml;荧光显微镜下转染组细胞GFP荧光表达强烈,转染效率达70％以上;RT-PCR证实干扰组细胞Gab1 mRNA表达水平(0.088 ±0.003)较对照(0.947±0.087)组和空白组(0.999±0.067)显著降低(P＜0.01).结论 成功构建人Gab1基因RNAi慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够的病毒滴度,能明显抑制Gab1基因在EA.hy926细胞株中的表达.     

E-cadherin重组慢病毒载体的构建及表达

[目的]构建E-cadherin过表达和RNAi慢病毒载体,转染A549肿瘤细胞,观察E-cadherin的表达。[方法]根据Gene Bank E-cadherin的序列,选择设计两条序列和一条无关RNAi序列作为对照,通过Mlu I和Nde I两个酶切位点,将设计好的siRNA片段插入包装质粒PHR-SIN-CSGW-H1a(PHR)构建E-Cadherin RNAi慢病毒载体PHR-EA、PHR-EB。PCR扩增E-cadherin基因与pc DNA3.1质粒使用Bam HI、Xho I双酶切,连接鉴定后,亚克隆至慢病毒载体PHR,构建-E-cadherin过表达慢病毒载体PHR-E-cadherin。慢病毒包装后,感染A549肿瘤细胞,观察表达。[结果]成功构建E-cadherin过表达和RNAi慢病毒载体,并分别经PCR和质粒酶切鉴定。RTPCR检测E-cadherin的干扰和过表达情况,两个E-cadherin的RNAi病毒感染细胞后,都能使目的基因表达下调,而E-cadherin过表达慢病毒转染后细胞的E-cadherin表达明显提高了。Western Blot检测证实E-cadherin的表达确实被慢病毒所上调和干扰。[结论]成功构建出E-cadherin基因过表达和RNAi慢病毒载体,并在A549肿瘤细胞中成功表达,为进一步转染神经干细胞观察其生物学影响及对脊髓损伤修复的效果奠定基础。     

小鼠RelB基因siRNA慢病毒载体的构建及鉴定

默效率.用pVSVG,plp1,plp2慢病毒包装系统质粒在磷酸钙介导下共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 聚合酶链反应(PCR)和测序证实,成功构建RelB-shRNA的慢病毒载体pLentiLox-sh-RelB.Western blot鉴定最有效的siRNA序列为5'-TGTGGTCAGGcATCTGCTTG-3',病毒液过滤后测定滴度为8×1010 pfu/L.结论 成功构建小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体.     

靶向线粒体转录因子A大鼠活体RNA干扰实验动物模型的建立

目的：在体外构建并筛选出靶向线粒体转录因子A（TFAM）的有效RNA干扰慢病毒载体,用于大鼠整体RNAi实验,观察其对肝组织中目的基因表达的干扰效果。方法：设计4条siRNA序列并合成双链DNAoligo,制备目的基因RNA干扰慢病毒载体,体外感染目的细胞,利用RT-PCR和Western blot的方法检测目的基因TFAM的表达情况,从而筛选出有效的干扰靶点。构建大鼠活体RNAi动物模型,观察大鼠肝脏中靶基因表达的变化情况。结果：酶切鉴定及测序结果均提示siRNA序列成功连接入载体中。RT-PCR结果提示3号靶点的干扰效率最高,达到了55%左右,Western blot也验证了其干扰的有效性。大鼠活体RNAi结果显示,肝脏中目的基因的表达也明显减少,这种表达减弱具有特异性和靶向性。结论：TFAM靶向RNA干扰慢病毒载体构建成功,能有效抑制目的细胞中线粒体转录因子A的表达。构建的慢病毒载体在大鼠活体内也具有良好的干扰效果。该研究为下一步利用此慢病毒载体进行活体RNA干扰打下了基础。     

慢病毒介导的膜孔相互作用分子1基因敲减对SMMC7721细胞凋亡的影响

目的 观察膜孔相互作用分子1(Stim1)基因表达下调对肝细胞癌(HCC)细胞凋亡的作用.方法 设计和合成Stim1基因干扰序列,构建慢病毒介导的RNA干扰载体,利用第3代慢病毒包装系统进行病毒制备;干扰慢病毒以2倍感染复数( MOI)感染SMMC7721细胞,定量聚合酶链反应(PCR)和免疫印迹法(WB)检测Stim1基因表达;采用碘化丙锭(PI)和膜联蛋白V( Annexin V)双染法检测SMMC7721细胞的凋亡变化. 结果 测序结果表明干扰序列连入干扰载体;定量PCR和West-em blot法检测结果显示干扰慢病毒感染可以抑制Stim1基因75％以上的表达;流式细胞仪检测结果表明在Stim1基因被敲减后,凋亡细胞的比例从8％上升到26％.结论Stim1基因的敲减促进SMMC7721细胞的凋亡.     

靶向人乳腺癌HPSE基因的shRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：应用RNA干扰技术构建HPSE shRNA重组慢病毒载体,并筛选出最显著抑制HPSE表达的shRNA干扰序列。方法：体外化学合成针对HPSE基因的siRNA序列,在慢病毒载体介导下转染MDA-MB-231细胞,实时定量PCR检测HPSE mRNA表达水平。结果：HPSE shRNA转染MDA-MB-231细胞72 h后,RT-PCR结果表明：所设计的siRNA1组、siRNA4组针对不同靶点的shRNA与对照组相比均可有效抑制HPSE的表达,且成功筛选出最有效抑制HPSE表达的shRNA4序列（P〈0.05）。结论：成功构建了HPSE shRNA重组慢病毒载体,其转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后显著抑制了HPSE的表达,为进一步探讨乳腺癌的侵袭转移机制及肿瘤的基因治疗提供了实验基础。     

靶向人SIRT1基因的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建针对人SIRT1基因的shRNA真核表达质粒,并筛选出对胰腺癌细胞系PANC-1基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。方法针对SIRT1基因的mRNA序列设计,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经大肠杆菌扩增,酶切,PCR,测序鉴定,转染胰腺癌PANC-1细胞,实时荧光定量PCR和Western blot检测SIRT1 mRNA和蛋白的被抑制情况。结果经测序证实,成功构建SIRT1-shRNA真核表达质粒,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。重组质粒转染PANC-1细胞后,SIRT1 mRNA和蛋白水平明显下调;其中以1号重组质粒效应最强。结论成功构建了携带以SIRT1为靶向的shRNA的重组质粒。其对胰腺癌PANC-1细胞SIRT1的表达具有显著抑制效应。该实验为进一步研究SIRT1的功能和肿瘤的基因治疗提供了实验基础。     

shRNA稳定抑制XIAP和survivin表达对胰腺癌细胞生物学特征的影响

目的:探讨慢病毒载体介导的RNA干扰(RNAi)技术对胰腺癌细胞X-连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)和生存素(survivin)的抑制作用及对胰腺癌细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响。方法:应用pGCSIL-PUR和pGCSIL-NEO分别构建针对XIAP和survivin的shRNA慢病毒载体,转染胰腺癌细胞株SW1990和Panc-1,经嘌呤霉素和新霉素筛选并扩大培养得到稳定转染株;实时荧光定量PCR和Western blot检测胰腺癌细胞内XIAP和survivin的表达;MTT法检测细胞增殖和化疗敏感性;caspase-3/7活性测定和DAPI染色分析细胞凋亡情况。结果:筛选XIAP和survivin的有效干扰靶点后,获得XIAP和survivin表达稳定抑制的SW1990和Panc-1细胞株。MTT检测显示稳定抑制XIAP或survivin后,两种胰腺癌细胞增殖均明显减弱,且两者联合抑制后作用增强;虽然抑制XIAP或survivin后对两种胰腺癌细胞凋亡无明显影响,但能明显增加其对化疗药物(5-FU,吉西他滨)的敏感性,且两者联合抑制后作用明显增强。结论:慢病毒载体介导的靶向XIAP和survivin的RNAi可有效抑制XIAP和survivin的表达,降低胰腺癌细胞的增殖能力并增强其对化疗药物的敏感性,且两者联合具有协同作用。     

大鼠Aggrecanse-1，2特异性shRNA慢病毒表达载体的构建及测序

目的：利用RNA干扰技术，以大鼠aggrecanse-1，2基因为靶基因，设计aggrecanse-1，2基因特异性的小干扰RNA（siRNA），构建其短发夹RNA（shRNA）重组慢病毒表达载体，并进行测序鉴定。方法：根据Tuschl原则设计并合成大鼠aggrecanse-1，2基因特异性的DNA寡核苷酸，连接到经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切线性化的pKCSHR-GFP质粒上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落、扩增后提取质粒，进行DNA测序鉴定。结果：将合成的8对大鼠aggrecanse-1，2基因特异性DNA寡核苷酸序列退火后，分别克隆到线性化的pKCSHR-GFP载体质粒上。在氨苄青霉素培养基条件下，筛选出相应的阳性菌落，经DNA测序鉴定确定为设计的序列。结论：成功构建了8对大鼠aggrecanse-1，2基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体，可进一步用于干扰aggrecanse-1，2基因的mRNA转录，从而为制备aggrecanse-1，2基因表达受抑制的大鼠软骨细胞奠定基础。     

STAT1过表达慢病毒载体的构建及其在MHCC97L细胞中的表达

目的：构建STAT1基因过表达慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。方法：根据人STAT1基因mRNA序列,全基因合成STAT1基因,构建至过表达载体并转化至感受态细胞DH5OC,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用荧光定量PCR和Westernblot检测原始细胞株（MHCC97L）,稳转细胞株（MHCC97－statl）中STAT1的表达情况,确定STAT1过表达的有效性。结果：测序证实STAT1基因过表达载体构建成功。过表达慢病毒包装成功。慢病毒转染人肝癌细胞MHCC97L48h后,STAT1基因在mRNA水平和蛋白质水平上表达显著增加。结论：STAT1基因过表达慢病毒载体构建成功,并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。     

血管内皮生长因子基因在人胚胎胰岛干细胞中的表达

目的 构建含血管内皮生长因子(VEGF)基因的慢病毒载体,转染人胚胎来源的胰岛干细胞(hPSC),探讨VEGF在胰岛干细胞中的体外表达水平及其影响因素.方法 将VEGF基因克隆入慢病毒载体,利用293T细胞包装出病毒,按拷贝数分别为2、5、10转染胰岛干细胞,测定不同转染组VEGF的分泌水平.结果 含VEGF的病毒上清可以在体外培养条件下成功转染胰岛干细胞,经潮霉素筛选3 d后,对照组及拷贝数分别为2、5、10的转染组每1×106个细胞每小时VEGF的分泌量分别为(60.3±13.4)、(1622.0±302.0)、(2270.0±340.0)、(3090.0±465.0)ng/L.对照组与转染组间(P＜0.05)以及各转染组之间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 含VEGF的慢病毒载体可以成功转染人胚胎来源的胰岛干细胞,使其持续高表达VEGF,通过改变转染拷贝数可在一定水平上控制VEGF的分泌水平.

Abstract：

Objective To transfect vascular endothelial growth factor (VEGF) gene into human pancreatic stem cells (hPSC) by lentiviral vectors. Methods VEGF gene was sub-cloned into the lentiviral transfer vectors which also encoded hygromycin gene. The recombinant lentiviral vectors were packaged by 293T cells through three plasmids transient co-transfection method using standard lipofectamine reagent.The viral titers were tested by transfecting 293T cells. hPSC were transducted under different multiplicity of infection (MOI). VEGF secretion level was tested by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results Lentiviral vectors encoding VEGF and hygromycin resistance gene were constructed. Using lentiviral vectors encoding VEGF, we successfully transfected hPSC, and the transfected hPSC expressed VEGF continuously. On the day 3 after screening by hygromycin, the content of VEGF secreted by 1 × 106 cells per h was (60. 3 ± 13.4), ( 1622.0 ±302. 0), (2270. 0 ±340. 0), (3090. 0 ±465. 0) ng/L respectively when MOI was 0, 2, 5 and 10. The results indicated that VEGF expression was influenced by MOI ( P ＜ 0. 05 ).Conclusion Lentiviral vectors encoding VEGF and hygromycin resistance gene were constructed and could be used to transfect human pancreatic stem cells successfully.     

人分化抑制蛋白1慢病毒干扰载体的构建、筛选及其沉默效应的鉴定

目的探索以小干扰RNA（si RNA）慢病毒干扰载体组建的慢病毒对人Hep G2细胞分化抑制蛋白1（Id1）基因的沉默效应。方法构建4种针对Id1基因不同干扰靶点的Id1-siRNA慢病毒干扰载体（pCGSIL-GFPId1-1、pCGSIL-GFP-Id1-2、pCGSIL-GFP-Id1-3及pCGSIL-GFP-Id1-4）,将其转染至293T细胞,以筛选出针对Id1基因的最有效的RNA干扰（RNAi）靶序列。再以沉默效果最优的干扰载体进一步构建慢病毒（Id1-RNAi-LV）,感染人HepG2细胞后,采用实时定量PCR法和Western blot法分别检测其Id1 mRNA及其蛋白的表达水平。结果与pCGSIL-GFP-Id1-1组、pCGSIL-GFP-Id1-2组及p CGSIL-GFP-Id1-3组比较,pCGSIL-GFP-Id1-4组的Id1蛋白表达水平最低（P〈0.05）,沉默效果最优。以pCGSIL-GFP-Id1-4干扰载体组建慢病毒后,测得慢病毒的病毒滴度为2.0×10^9 TU/mL。与空白对照组和阴性对照组比较,以组建的慢病毒感染人HepG2细胞后,人HepG2细胞中Id1m RNA及其蛋白的表达水平均降低（P〈0.05）。结论本实验构建的特异性慢病毒可稳定地介导Id1基因的沉默。     

Nesprin蛋白对骨髓间充质干细胞的影响

目的构建nesprin蛋白siRNA慢病毒载体(LV-siNesprin),感染骨髓间充质干细胞(MSCs),观察nesprin蛋白对MSCs的影响。方法针对nesprin靶基因序列设计并合成4对miRNA oligo,并将4对oligo退火成双链DNA,测序鉴定。将4种miRNA干扰质粒(SR-1、SR-2、SR-3、SR-4)转入大鼠血管平滑肌细胞,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白印迹法(Western blotting)检测干扰效应,筛选最佳干扰序列;将最佳干扰序列和pDONR221载体进行重组反应,获得含干扰序列的入门载体,再将入门载体和慢病毒表达的目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应获得含干扰序列的LV-siNesprin+绿色荧光蛋白(GFP),包装慢病毒,测定病毒滴度。LV-siNesprin+GFP转染MSCs,Western blotting鉴定比较nesprin蛋白表达情况(分为LV-siNesprin+GFP组、GFP对照组和正常细胞组),用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察细胞核形态改变和四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测MSCs感染LV-siNesprin后24 h、48 h、72 h和96 h的增殖情况(分为LV-siNesprin+GFP组、GFP对照组和正常细胞组)。结果测序证实合成的4对miRNA oligo正确,RT-PCR和Western blotting筛选出最佳干扰miRNA质粒SR-3,成功构建LV-siNesprin,包装慢病毒,病毒悬液的活性滴度为1×106ifu/ml。LV-siNesprin转染MSCs后,nesprin蛋白表达明显下降,出现细胞核融合、核碎裂等形态学改变;MTT法检测显示,LV-siNesprin+GFP组MSCs增殖速度较GFP对照组和正常细胞组减慢。结论 Nesprin蛋白对MSCs核膜稳定维持核膜空间结构起作用,并利于细胞增殖更新。