慢病毒载体及基因开启技术构建过表达GATA-4骨髓间充质干细胞

目的:用慢病毒载体及基因开启构建过表达GATAG-4小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)。方法:将已构建成功的GATA-4基因插入慢病毒包装质粒GV308中,构建GV308-GATA-4重组慢病毒包装质粒。将构建成功的GV308-GATA-4重组慢病毒包装质粒转染入小鼠BMSCs,并加入基因开启剂强力霉素(DOX)。转染成功后利用RT-PCR及Wstern blot法检测转染24、48、72hGATA-4基因量的表达及转录因子GATA-4的表达。结果:RT-PCR及Western blot实验均提示,随着转染时间的延长,GATA-4在小鼠BMSCs内的表达量是增加的。结论:利用慢病毒载体及基因开启技术构建过表达GATA-4小鼠BMSCs成功。     

慢病毒介导大鼠肾脏基因转染的实验研究

目的 研究活体大鼠肾脏中慢病毒载体介导的基因转染及表达情况。方法 以水泡性口炎病毒包膜蛋白(VSV-G)为包膜、携带以磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子启动的LacZ报告基因的慢病毒载体注射Lewis大鼠右侧肾脏实质，分别于注射后1、2、3、7天处死大鼠(每个时间点实验组n=3，对照组n=2)，通过β-半乳糖苷酶(β-Gal)组织化学染色检测报告基因的表达。结果 实验组大鼠右肾可见β-Gal染色阳性细胞，而对侧肾脏及其他脏器均未见β-Gal表达；β-Gal的表达在。肾实质注射2天后达到峰值，到第7天仍能维持较高水平。β-Gal阳性细胞周围未见明显炎症细胞浸润。病毒载体注射的肾脏外观及组织形态学未见异常。结论 慢病毒载体能有效而稳定的将外源基因导入活体大鼠。肾脏而无明显毒副作用。     

小鼠肺部TMEM16A基因表达沉默模型的建立

目的 构建小鼠TMEM16A-shRNA慢病毒载体,通过气管内注射慢病毒载体,局部部分沉默小鼠肺部TMEM16A基因的表达,为后续在体研究TMEM16A在肺部作用提供基础.方法 ①构建小鼠TMEM16A-shRNA慢病毒载体;②免疫荧光法验证LA795小鼠肺腺癌细胞膜上TMEM16A的表达,体外行慢病毒感染实验,确定感染的最佳条件,最后体外实验确定慢病毒的干扰效率;③链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶连接法(streptavidin-perosidase,SP)法验证肺组织中TMEM16A的表达;④气管内注射慢病毒2周后行支气管肺泡灌洗,BAC法检测灌洗液中蛋白及酶联免疫吸附法测定(ELISA)法检测炎症因子肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-a,TNF-α)、IL-1β及IL-10的浓度;⑤气管内注射慢病毒2周后取材肺组织提取蛋白用蛋白印迹法(Western blot)验证在体TMEM16A-shRNA慢病毒载体的沉默效率.结果 ①LA795细胞膜上存在TMEM16A的表达,LA795细胞在5 mg/L的Eni.S+ polybrene条件下容易被感染,病毒感染复数(MOI)为20;②Western blot进一步显示体外细胞慢病毒shRNA的沉降效率约81.35％(P＜0.05);③气管内注入Lenti-Neg-shRNA后BALF的蛋白含量无增加,细胞因子TNF-α、IL-1β及IL-10的浓度无明显变化(P＞0.05);光镜下肺组织结构正常,未造成病理损伤;④气管内注入Lenti-TMEM16A-shRNA后,Western-blot结果显示TMEM16A表达水平降低(P＜0.05),达到在肺部部分沉默TMEM16A的目的.结论 本研究成功构建小鼠TMEM16A-shRNA慢病毒载体,体内实验证实慢病毒气管内注射是比较安全,未增加肺组织的蛋白渗漏及病理损伤,并能有效转染气道及肺泡上皮细胞并在局部表达,成功沉默肺部TMEM16A的表达.     

重组1和2型腺相关病毒载体在小鼠心脏转导研究

目的探讨重组1和2型腺相关病毒(rAAV1和rAAV2)载体向小鼠心脏转导效果。方法14只昆明小鼠应用经腹心包腔内注射术,分别将携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)、荧光素酶(LUC)报告基因的rAAV1(rAAV1-EGFP组6只,rAAV1-LUC组1只)r、AAV2(rAAV2-EGFP组6只,rAAV2-LUC组1只)分别转导入小鼠的心包腔内,使用共聚焦显微镜观察EGFP在心肌的表达,冷光CCD相机体内监测LUC在心肌表达。结果rAAV1-EGFP组绿色荧光出现于心肌组织全层;rAAV2-EGFP组绿色荧光仅局限于心外膜下少数心肌细胞。rAAV1-EGFP组小鼠心肌细胞的表达范围和强度优于rAAV2-EGFP组。rAAV1-LUC组小鼠心肌组织表达强度、持续表达时间优于rAAV2-LUC组。结论在小鼠心脏中,rAAV1是一种比rAAV2更为有效的转基因载体。     

逆转录病毒介导的靶向人Slingshot-1L基因稳定转染人骨髓间充质干细胞系的建立

目的 建立过表达该基因的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)稳定转染细胞系.方法 采用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离、纯化hMSCs .应用脂质体法将Slingshot-1L 重组逆转录病毒载体pLNCX-Slingshot-1L转染PA317包装细胞,G418筛选,滴度测定.收集病毒上清感染第2代hMSCs,G418筛选,挑选阳性克隆,扩增培养.结果 采用密度梯度离心法联合贴壁培养法成功分离、纯化了hMSCs,应用pLNCX-Slingshot-1L重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞,获得滴度为5×10~8 CFU /L的病毒上清.收集病毒上清感染hMSCs,获得了过表达Slingshot-1L基因的hMSCs.结论 应用Slingshot-1L重组逆转录病毒载体,成功建立了过表达该基因的hMSCs稳定转染细胞系.     

慢病毒载体在大鼠颈动脉球囊损伤模型中的应用及观察

目的:研究携带绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的慢病毒转染球囊损伤大鼠颈动脉的效率和可行性,为利用慢病毒载体介导的基因治疗预防血管再狭窄奠定基础。方法:将携带GFP的慢病毒载体(pGC-LV-GFP载体)和慢病毒包装质粒供转染293T细胞,完成慢病毒颗粒包装及滴度测定。包装产生的慢病毒Lenti-GFP转染至球囊损伤的大鼠颈动脉。术后28d,损伤及病毒转染血管段标本分别行荧光显微镜、光镜检查,评估慢病毒的转染效率及内膜增生情况,并与假手术组(Sham组)、PBS对照组进行比较。结果:经包装产生的Lenti-GFP滴度为2×109TU/mL;术后28d,Sham组与PBS组血管中膜弹力层仅见微弱的自发性绿色荧光,而Lenti-GFP组动脉壁全层可见较强的绿色荧光分布;PBS组与Lenti-GFP转染组大鼠损伤的颈动脉均可见明显内膜增生,内膜和中膜面积之比差异无统计学意义。结论:Lenti-GFP成功转染至球囊损伤的大鼠颈动脉,并能维持目的基因稳定长期的表达,是血管再狭窄基因治疗的理想载体。     

慢病毒Hoxa3载体的构建及其对人脐静脉内皮细胞迁移和血管新生的影响

目的构建慢病毒Hoxa3载体,观察其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的转染效率,研究其对细胞迁移和血管新生的影响,并探讨Hoxa3促进血管新生的机制。方法以基因合成法从聚合酶链式反应文库获取人Hoxa3基因,酶切后插入慢病毒骨架载体,以三质粒联合转染293T细胞获得慢病毒Hoxa3载体,并进行滴度测定。转染HUVEC,获取最大转染效率。转染HUVEC后分对照组和慢病毒Hoxa3转染组,进行HUVEC迁移实验和小管形成实验,观察Hoxa3对HUVEC迁移和小管形成的影响。Western blot检测慢病毒Hoxa3载体转染HUVEC后尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)和基质金属蛋白酶14(MMP-14)蛋白表达的变化。结果成功构建慢病毒Hoxa3载体,病毒的滴度为8×1011TU/L; 30 MOI慢病毒载体对HUVEC的转染效率达到99%以上。Western blot结果显示慢病毒Hoxa3载体转染HUVEC后Hoxa3能够有效在HUVEC中表达。与对照组比较,慢病毒Hoxa3载体转染HUVEC后显著增强HUVEC的迁移和小管形成,显著增加uPAR和MMP-14蛋白的表达(P0.05)。结论成功构建的慢病毒Hoxa3载体可促进HUVEC的迁移和小管形成,其作用机制可能为上调HUVEC的uPAR和MMP-14蛋白表达。     

慢病毒介导的重组人α1-抗胰蛋白酶在小鼠体内的表达

目的:构建重组人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)因子的慢病毒表达载体,并通过体外细胞水平和小鼠体内分析其表达情况.方法:通过RT-PCR的方法扩增出hAAT基因的编码序列,并构建重组慢病毒质粒;经体外包装后,感染鼠成纤维细胞及注射小鼠.荧光显微镜下观察GFP的表达情况,同时对收获的细胞及感染小鼠的肝脏或血浆进行Western blot、ELISA检测.结果:获得重组hAAT因子的慢病毒表达质粒pLVX-ser;包装后得到8×106TU/mL滴度的慢病毒颗粒.通过荧光显微镜下观察,显示重组hAAT因子在成纤维细胞中正常表达;对小鼠尾静脉注射病毒之后,进行hAAT因子检测,Western blot结果说明hAAT因子在小鼠体内成功表达;通过ELISA检测发现hAAT在小鼠体内的表达平均达190g/L左右,而且在慢病毒的介导下hAAT在小鼠中的表达可持续3mo以上.结论:重组慢病毒载体可高效、持续表达hAAT因子,为通过基因工程生产重组hAAT因子以及为α1-AT缺乏症的基因治疗奠定基础.     

慢病毒介导的shRNA干扰人HepG2.2.15细胞Akt2基因表达的研究

目的针对Akt2基因构建shRNA慢病毒干扰载体并评价慢病毒介导的RNA干扰在人HepG2.2.15中的基因沉默效应。方法设计Akt2的RNAi寡聚核苷酸序列,利用慢病毒载体构建Akt2的shRNA载体,转染入大肠埃希菌并观察重组表达状况,利用293T细胞包装得到重组腺病毒,以绿色荧光蛋白(GFP)作为标记,逐孔稀释法确定转染效率及滴度,以实时荧光定量法比较各组对Akt2 mRNA的干扰效果。结果筛选了所构建的3个Akt2靶向序列,包装shRNA慢病毒后转染HepG2.2.15细胞,慢病毒转染后的沉默效率可达85%,比较得出沉默效率最高的靶序列和工作条件。结论本研究成功构建并筛选了针对Akt2的shRNA慢病毒载体,有效抑制HepG2.2.15细胞中Akt2 mRNA的表达。     

刚地弓形虫棒状体蛋白ROP16对小鼠脑神经细胞凋亡的影响

目的构建带有Flag标签的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白16(ROP16)的重组慢病毒表达质粒,并检测ROP16蛋白在神经细胞中的表达及其对小鼠脑神经细胞凋亡的影响。方法PCR扩增带Flag标签的ROP16基因,克隆至慢病毒载体,构建重组质粒p CDH-cop GFP-ROP16-Flag,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞,采用PCR、双酶切及测序验证。将重组质粒转染至人胚胎肾上皮细胞(293T细胞)中进行慢病毒包装,以p CDH-CMV-cop GFP空质粒对照组,荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况,并计算慢病毒滴度。将包装后的慢病毒感染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),采用蛋白质印迹(Western blotting)检测ROP16蛋白的表达情况。应用立体定位注射技术将慢病毒浓缩液注射至小鼠前额叶皮层M1区,2周后取小鼠脑组织,制备冰冻切片,TUNEL染色后,荧光显微镜下观察小鼠脑神经细胞凋亡情况。结果重组慢病毒表达质粒p CDH-cop GFP-ROP16-Flag经PCR和双酶切后均获得大小为2 200 bp的条带,与预期值相符;测序结果与刚地弓形虫RH株ROP16基因(Gen Bank登录号为GQ249093.1)序列比对完全一致。包装后的慢病毒在荧光显微镜下可见绿色荧光,滴度约为2E+8 TU/ml。Western blotting分析结果显示,在相对分子质量(Mr)120 000处有特异条带,重组慢病毒表达质粒能够在SH-SY5Y细胞内表达ROP16蛋白。感染慢病毒的小鼠脑组织冰冻切片经TUNEL染色后,荧光显微镜下可见实验组凋亡的细胞明显多于空质粒对照组。结论构建的慢病毒表达质粒p CDH-cop GFP-ROP16-Flag可在神经细胞内表达ROP16蛋白,并可导致小鼠脑神经细胞凋亡。     

慢病毒介导的PIM-1基因调控大鼠骨髓间充质干细胞增殖和对凋亡的影响

目的:观察PIM-1基因调控大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)的增殖和对凋亡的影响。方法:应用流式细胞仪(FCM)分别对第4代(P4)BMMSCs表面抗原CD29、CD44和CD45进行鉴定。实验分为空白对照组(对照组)、EGFP转染组(EGFP组)、PIM-1基因转染组(PIM-1组),将成功构建的慢病毒载体LV-egfp-PIM-1及LV-egfp转染至BMMSCs中,采用PCR法检测慢病毒载体转染后PIM-1表达的变化,用Western blot法检测慢病毒载体转染后PIM-1蛋白表达水平,用MTT比色法检测PIM-1对BMMSCs增殖能力的调控作用,FCM检测PIM-1对BMMSCs凋亡的影响。结果:大鼠BMMSCs成功转入PIM-1基因后,与对照组相比,PIM-1蛋白的表达显著增加(P0.01),细胞增殖能力显著增加(P0.01),细胞凋亡率则显著降低(P0.01)。结论:过表达PIM-1可显著提高BMMSCs的增殖能力和抑制BMMSCs凋亡。     

miR-214通过抑制TOM1表达促进肝星状细胞活化和迁移

背景:肝星状细胞(HSCs)持续激活所致的细胞外基质过度沉积是肝纤维化发生、发展的关键环节。MicroRNAs(miRNAs)是一类重要的生物调节分子,为HSC的分化、增殖、凋亡、脂肪蓄积以及胶原生成所必须。既往对HSCmiRNAs表达谱的分析显示,miR-214在HSC活化过程中表达显著增高。目的:探讨miR-214在HSC中的生物学功能及其可能机制。方法:以real time PCR检测静息和完全活化状态大鼠HSC的miR-214 mRNA表达;应用miR-214封闭慢病毒载体感染HSC以敲除miR-214表达,以Transwell细胞迁移实验、蛋白质印迹法检测感染前后HSC迁移、活化能力的变化;应用荧光质粒报告系统对TargetScan(http://www.targetscan.org/)预测的miR-214靶基因进行验证。结果:miR-214 mRNA在HSC活化过程中表达显著增高(P<0.01)。miR-214敲除组HSC Transwell小室迁移细胞数较阴性对照组显著减少(P<0.001),HSC活化标记物α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白表达显著下调(P<0.01)。预测显示TOM1为miR-214的靶基因,并得到荧光质粒报告系统证实;miR-214敲除组HSC TOM1蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论:miR-214参与促进HSC的活化和迁移,进而促进肝纤维化进程;miR-214在HSC中的生物学功能至少部分是通过抑制TOM1表达实现的。     

甲状旁腺素对骨髓间充质干细胞增殖、分化和旁分泌功能的影响

目的观察甲状旁腺素(PTH)对体外培养人骨髓间充质干细胞(hMSCs)增殖、分化、干性(stemness)和旁分泌功能的作用。方法采用标准培养基体外培养人骨髓间充质干细胞,并将其分为对照组和PTH干预组,用细胞计数测试和BrdU增殖检测细胞增殖变化。用碱性磷酸酶染色、油红染色、阿利新蓝染色检测细胞分化情况。用Real-time PCR检测hMSCs OCT-4、Nanog、SOX-2、CCND1、C-MYC等基因表达情况。用ELISA方法检测hMSCs培养上清液基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白2(BMP2)和Angiopoietin1蛋白水平。结果使用10-8mol/L~10-9mol/L的PTH干预6 d可明显促进hMSCs增殖(P0.05),PTH 10-8mol/L促进成骨、软骨分化,抑制脂肪分化。PTH 10-8mol/L可明显诱导CCND1和C-MYC基因表达(均P0.01),抑制OCT-4表达(P0.01),抑制Nanog和SOX-2等表达(均P0.05)),升高培养液中SDF-1、IGF-1、VEGF、BMP2和血管生成素1(Angiopoietin 1)蛋白水平(均P0.05)。结论 PTH能促进hMSCs增殖,调节其分化,但不能维持hMSCs的干性。调节hMSCs的旁分泌功能对局部微环境合成代谢、细胞迁移和血管发生产生影响。     

人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的L型钙通道研究

目的：观察人骨髓间充质干细胞（hMSCs）诱导分化为心肌样细胞的电生理特征,L型钙离子通道的电流强度。方法：体外分离培养hMscs,以5－氮胞苷诱导分化为心肌样细胞。分别以体外分离培养的原代搏动的SD乳鼠心肌细胞（CMs）和同代次的hMSCs为阳性对照和阴性对照,利用膜片钳技术观察诱导分化为心肌样细胞的电生理特征L型钙离子通道的电流强度。结果：在20个心肌样细胞中,有6个细胞可记录到对硝苯地平敏感的内向钙电流,其最大内向峰值电流（ICa-Peak）在0mV为（112．60±8．26）pA;而hMSCs和乳鼠的CMs的ICa-Peak分别为（96．67±13．50）pA和（263．86±39．01）pA（n=6）,将诱导的心肌样细胞与未经诱导的hMSCs的ICa-Peak进行比较,P〈0．05具有统计学意义。结论：hMSCs经5-氮胞苷诱导后,其L型钙离子通道的钙电流增加,在电生理特性上具有向CMs分化的潜能。     

二种不同的诱导方法诱导人骨髓间充质干细胞分化的心肌样细胞L型钙电流的变化

目的利用膜片钳技术检测体外两种不同诱导方法诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs)分化为心肌样细胞的L型钙电流(ICa-L)。方法体外培养扩增hMSCs,采用①5-氮胞苷(5-Aza,10μmol/L)化学诱导4周;②原代分离培养SD乳鼠搏动心肌细胞(CMs)制备的心肌微环境诱导10天直至CMs停止搏动。利用膜片钳技术检测两种不同方法诱导分化的心肌样细胞、hMSCs及原代CMs的ICa-L。结果 5-Aza与心肌微环境诱导分化的心肌样细胞较hMSCs的ICa-L增强(112.60±8.26,120.50±9.35pAvs96.67±13.50pA,P均<0.05);低于CMs组(263.86±39.01pA,P<0.01)。结论两种诱导方法诱导的心肌样细胞ICa-L均增强。     

PI3K／Akt信号通路在骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化调控中的作用

目的：研究PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002对骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）增殖及分化的影响。方法采用贴壁法体外分离人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,加入PI3K抑制剂LY294002（1、10μmol/L）,应用MTT法测定细胞增殖,常规成骨诱导分化培养3或7d,采用碱性磷酸酶（ALP）染色观察成骨分化水平,化学比色法测定ALP活性,茜素红染色后观察矿化钙结节数量并定量分析,Westernblot检测磷酸化Akt蛋白表达,应用Realtime-PCR检测各组细胞BMP2、Runx2、OPN及Osterix等成骨分化标记物的基因表达水平。结果从24至72h,LY294002对hMSCs增殖均产生显著抑制,随时间推延,可见抑制增殖效果增强（P＜0.05）。ALP染色和定量测定提示10μmol/L的ALP活性最强,在不同时间显著高于对照组和1μmol/L组（P＜0.05）。成骨诱导培养3和7d,1、10μmol/L组矿化量都显著高于对照组（P＜0.05）。10μmol/L组矿化量在成骨诱导7d也显著高于1μmol/L组（P＜0.05）。Westernblot检测结果证实成骨诱导可激活Akt磷酸化蛋白表达,但LY294002可抑制该蛋白磷酸化。成骨诱导分化7d,1、10μmol/L均明显促进BMP2、Runx2、OPN、Osterix4种基因mRNA表达（均P＜0.05）。结论PI3K/Akt信号通路参与hMSCs增殖和分化过程。成骨分化伴随下游Akt蛋白表达。PI3K抑制剂可抑制hMSCs增殖,但同时促进其向成骨分化和矿化。     

人EFTUD2基因靶向小分子化合物筛选细胞模型的建立

目的 体外建立一个以荧光素酶为报告基因,靶向人EFTUD2基因的化合物筛选细胞模型.方法 应用限制性内切酶双酶切LV6载体,将人EFTUD2pro-0.5kb启动子和荧光素酶报告基因的融合片段重组入LV6慢病毒载体.以重组慢病毒感染HepG2细胞,采用嘌呤霉素筛选和有限稀释法获得Epro-LUC-HepG2细胞株.利用...     

MMP-2, MT1-MMP, and TIMP-2 are essential for the invasive capacity of human mesenchymal stem cells: differential regulation by inflammatory cytokines

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) represent promising tools in various clinical applications, including the regeneration of injured tissues by endogenous or transplanted hMSCs. The molecular mechanisms, however, that control hMSC mobilization and homing which require invasion through extracellular matrix (ECM) barriers are almost unknown. We have analyzed bone marrow-derivedhMSCs and detected strong expression and synthesis of matrix metalloproteinase 2 (MMP-2), membrane type 1 MMP (MT1-MMP), tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1), and TIMP-2. The ability of hMSCs to traverse reconstituted human basement membranes was effectively blocked in the presence of synthetic MMP inhibitors. Detailed studies by RNA interference revealed that gene knock-down of MMP-2, MT1-MMP, or TIMP-2 substantially impaired hMSC invasion, whereas silencing of TIMP-1 enhanced cell migration, indicating opposing roles of both TIMPs in this process. Moreover, the inflammatory cytokines TGF-beta1, IL-1beta, and TNF-alpha up-regulated MMP-2, MT1-MMP, and/or MMP-9 production in these cells, resulting in a strong stimulation of chemotactic migration through ECM, whereas the chemokine SDF-1alpha exhibited minor effects on MMP/TIMP expression and cell invasion. Thus, induction of specific MMP activity in hMSCs by inflammatory cytokines promotes directed cell migration across reconstituted basement membranes in vitro providing a potential mechanism in hMSC recruitment and extravasation into injured tissues in vivo.     

NRF-1基因真核慢病毒表达载体的构建及表达

目的构建核呼吸因子-1（NRF-1）基因慢病毒表达载体并包装成重组慢病毒颗粒,感染大鼠心肌细胞H9c2（2-1）后,筛选出稳定上调表达NRF-1的大鼠心肌细胞H9c2（2-1）。方法：利用lipofectAMINE 2000试剂将pLenti6．3-NRF-1．IRES2-EGFP质粒与两种包装质粒在293T细胞中包装成重组慢病毒,收集病毒并测定滴度。用重组慢病毒感染大鼠心肌细胞H9c2（2-1）,然后用杀稻瘟素（blasticidin）筛选转染阳性细胞。用PCR法鉴定靶细胞基因组中NRF-1基因序列,用QPCR测定转染阳性靶细胞中NRF-1基因表达量。结果：收集的重组慢病毒滴度为5．5×10^7TU／ml。转染阳性靶细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光。PCR结果显示,慢病毒携带NRF-1基因序列已插入靶细胞基因组。QPCR结果显示,转染阳性靶细胞中NRF-1基因的表达量是对照组的2．25倍。结论：本研究成功地构建NRF-1基因重组慢病毒表达载体,并在大鼠心肌细胞H9c2（2-1）中表达,为进一步上调NRF-1基因表达后心肌细胞能量代谢的研究提供了实验支持,并为心力衰竭能量代谢的基因治疗奠定了基础。