二甲亚砜、尼克酰胺对肝细胞生长素促肝细胞增殖的影响

为探讨原代肝细胞体外增殖和分化的培养条件和机制，观察了肝细胞生长素（HPN）、二甲严砜（DMSO）有尼克酰胺（NA）对肝细胞增殖、分化的影响。结果显示肝细胞生长素刺激离体肝细胞H-TdR掺入和钙动员。DMSO抑制钙动员，NA无显著影响。肝细胞原代培养证实：NA促进DNA合成，而DMSO抑制^3H-TdR掺入，但DMSO在NA协同下使肝细胞表现为一定的延迟合成活性；肝细胞cAMP在水平96h内与增殖活性呈负相关。7d条件培养后，DMSO＋HPN及DMSO＋NA＋HPN培养组肝细胞对^3H-TdR掺入分别为NA＋HPN组的3．83及3．58倍，[Ca^ ]i瞬增分别为3．0及3．3倍。表明HPN具有体外刺激原代肝细胞增殖和分化的作用，加NA可以促进肝细胞DNA合成；DMSO则抑制^3H-TdR掺入，长期表现为稳定肝细胞作用，移除DMSO后肝细胞具有较高的增殖活性。     

肝纤维化大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为类肝细胞

目的 观察正常、肝纤维化模型组大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外诱导分化为类肝细胞的差异。方法 Wistar大鼠随机分为对照组和肝纤维化模型组。用皮下注射CCl4乳剂建立肝纤维化模型。用密度梯度离心法和贴壁法分离大鼠的MSCs,经培养传代获得纯化的MSCs。用肝细胞生长因子（HGF）和成纤维细胞生长因子-4（FGF-4）诱导培养纯化的MSCs。留取15、21和27 d细胞培养液进行白蛋白（Alb）、甲胎蛋白（AFP）检测;于27 d收集细胞爬片,进行糖原染色和免疫细胞化学染色检测MSCs中CK-18、CK-19。结果 于诱导15、21和27 d,2组经诱导培养的MSCs AFP水平均高于未诱导的MSCs（P<0.01）,其中21 d AFP水平最高;而白蛋白水平21和27 d 2组经诱导培养的MSCs均高于未诱导的MSCs（P<0.01）,15 d无差异,27 d最高。27 d 2组经诱导培养的MSCs糖原染色和CK-18、CK-19免疫细胞化学染色均阳性,未诱导的MSCs糖原染色、CK-18、CK-19均阴性。从AFP、白蛋白水平综合比较,正常和肝纤维化模型组大鼠MSCs诱导效果无明显差别。结论 HGF、FGF-4可在体外诱导肝纤维化大鼠的MSCs分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞。     

肝细胞再生因子对肿瘤坏死因子活性的影响

本文探讨了肝细胞再生因子(HGF)在体外对内毒素诱生PBM产生肿瘤坏死因子(TNF)的影响及治疗实验性大鼠肝衰竭(FHF)的效用。     

单唾液酸神经节苷脂对MPTP损害中脑多巴胺神经元的保护作用

本文研究单唾液酸神经节苷脂（ＧＭ１）对大鼠中脑多巴胺（ＤＡ）神经元体外生存及其损伤后的保护作用。取胚胎腹侧中脑制成细胞悬液，常规体外培养。实验分为四组：第一组在培养液中加入ＧＭ１（ＧＭ１组）；第二组在培养过程中使用１－甲基－４－苯基－１，２，３，６－四氢吡啶（ＭＰＴＰ）破坏ＤＡ神经元（ＭＰＴＰ组）；第三组在使用ＭＰＴＰ破坏ＤＡ神经元的同时给予ＧＭ１（ＧＭ１－ＭＰＴＰ组）；第四组为正常对照组。四组培养细胞定期抽出作免疫组化和荧光组化染色。ＧＭ１组培养各阶段，酪氨酸羟化酶（ＴＨ）免疫反应阳性细胞数量均明显多于对照组，至体外培养２周时，每孔阳性细胞数平均可达７２．８个，与对照组相比有显著性差异。ＭＰＴＰ组在加入ＭＰＴＰ１周左右，荧光组化阳性细胞已基本消失，此后ＴＨ免疫反应阳性细胞逐渐减少，至体外培养２周，每孔ＴＨ阳性细胞数平均仅剩１４．５个，与对照组相比有显著性差异。在残存的ＤＡ神经元中，突起变短或消失。ＧＭ１－ＭＰＴＰ组，体外培养期间均可看到荧光组化阳性细胞，ＴＨ免疫反应阳性细胞数量在体外培养２周时平均每孔为３１．７个，明显高于ＭＰＴＰ组。研究结果表明ＧＭ１能提高体外生长的ＤＡ神经元的生存率，并能减轻ＭＰＴＰ对?     

CHB患者PBMC中2-5AS基础活性对IFN-α信号分子改变的影响

目的 研究慢性乙型肝炎（CRIB）患者外周血单个核细胞（PBMC）中2′，5′-寡腺苷酸合成酶（2-5AS）基础活性对干扰素α（IFN-α）信号分子改变的影响。探讨IFN-α治疗CHB的作用机理。方法 取45例CHB患者外周血，分离出PBMC。一部分用于2-5AS基础活性测定，其余部分分为2组，分别用于不加IFN-α的体外培养（体外基础组）和加1000IU／ml IFN-α的体外培养（体外诱生组）。两组同时在体外进行细胞培养24h后，测定PBMC中2-5AS活性、IFN-α受体（IFN-αR）表达以及Jakl、Statl和Stat2的水平。评价2-5AS基础活性与2-5AS、IFN-αR、Jakl、Statl和Stat2在IFN-α刺激下改变（体外诱生组／体外基础组的比例）的相关性。结果IFN-α体外刺激24h后PBMC中2-5AS、Jakl、Stat1和Stat2水平明显增高（P〈0．05）；IFN-αR的表达降低（P〈0．05）。2-5AS基础活性与IFN-α刺激下2．5AS和Statl的增长呈负相关（P〈0．05），与IFN-αR、Jak1和Stat2的改变之间没有相关性（P〉0．05）。结论 2-5AS基础活性可下调PBMC对外源性IFN-α的敏感性，下调机制可能与Stat1的诱生低下有关。     

长期培养的大鼠原代肝细胞功能和形态学观察

目的：研究大鼠原代肝细胞长期体外培养后功能和形态的变化。 方法： 采用两步胶原酶原位灌流法分离大鼠肝细胞，并用Percoll分离液进行密度梯度离心进一步纯化肝细胞，采用0.4%台盼蓝染色观察细胞活力。然后将细胞接种于HepatoZYME-SFM培养基中培养，定期收集肝细胞培养液上清检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、白蛋白、尿素氮的水平。采用乙氧基试卤灵O-脱乙基酶活性（EROD）方法检测肝细胞P450的CYPⅠA1功能。 结果： 新鲜分离的大鼠肝细胞总数（2-3）×108cells/whole liver，Percoll分离液纯化后活力和纯度在90%以上。HepatoZYME-SFM培养下肝细胞生长良好并保持正常形态。AST、ALT水平在培养3 d后下降显著，6-9 d后趋于相对稳定的低水平。白蛋白的分泌功能、尿素合成能力在18 d内维持在较高水平。可在3-6 d检测到CYPⅠA1酶活性。 结论： Percoll液纯化新分离肝细胞可提高其活率和纯度，HepatoZYME-SFM培养条件下肝细胞可有效保持良好形态结构和一定的生物合成代谢能力，适合肝细胞的体外长期培养和功能研究。     

生长抑素及奥曲肽的肝细胞保护作用及其机制研究

目的： 探讨生长抑素（SST）及其类似物奥曲肽（OCT）对大鼠肝细胞的保护作用及其机制。方法: 以原代培养肝细胞建立无水乙醇/四氯化碳（CCl4）细胞损伤模型，观察SST及OCT预处理对培养上清液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）含量的影响。此外，将75只SD大鼠随机分为正常对照组、肝纤维化模型组及大、中、小剂量SST治疗组。除正常对照组外均以40％CCl4皮下注射8周，期间各SST治疗组分别给予SST 200 μg·kg-1·d-1、100 μg·kg-1·d-1、50 μg·kg-1·d-1。采用酶试剂法、末端核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷原位缺口末端标记法（TUNEL）分别检测肝功能及肝细胞凋亡指数。结果: 经SST（10-8-10-6 mol/L）及OCT（10-7-10-5 mol/L）预处理后，损伤模型组肝细胞的培养上清液中ALT、AST水平显著下降。不同剂量SST治疗还能明显降低肝纤维化大鼠的血清ALT、AST、碱性磷酸酶（ALP）及总胆红素（TBIL）水平，提高血清清蛋白（ALB）水平，抑制肝细胞凋亡，其中小剂量SST治疗组最佳。结论: SST及OCT可减轻CCl4引起的肝细胞损伤，改善肝功能，并抑制肝细胞凋亡，可能在肝纤维化的防治中发挥重要作用。     

细胞生理条件下壳聚糖微胶囊包埋肝细胞

从乙酰化率15．3％的市售壳聚糖（Fifteen N-acetylated chitosan，FNC）出发制备酰化率50％的壳聚糖衍生物（Half N-acetylated chitosan，HNC），探讨其在细胞生理条件下与异丁烯酸（Methacrylic acid，MAA）-羟乙基异丁烯（Hydroxyethyl methacrylate，HEMA）-甲基丙烯酸甲酯（Methyl methacrylate，MMA）三元共聚物（MAA-HEMA-MMA）制备微胶囊包埋肝细胞的可行性。微囊化细胞实验结果表明，与体外表面培养实验相比，生理条件下基于HNC构建的三维正电微环境有利于支持肝细胞的体外功能，且制备的微胶囊在培养过程中具有较好的渗透性及结构稳定性。     

槲皮素对LPS诱导的体外培养肝细胞损伤的影响及机制

目的： 通过体外观察槲皮素对脂多糖（LPS）所致肝细胞损伤和肿瘤坏死因子（TNF-α）表达的影响，探讨槲皮素的作用及其机制。方法：胶原酶灌流分离培养大鼠肝细胞，40 mg/L LPS诱导损伤，同时用0.5-10 μmol/L浓度槲皮素进行干预，作用24 h后，四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）、PI-AnnexinV染色检测肝细胞的增殖凋亡比例、测定上清液乳酸脱氢酶含量，ELISA、RT－PCR方法检测TNF-α表达。结果：40 mg/L LPS作用于原代培养大鼠肝细胞24 h后，与对照组相比，细胞生长抑制率达27%，细胞总凋亡率30.2%，培养上清液LDH含量增加20倍，TNF-α mRNA和蛋白表达明显增加（P<0.05）。给予0.5-10 μmol/L槲皮素后，各项指标有明显下降，且呈量效关系。结论：0.5-10 μmol/L槲皮素拮抗LPS所致的肝细胞损伤，其保护作用的机制可能与抑制TNF-α的表达有关。     

一氧化氮在实验性肝损伤中的作用

目的：观察３种细胞因子对体外培养大鼠肝细胞产生一氧化氮（ＮＯ）的影响及ＮＯ在实验性肝损伤中的作用。方法与结果：给大鼠注射内毒素后分离肝细胞,培养液中加入细胞因子（γ－ＩＦＮ,ＩＬ－２,ＴＮＦ－α）,上清液中ＮＯ含量增加,两种以上细胞因子联合应用,ＮＯ含量增加更明显;大鼠注射内毒素及Ｌ－精氨酸,血清中ＮＯ含量增加,肝损伤减轻;大鼠给硫代乙酰胺（ＴＡＡ）灌胃,并注射ＮＯ生成抑制剂Ｌ－ＮＮＡ,动物出现嗜     

IL—10对佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞及脾淋巴细胞诱生IL…

本文研究了ＩＬ－１０对佐剂性关节炎（ＡＡ）大鼠腹腔巨噬细胞（ＭΦ）及脾淋巴细胞在体外诱生ＩＬ－８的影响，还探讨了ＩＬ－１０经腹腔注射后对ＡＡ大鼠的治疗作用以及在体内对ＩＬ－８合成的影响，并利用核酸杂交技术初步探讨了ＩＬ－１０的作用机制。结果表明，ＡＡ大鼠腹腔ＭΦ及脾淋巴细胞分泌ＩＬ－８的能力明显高于正常大鼠。在体外ＩＬ－１０能显著下调ＩＬ－８的表达。ＡＡ大鼠经ＩＬ－１０治疗后症状明显改善，ＩＬ－８     

改良原代大鼠肝细胞的体外分离培养和功能研究

目的建立经济有效且功能良好的原代肝细胞体外分离培养系统。方法采用0．02％胶原酶和Percoll分离液分离纯化大鼠肝细胞．光镜和电镜下观察HepatoZYME-SFM培养的肝细胞形态，自动生化仪定期检测培养肝细胞功能，RT—PCR半定量方法检测白蛋白mRNA，高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析安定代谢能力。结果分离纯化的大鼠肝细胞总数（2-3）×10^8 cells／整肝，活力和纯度大于95％，生长良好形态正常。培养3d后ALT、AST显著下降，加入NH4Cl后8d内BUN保持相对稳定高水平，白蛋白合成在第3-4天达到高峰，培养的2～5d内肝细胞可有效清除安定。结论通过使用低浓度胶原酶灌流、Pereoll分离液纯化以及HepatoZYME—SFM无血清培养基培养，肝细胞可有效保持良好形态结构和一定的生物合成代谢能力。     

体外生物人工肝支持系统生物功能的体外研究

用２×１０８ 个混合聚集球形培养的人肝细胞、肝非实质细胞与中空纤维型生物反应器组成体外生物人工肝支持系统（ＥＢＬＳＳ）,通过循环液（ＰＲＩＭ １６４０）中肝细胞合成分泌产物的分析,评价其生物功能。结果表明,经过６ ｈ 的体外循环,循环液中总蛋白、白蛋白、甲胎蛋白和尿素含量均显著增加,该循环液使体外培养大鼠肝细胞ＤＮＡ 合成率显著增加（与对照组比较Ｐ＜ ００１）,实验后球形体肝细胞仍保持良好的活力。提示由培养人肝细胞和中空纤维型生物反应器组成的体外生物人工肝具备肝脏生物合成功能,并有刺激肝细胞增殖的能力。     

灵芝多糖对戊四氮活化海马神经细胞NF-κB变化的影响

目的：本文以新生大鼠的海马神经细胞为研究对象，通过体外培养新生大鼠海马神经细胞, 观察神经细胞生长状况,制备细胞癫痫模型,检测灵芝多糖对癫痫大鼠海马神经细胞的NF-κB变化的影响,进一步探讨癫痫的发病机制及灵芝多糖的作用。方法:将体外培养海马神经细胞随机分为模型组、灵芝多糖处理组、对照组,用免疫荧光化学分析方法检测NF-κB表达的变化。结果:体外培养新生大鼠的海马神经细胞成功，在培养的第7 d，制备细胞癫痫模型，通过免疫细胞荧光化学反应证明戊四氮（PTZ）的作用使NF-κB核表达较灵芝多糖处理组和对照组明显增多，提示海马神经细胞被活化，灵芝多糖处理组较模型组NF-κB核表达少。结论:应用无血清培养基及联合阿糖胞苷培养方法，神经细胞生长良好，获得神经细胞的纯度达90%以上，为神经细胞相关的实验研究提供了良好的模型。灵芝多糖可能通过减少神经细胞内钙离子内流，从而间接抑制PTZ诱导的NF-κB活化，降低神经细胞的兴奋性，达到抗癫痫作用。     

高压氧对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后在体神经干细胞的影响

目的： 新生鼠的神经生发区-室管膜下区（SVZ） 和海马齿状回（DG）聚集了多种不同发育阶段神经干细胞（NSCs），它们可分化产生新的神经元和胶质细胞。本研究探讨缺氧缺血性脑损伤（HIBD）对脑生发区NSCs的损伤及高压氧（HBO）对此损伤的影响。从在体NSCs 探讨HBO对新生大鼠HIBD的保护作用机制。 方法： 新生7 d龄SD大鼠随机分为4组：① 正常对照组（CON，n=16）；② HIBD 模型组（HIBD，n=16）；③ 高压空气组（HBA，n=16）；④HBO治疗组（n=16）。Rice法复制HIBD模型，并予HBA或HBO治疗，每天1次共7 d。BrdU免疫组化显示在体NSCs。并取损伤侧脑SVZ区组织，体外NSCs培养并进行神经干细胞球计数。 结果： HIBD组生发区在体BrdU 阳性细胞和体外培养的神经干细胞球数目明显少于对照组。HBO组SVZ区的BrdU阳性细胞增多；体外培养的神经干细胞球增多。HBA组增加不明显。 结论： 新生大鼠HIBD后生发区NSCs减少，HBO治疗可以减轻HIBD后NSCs的死亡。HBA治疗无明显作用。     

维生素E对培养的肝细胞和储脂细胞细胞外基质的影响

1989 年,Chojkier 和Igarashi 分别报告脂质过氧化可发生在未受刺激、静止的培养成纤维细胞和活体正常组织。本实验旨在了解体外培养大鼠肝细胞和储脂细胞（Ito 细胞）是否存在过氧化脂质和前胶原基因表达的产物,正常培养大鼠Ito 细胞有无其它细胞外基质的产生,维生素E（ VE）能否抑制基础脂质过氧化和细胞外基质（ECM）产生。1 材料和方法用体重为180～210g、680～740g雄性Wistar 大鼠,分离培养肝细胞、Ito 细胞。参照Moshage 的方法分离大鼠Ito 细胞,培养1 周后用Desmin 多抗行免疫组化鉴定,结果显示95%以上Desmin 染色阳性…     

靶向趋化因子受体CCR7的反义肽核酸对树突状细胞凋亡的影响

目的研究靶向趋化因子受体CCR7的反义肽核酸（PNA）对树突状细胞（DC）CCR7蛋白表达及凋亡的影响，并探讨其凋亡机制。方法体外培养大鼠骨髓来源的Dc，脂多糖（LPS）诱导成熟。设计靶向CCR7mRNA翻译起始区的反义PNA，以随机PNA和空白组为对照处理体外培养7d的未成熟Dc，脂多糖诱导48h后收集成熟Dc，免疫细胞化学染色法检测CCR7蛋白表达，流式细胞术检测细胞凋亡率，Westernblot检测磷酸化Akt和Akt蛋白表达。应用渥曼青霉素（wortmannin）抑制磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol3-kinase，P13K）／Akt信号通路进一步观察磷酸化Akt蛋白表达和细胞凋亡率的变化。结果反义PNA组DCCCR7蛋白表达明显低于随机PNA组和空白组，而细胞凋亡率却明显增高，差异有统计学意义（P〈0．05），Westernblot检测显示反义PNA组Akt蛋白磷酸化水平明显低于随机PNA组和空白组，差异有统计学意义（P〈0．05）。DC经P13K抑制剂预处理后，CCR7介导的Akt蛋白磷酸化及抗凋亡作用被阻断。结论CCR7反义PNA能够有效抑制体外培养的大鼠DC趋化因子受体CCR7的表达并导致其发生凋亡，其机制可能是阻断了CCR7介导P13K／Akt信号转导通路的活化。     

抗纤灵、丹参、大黄等药物血清对系膜细胞分泌FN和Ⅳ型胶原的影响

目的：探讨抗纤灵及其主要成分丹参、大黄等对大鼠肾小球系膜细胞分泌FN和Ⅳ型胶原的影响。方法：采用ElisA法观察中药抗纤灵方、丹参、大黄等药物血清对大鼠肾小球系膜细胞分泌FN和Ⅳ型胶原的影响。结果：（1）抗纤灵、丹参、大黄等含药血清对系膜细胞分泌FN的影响。慢性肾衰（5／6肾切除法）模型组大鼠的血清可显著促进体外培养的系膜细胞分泌FN，假手术组大鼠的血清也可增加系膜细胞分泌FN。抗纤灵组、丹参组、     

大鼠睾丸支持细胞对体外共微囊化肝细胞的双重保护作用

目的 观察大鼠睾丸支持细胞(Sertoli cell)对混合共微囊化肝细胞的营养支持和免疫豁免(immune privilege)的双重保护作用.方法 气流法制备含不同比例肝细胞与Sertoli细胞混合的微囊进行体外培养,测定培养上清中白蛋白、尿素的含量,结合形态学判断肝细胞的功能和活性,并选择细胞最佳混合比例.CCK-8法测定Sertoli细胞对肝细胞引起的脾细胞增殖的影响.结果 与纯肝细胞微囊组相比,一定比例的Sertoli细胞可促进共微囊化肝细胞的白蛋白和尿素合成(P＜0.01),肝细胞存活时间也相应延长.其中,肝细胞和Sertoli细胞以20:1混合时即可达最佳效果.在脾细胞增殖反应中,与对照组相比,微囊化肝细胞仍可引起明显的脾细胞增殖(P＜0.01),而Sertoli细胞可显著抑制这一反应.结论 Sertoli细胞与肝细胞混合共微囊化能明显改善囊内肝细胞的形态、功能与寿命,并使后者得到一定的免疫豁免保护作用.     

肝纤维化大鼠部分肝切除后肝星状细胞活化和肝细胞生长因子的表达

目的：研究肝星状细胞在肝纤维化大鼠部分肝切除后的活化情况及其对肝细胞生长因子表达和肝再生的影响。方法：成年雄性SD大鼠，随机分成3组：正常组、肝纤维化组和肝纤维化大鼠部分肝切除组。其中肝纤维化大鼠部分肝切除组根据术后取材时间又分为6小组，分别于术后12h、1、3、5、7和14d取材。计算肝指数评价肝再生情况；用免疫组化、免疫荧光和免疫印迹方法检测各组大鼠肝组织中α平滑肌肌动蛋白和肝细胞生长因子的表达情况。结果：肝纤维化大鼠部分肝切除后肝指数逐渐增加，但递增速度缓慢；肝组织中α平滑肌肌动蛋白的表达呈现出先降低后升高的规律；肝细胞生长因子表达早期下降，而后升到一最高值后开始降低。结论：（1）肝纤维化大鼠部分肝切除后残肝可以再生；（2）活化肝星状细胞术后呈现出先减少后增多的规律性变化；（3）肝星状细胞可能是术后肝细胞生长因子表达和残肝再生的重要影响因素。