HPV16型E7抗原B细胞表位的预测与鉴定

目的分析人乳头瘤病毒16型(HPV16)早期蛋白E7的B细胞优势表位,并对其进行免疫原性鉴定。方法采用亲水性方案、柔韧性方案、抗原指数方案及表面可能性方案综合评估其B细胞优势表位,并运用固相合成法合成多肽,经RP-HPLC纯化及纯度分析,用质谱进行定性鉴定。以合成肽免疫Balb/c小鼠,进行免疫效果评价。结果综合分析考虑HPV16 E714-21(P1),HPV16 E726-37(P2),HPV16 E744-51(P3)可能是B细胞优势表位,免疫小鼠后可明显诱导小鼠血清抗体滴度升高,但只有P1和P2产生的抗体与人宫颈癌组织上清液结合呈阳性反应。结论HPV16 E714-21和HPV16 E726-37具有较强的免疫原性,可能成为HPV感染肽疫苗的候选表位。     

人乳头瘤病毒16型E7抗原细胞毒性T细胞预测表位的分子模拟研究

对人乳头瘤病毒（HPV）16型E7抗原的预测表位从理论上分析其与HLA－A2分子结合的情况，推测成为HLA－A2限制性表位的可能性。通过计算机分子模拟，确立各表位及其与HLA－A2分子结合形成复合物的模拟结构。结果发现，各表位的三维结构符合HLA－A2限制性细胞毒性T细胞（CTL）表位的结构要求，能较好地与HLA－A2分子结合。根据分子模拟提供的理论支持，各预测表位符合要求，提示可在后续实验中进行表位合成、筛选、鉴定和多肽疫苗的研制。     

HPV16型E7抗原表位的研究进展

人乳头瘤病毒(HPV)常见型别中,良性型HPV6、11型和恶性型HPV16、18型等感染可以导致尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤和宫颈癌等疾病^[1,2]。HPV16基因组中E7基因主要与细胞转化功能及致癌有关,由于HPV感染局部抗原呈递障碍^[3,4]、HPV抗原对局部免疫反应的负性调节^[5,6]和细胞毒性T淋巴细胞(cyto-toxic Tlymphocyte,CTL)难与HPV感染的角质形成细胞相互作用^[7]等原因,从感染早期到肿瘤形成期均可持续检测到E7蛋白的表达。该蛋白作为一种理想的免疫治疗靶抗原在研究中倍受重视。筛选和鉴定E7抗原CTL表位并进行特异性免疫治疗具有重要的临床应用价值。     

人乳头瘤病毒16 E7抗原细胞毒性T细胞预测表位合成肽的纯化与鉴定

人乳头瘤病毒(HPV)16基因组中E7基因主要与细胞转化功能及致癌有关,从感染早期到肿瘤形成期均可持续检测到E7蛋白的表达。本研究选用已预测出的HLA-A2限制性CTL表位^[1],采用固相合成法合成多肽,产物经反相高效液相(RP-HPLC)纯化、分析和质谱分析鉴定,所获取的高纯度肽为预测表位抗原性的检测奠定了基础。     

穿膜肽对HPV16E7细胞毒性T细胞表位MHC-Ⅰ类抗原提呈影响的初步研究

目的研究穿膜肽（Tat49-57）对HPV16E7 MHC—Ⅰ类限制性细胞毒性T细胞（CTL）表位（E749-57）在抗原提呈细胞内经MHC—Ⅰ类途径被提呈的动力学影响。方法应用多肽固相合成技术，分别合成含穿膜肽与HPV（人乳头瘤病毒）16E7惟一HLA-AJH2-K^b＋限制性CTL表位E749-57的融合多肽，同时合成该表位N端自然延伸的抗原肽和无关对照肽。采用流式细胞仪（FACS）分析技术，检测抗原提呈细胞（APC）在不同时相点对上述各抗原肽进行MHC—Ⅰ类提呈的情况。结果在与APC孵育早期，Tat—E749-57在短时间内即被APC快速提呈并进人MHC—Ⅰ类抗原提呈途径，提呈的效率略低于E749-57（P〉0．05）；在孵育的后期，与Tat—E749-57组孵育的APC细胞表面，E749-57／K^b复合物存在时间较其他组明显延长（P〈0．05）。结论在外源性抗原肽中引人穿膜肽可明显促进其MHC—Ⅰ类限制性CTL表位的提呈效率，从而有效增强外源性抗原肽的免疫原性。     

穿膜肽对HPV16E7细胞毒性T细胞表位MHC-I类抗原提呈影响的初步研究

目的 研究穿膜肽（Tat49-57）对HPV16E7 MHC-Ⅰ类限制性细胞毒性T细胞（CTL）表位（E749-57）在抗原提呈细胞内经MHC-Ⅰ类途径被提呈的动力学影响。方法 应用多肽固相合成技术，分别合成含穿膜肽与HPV（人乳头瘤病毒）16E7惟一HLA-A2/H2-Kb+限制性CTL表位E749-57的融合多肽，同时合成该表位N端自然延伸的抗原肽和无关对照肽。采用流式细胞仪（FACS）分析技术，检测抗原提呈细胞（APC）在不同时相点对上述各抗原肽进行MHC-Ⅰ类提呈的情况。结果 在与APC孵育早期，Tat-E749-57在短时间内即被APC快速提呈并进入MHC-Ⅰ类抗原提呈途径，提呈的效率略低于E749-57（P > 0.05）；在孵育的后期，与Tat-E749-57组孵育的APC细胞表面，E749-57/Kb复合物存在时间较其他组明显延长（P < 0.05）。结论 在外源性抗原肽中引入穿膜肽可明显促进其MHC-Ⅰ类限制性CTL表位的提呈效率，从而有效增强外源性抗原肽的免疫原性。     

人乳头瘤病毒16E749-57的分子修饰与鉴定

目的 对人乳头瘤病毒(HPV)16型E7抗原的人白细胞抗原A2分子限制性细胞毒性T细胞表位HPV16E7_49-57进行氨基酸置换修饰,并鉴定修饰表位。方法 运用量化模体方案对置换后的多肽与人白细胞抗原A2分子的结合系数进行比较,以分子模拟方法确定合成序列,采用标准Fmoc方案进行合成与纯化多肽以及乳酸脱氢酶释放法检测特异性细胞毒性T细胞诱导活性。结果 修饰多肽符合人白细胞抗原A2分子限制性细胞毒性T细胞的表位要求,9肽RLHYNIVTF具有特异性细胞毒性T细胞诱导活性。结论 修饰表位(氨基酸序列RLHYNIVTF)具有更好的结合力和较强的抗原性,可以代替原有序列E7_49-57(氨基酸序列RAHYNIVTF)作为人乳头瘤病毒感染治疗性肽疫苗分子设计的候选表位。     

人乳头瘤病毒16 E7限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的穿膜肽疫苗设计及体外免疫学研究

目的：利用穿膜肽人免疫缺陷病毒（HIV）-Tat49-57的穿膜能力,设计穿膜肽人乳头瘤病毒（HPV）16E7限制性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位（第49～57位氦基酸）的融合肽疫苗,并在体外研究其诱导特异性CTL的应答能力。方法：应用多肽固相合成技术,分别合成含HIVTat49-57和人类白细胞抗原（HLA）-A2．1限制性CTL优势表位HPV16E749-57的18肽,和该CTL表位的9肽,并用一无关肽作对照,在体外用乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性试验分别检测了上述18肽和9肽在HLA—A2阳性健康者外周血单个核细胞（PBMC）中诱导的表位E749-57的特异性CTL活性。结果：经质谱分析,上述多肽成功合成,纯度均在95％以上。与9肽相比,18肽能在体外诱导出明显增强的特异性CTL活性（P〈0．05）。结论：在HPV16E7HLA—A2．1限制性CTL表位（49～57）的N-末端加上HIV—Tat49-57序列,不会影响表位的提呈效率,而且在体外能有效激发针对E749-57特异性的CTL应答,为新型抗肿瘤及细胞内感染的多肽疫苗设计提供了新思路。     

HPV16 CTL表位E749-57以HSP110为分子伴侣的免疫原性研究

目的 探讨以mHSP110为分子伴侣的HPV16 CTL表位E749-57的免疫原性。方法 将mHSP110基因克隆、原核表达和纯化,SDS-PAGE和Western blot鉴定。在热休克状态与E749-57结合形成复合物,高压液相色谱（HPLC）鉴定其结合程度。用mHSP110-E749-57复合物免疫小鼠,IFN-γ胞内染色、MTT法检测小鼠脾细胞中特异CTL。结果 克隆mHSP110片段经DNA序列测定与基因库中其CDS一致,长度为2577 bp;经SDS-PAGE和Western印迹证实mHSP110表达、纯化成功,HPLC分析E749-57能够与mHSP110形成复合物。复合物免疫小鼠的脾淋巴细胞中CD8+IFN-γ+ T细胞的频率、脾淋巴细胞增殖活性明显高于E749-57组、HSP110组和PBS组。复合物免疫小鼠可明显抑制TC-1肿瘤的生长。结论 mHSP110-E749-57复合物能诱导产生特异性CTL并产生抗肿瘤效应。     

尖锐湿疣患者外周血及经体外诱生的HPV16抗原特异性CD8+细胞毒性T细胞检测

目的 研究尖锐湿疣患者外周血HPV16抗原特异性CD8⁺细胞毒性T细胞(CTL)表型变化及正常人T细胞对病毒抗原肽体外刺激的细胞免疫应答反应在尖锐湿疣发病机制中的作用。方法 采用免疫荧光标染重组MHCⅠ类分子-多肽五聚体技术,流式细胞仪定量检测10例尖锐湿疣患者外周血HPV16E7_11-20(HLA-A^*0201/YMLDLQPETF)抗原特异性CTL(Pent⁺CD8⁺)、活化CTL(Pent⁺CD8⁺CD69⁺)及记忆性CTL(Pent⁺D8⁺CD45RO⁺)数量。同时,用HPV16E7_11-20合成多肽、重组人白介素7、白介素2体外刺激13例正常人外周血单一核细胞产生抗原特异性CTL,并对其进行表型分析,以无关肽HBVcore_18-27作为阴性对照。结果 尖锐湿疣患者外周血CD8⁺T细胞中HPV16抗原特异性CTL、活化CTL及记忆性CTL百分数分别为0.76%±0.43%.0.36%±0.20%及0.33%±0.15%,对照组分别为0.24%±0.07%,0.17%±0.05%及0.15%±0.06%。两组比较,P值分别<0.01,<0.05及<0.01。病毒多肽体外刺激T细胞7d后,抗原特异性CTL、活化CTL及记忆性CTL百分数分别为0.75%±0.16%,0.35%±0.15%及0.33%±0.18%,均比非刺激组的0.24%±0.06%,0.16%±0.03%及0.13%±0.04%明显增多,P值均<0.01。结论 HPV感染诱导CD8⁺T细胞克隆性增殖,产生抗原特异性CD8⁺CTL,高效、特异性直接杀伤病毒感染的靶细胞,在抗病毒T细胞免疫应答过程中发挥作用。     

北京地区人乳头瘤病毒16E6E7基因变异和序列分析

目的 了解北京地区人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7结构特点，为研制HPV16疫苗奠定基础。方法 从HPV感染组织中提取DNA，PCR鉴别其型别，从单独HPV16感染的标本中分离HPV16 E6E7基因，克隆入载体pGEM-3ZF，进行双向测序，与德同标准株进行比较。结果 构建了北京地区HPV16E6E7的重组质粒。测序结果表明该基因全长为776bp，与已发表的德同标准株长度相等，3处核苷酸发生变异，同源性99．7％。分别位于第60、96和565nt(相当于HPV16全长序列中第142、178和647nt)，2处位于F6区，1处位于E7，其对应氨基酸分别为第20、32和188个氨基酸，分别由Pro(CCA)、Asp(GAT)和Asn(AAT）变异为Pro(CCG)、Glu(GAG)和Ser(AGT)。结论 北京地区HPV16E6E7基因结构与德国标准株存在差异。     

含人类乳头瘤病毒16E7-L1的嵌合型病毒样颗粒的构建、表达和纯化鉴定

目的 研究人类乳头瘤病毒(HPV)16型的早期基因E7,构建、表达并纯化鉴定了HPV16E7与BPVL1重组的嵌合型病毒样颗粒VLPs.方法HPV16E7基因分3段经PCR扩增后分别克隆入连有BPVL1的质粒PUC形成BPVL1HPV16E7;以质粒PVL1393为载体将BPVL1HPV16E7基因转染杆状病毒并在昆虫细胞中进行表达;用超声粉碎和蔗糖超离、氯化铯梯度离心等方法纯化以及免疫印迹、ECL、透射电镜等方法鉴定表达产物.结果 和结论成功地获得表达BPVL1HPV16E7重组体,形态和结构与野生型HPV几乎一致的嵌合型病毒样颗粒VLPs.将为进一步的HPV16E7的疫苗研究等奠定基础.     

负载人乳头瘤病毒16型E7多肽树突细胞诱导抗原特异性细胞免疫反应

目 的 观 察 负 载 人 乳 头 瘤 病 毒 16 型 (H PV16)E749-57 多 肽 树 突 细 胞 (DC)体 外 诱 导 针 对H PV16 肿 瘤细 胞 的特 异性 细 胞免 疫反 应 。方 法 用粒 细 胞-巨 噬细 胞 集落 刺激 因 子(GM -CSF)及 白 介素 4(IL-4)从 健康 成人 外 周血 单一 核 细胞 诱导 DC 并 负载 H PV 16 E749-57 多肽 ,流 式细 胞 仪检 测 DC 表 面 抗 原;混 合淋 巴 细 胞 反应 观 察 DC 对 同 种 淋 巴 细 胞 增 殖 的 激 发 效 应 ;乳 酸 脱 氢 酶 (LDH )释 放 法 评 价 DC 诱 导 的细胞 毒 性 T 淋 巴 细 胞 (CTL)对 Caski肿 瘤 细 胞体 外 杀 伤 效应 。 结 果 负 载 H PV16 E749-57 多 肽 的 DC 表面表 达 CD 1a(58.4 ±6.7)%、CD 80(70.6 ±3.4)%及 H LA -DR (74.8 ±4.2)%分 子 ;具 有 刺 激 同 种 T 淋 巴 细 胞增 殖的 能 力 ;其 诱 导 的 抗 原 特 异 性 CTL 对 Caski肿 瘤 细 胞 产 生 特 异 性 杀 伤 ,而 对 SiH a、A N3CA 肿 瘤 细 胞无明 显 杀伤 作用 。 结论 负 载 H PV16 E749-57 多 肽的 DC 体 外可 诱导 高 效、特 异 性的 CTL 效应 。     

HPV16E7多肽体外诱生抗原特异性细胞毒性T细胞表型及功能的研究

目的 探讨高致癌性HPV16E7病毒抗原肽体外诱生HLA-A2阳性正常人外周血抗原特异性CD8＋细胞毒性T细胞（CTL）的表型及功能状态。方法 以HPV16E711－20合成多肽、重组人IL-7、IL-2体外刺激26例HLA-A2阳性正常人外周血T细胞,用HLA-A*0201限制性表位肽/ YMLDLQPETT五聚体技术,结合流式细胞仪对抗原特异性CTL进行频率、表型［CD45RA+CD27-效应性CTL、CD45RA-CD27-效应性记忆CTL（TEM）、CD45RA-CD27＋中枢性记忆CTL（TCM）、CD45+CD27+初始性CTL］及功能（穿孔素、颗粒酶B、FasL）分析,并以无关肽HBVcore18－27作为阴性对照。结果 病毒多肽体外刺激T细胞7 d后,抗原特异性CD8＋ CTL数为（0.73 ± 0.33）%,比未刺激组的（0.02 ± 0.03）%明显增多（P < 0.01）。进一步分析,在抗原特异性CTL中,效应性CTL、TEM、TCM及初始性CTL百分比分别为（26.07 ± 13.46）%、（7.97 ± 7.11）%、（33.25 ± 19.68）%及（32.73 ± 13.89）%,均比未刺激组的（0.02 ± 0.03）%、（0.02 ± 0.03）%、（0.02 ± 0.03）%及（0.02 ± 0.05）% 明显增多,P值均 < 0.01。HPV16E711－20表位特异性CTL分泌穿孔素、颗粒酶B、Fas-L的水平分别为（47.01 ± 18.69）%、（80.53 ± 13.32）%及（26.48 ± 7.81）%,均比未刺激组的（0.38 ± 0.55）%、（0.34 ± 0.22）%及（0.16 ± 0.16）%明显增多,P值均 < 0.01。结论 HPV16E711－20多肽诱导CD8＋ T细胞克隆扩增,产生抗原特异性CD8＋ CTL,分泌毒性细胞因子,通过不同机制特异性杀伤病毒感染的靶细胞,在抗病毒免疫应答中发挥作用。     

聚合酶链反应诱导HPV16E7C端基因突变和突变蛋白在真核细胞表达

目的 聚合酶链反应(PCR)诱导人乳头瘤病毒(HPV16)早期基因E7C端锌指结合基序基因突变,评价突变对抗原稳定性的影响。方法 采用PCR技术对HPV16E7第58、91位氨基酸进行突变,构建野生型(pcDNA3.1/16E7)和突变型(pcDNA3.1/16ME7)重组体,对其蛋白表达进行比较。结果 HPV16E7C端第58、91位氨基酸突变后真核细胞表达成功,免疫荧光检测在质粒转染COS-7细胞24h后两种重组体均有阳性细胞出现,但在48h时突变型重组体阳性细胞消失。免疫印迹技术在24h和48h时,突变型重组体均未见阳性条带。结论 HPV16E7C端锌指结构对维持蛋白稳定性起重要作用,突变后蛋白稳定性下降。     

HPV16 E7对A431细胞中Smad7表达的影响

目的研究HPV16 E7对A431表皮鳞癌细胞Smad7表达的影响,并分析其潜在的意义。方法应用基因工程技术转染并筛选出稳定表达HPV16 E7的A431细胞,采用qRT-PCR、Western blotting及激光共聚焦技术,观察并比较转染前后A431细胞中Smad7的表达。结果 A431细胞中Smad7的表达强度随转染HPV16 E7后时间的延长而升高(P0.05)。Smad7蛋白的亚细胞定位,存在胞浆向胞核移位的现象。结论稳定高表达HPV16 E7后的A431细胞中Smad7表达水平升高,并可以影响Smad7的细胞定位。