RNA干扰沉默中期因子基因表达诱导肝癌细胞凋亡

目的:探讨RNA干扰(RNA interference)沉默中期因子(midkine,MK)基因表达对肝癌细胞增殖和凋亡的影响.方法:根据中期因子基因mRNA序列特点,设计合成中期因子基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染肝癌SMMC 7721细胞后,分别以实时定量PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞中期因子表达情况,分别通过检测caspase-3活性和琼脂糖凝胶电泳方法了解肝癌细胞凋亡,以软琼脂集落培养试验检测对各组细胞增殖的影响.结果:中期因子siRNA可有效抑制肝癌细胞中期因子 mRNA和蛋白水平.转染组肝癌细胞caspase-3活性增高,呈浓度和时间依赖性;转染组出现明显的DNA条带.中期因子转染组细胞增殖受到明显抑制,且呈浓度依赖性.结论:采用RNA干扰沉默肝癌细胞中期因子基因表达,可抑制癌细胞增殖和诱导凋亡.     

RNA干扰沉默mTOR基因对肝癌HepG2细胞侵袭和转移的影响

目的：探讨RNA干扰技术对人肝癌HepG2细胞mTOR的表达及细胞侵袭与转移的影响。方法：体外合成mTOR siRNA,并转染HepG2细胞24 h,同时设无义对照组（转染无义对照siRNA）、空白对照组（转染空脂质体）及正常对照组（不转染）。采用western blot法检测各组HepG2细胞的mTOR蛋白表达;应用Transwell小室细胞体外实验检测转染后肝癌HepG2细胞的穿膜细胞数,评价肝癌细胞体外侵袭和转移能力的变化。结果：mTOR siRNA转染组HepG2细胞mTOR蛋白的表达低于各对照组（P〈0.05）;HepG2细胞侵袭和转移力均显著低于各对照组（P〈0.05）。结论：mTOR siRNA可有效抑制HepG2细胞mTOR蛋白的表达,且能抑制HepG2细胞的侵袭和迁移。     

RNA干扰survivin基因对人肝癌HepG2细胞增殖影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制survivin基因表达对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的影响.方法 构建针对人肝癌HepG2细胞 survivin基因3个不同靶序列的 shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-323/387/52,用Lipofectamine 2000脂质体介导转染法转染质粒, 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测survivin 基因mRNA表达水平.选择对survivin基因表达抑制作用最强的shRNA载体转染HepG2细胞后, 免疫细胞化学法(ICC)检测HepG2细胞survivin蛋白的表达情况,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞的增殖情况.结果 与对照组比较,构建的3个shRNA质粒中pshRNA-survivin-387转染组survivin mRNA水平下调,差异有显著性(F=18.64,q=4.293～4.925,P<0.05),而pshRNA-survivin-323/52质粒对survivin的表达及mRNA水平的影响差异无显著性(q=0.631～0.126,P>0.05).转染pshRNA-survivin-387质粒的HepG2细胞survivin蛋白表达较对照组明显下调(F=68.39,q=13.71、14.37,P<0.01),其增殖能力较对照组显著下降(F=20.06～47.65,q=11.186、 12.601,P<0.01).结论 构建的针对人survivin基因387位靶序列的shRNA表达载体pshRNA-survivin-387可显著抑制survivin的表达及HepG2细胞增殖.     

靶向c-myc基因小RNA干扰对胆囊癌细胞侵袭运动的影响

目的 研究c-myc基因在胆囊癌侵袭和转移中的作用及其机制。方法 采用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测亲代和高转移胆囊癌细胞系中c-myc基因表达,设计靶向c-myc的干扰性小RNA(siRNA)转染高转移的胆囊癌细胞,体外Transwell实验研究c-myc siRNA对胆囊癌高转移细胞迁移和侵袭能力的影响。通过蛋白质印迹法检测转染c-myc siRNA后c-myc下游部分信号通路的变化。结果 高转移细胞中c-myc基因表达高于亲代细胞,转染c-myc siRNA后,c-myc的表达在转录和翻译水平均降低。同时GBC-SD/M3细胞的转移和侵袭能力受到抑制。对c-myc下游信号通路的检测发现LIN28的表达下调。结论 c-myc在高转移的胆囊癌细胞中表达上调;通过siRNA下调其表达后可以抑制胆囊癌细胞的转移和侵袭,这种抑制作用可能与LIN28的下调有关。     

RNA干扰沉默CXCR4基因对肝癌细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨RNA干扰质粒靶向沉默CXCR4基因表达,对人肝癌细胞增殖和侵袭作用的影响及其机制。方法检测不同分化程度的肝癌细胞株CXCR4表达程度。将CXCR4干扰质粒转染肝癌细胞HepG2,经G418筛选出稳定抑制细胞,使用Western blotting和Real time RT-PCR验证干扰质粒对CXCR4基因的靶向沉默效率。MTT法和Transwell小室试验检测CXCR4基因沉默后肝癌细胞的增殖能力和侵袭能力。Western blotting检测基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9蛋白表达水平,免疫荧光检测MMP-2在细胞内表达。结果不同分化程度的肝癌细胞均有CXCR4表达,其中HepG2细胞表达最强。通过RNA干扰技术靶向沉默CXCR4基因,可高效、稳定地抑制CXCR4表达。CXCR4基因靶向沉默后明显抑制肝癌细胞增殖和侵袭。Western blotting提示CXCR4基因靶向沉默导致MMP-2蛋白表达明显下调。结论 CXCR4基因沉默可以抑制肝癌细胞增殖和侵袭,可能与其抑制侵袭相关分子MMP-2有关,提示CXCR4可能是肝癌治疗的一个有效靶点。     

RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉默对肺癌细胞定植和转移的影响

目的构建针对人MAGE3基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体,观察RNA干扰介导的MAGE3基因表达默寂对肺癌细胞定植和转移的影响.方法设计MAGE3靶向的发夹状siRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPERneoGFP载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人肺癌细胞NCI-H446,采用RT-PCR和Western印迹检测MAGE3基因mRNA和蛋白表达水平的变化.用软琼脂克隆形成实验和细胞体外侵袭实验,观察对肿瘤形成能力和侵袭力的影响.结果把针对MAGE3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pSUPERneoGFP载体,经过酶切鉴定与测序,结果正确;RT-PCR和Western印迹检测显示, MAGE3基因的表达水平明显降低;转染siRNA表达载体组的肺癌细胞在软琼脂中形成克隆数和穿透Matrigel的细胞数都显著下降,与未转染和转染空载体组比较差异有显著性（P﹤0.05）.结论成功构建了针对MAGE3基因的siRNA载体, RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉寂可有效降低肺癌细胞定植和转移.     

RNA干扰Stat3基因对EC-1细胞侵袭转移和增殖能力的影响

目的：构建针对信号转导子和转录激活子3（Stat3）基因的siRNA表达载体,研究Stat3基因沉默对人食管鳞癌EC-1细胞侵袭转移及增殖的影响.方法：构建pSUPER-EG-FP-Stat3siRNA表达载体,转染EC-1细胞,RT-PCR,Western Blot检测Stat3的表达;Boyden-chamber体外侵袭实验检测siRNA对细胞侵袭转移能力的影响,MTT法检测siRNA对细胞增殖能力的作用.结果：酶切和测序证实pSUPER-EGFP-Stat3siRNA表达载体构建成功;RT-PCR,Western Blot结果表明,siRNA能有效地降解EC-1细胞中Stat3基因的mRNA,下调Stat3蛋白的表达;转染siRNA后,与对照组相比,EC-1细胞侵袭转移和增殖能力明显下降.结论：成功构建针对Stat3基因的siRNA表达载体,可有效沉默Stat3基因在食管鳞癌EC-1细胞中的表达,抑制EC-1细胞的侵袭转移及增殖能力,可为食管癌的基因治疗提供理论依据.     

RNA干扰下调hTERT表达对宫颈癌细胞增殖及侵袭能力的影响

目的观察RNA干扰下调人类端粒酶反转录酶（h TERT）表达对宫颈癌He La细胞增殖及侵袭能力的影响。方法针对h TERT基因设计两对siRNA片段,瞬时转染人宫颈癌He La细胞;采用RT-PCR、Western印迹法检测转染后He La细胞h TERT在mRNA水平和蛋白水平的表达变化;PCR-TRAP法检测细胞端粒酶活性;四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖能力变化;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡;transwell实验检测细胞运动侵袭能力。结果 RT-PCR及Western印迹法结果显示,h TERT-siRNA能有效下调h TERT在mRNA和蛋白水平的表达,抑制效率分别为（85.8±3.26）%、（97.5±3.72）%;RNA干扰下调h TERT基因表达后,He La细胞端粒酶活性抑制效率为75.5%,增殖受到明显抑制（P〈0.05）;流式细胞仪检测结果显示,处于G0/G1期细胞增多,由（58.18±3.76）%上升到（68.97±4.01）%（P〈0.05）;未处理组细胞凋亡（4.14±0.79）%,h TERT-si-RNA组细胞凋亡（8.1±1.22）%,细胞凋亡率增加（P〈0.05）。transwell实验检测结果显示,细胞运动侵袭能力下降约30%（P〈0.05）。结论 h TERT-siRNA可有效下调h TERT在人宫颈癌He La细胞中的表达,抑制He La细胞生长并降低其侵袭能力。     

特异性小干扰RNA沉默Annexin Ⅱ基因表达对人乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭迁移力的影响

目的:探讨RNA干扰技术沉默Annexin Ⅱ基因表达对人乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭迁移力的影响.方法:体外化学合成AnnexinⅡ基因序列特异性双链小干扰RNA(Annexin Ⅱ-siRNA),转染高转移人乳腺癌细胞株MDA-MB-231,用荧光显微镜观察转染效率,逆转录-聚合酶链反应和蛋白印迹检测Armexin Ⅱ mRNA和蛋白表达水平;通过生长曲线和体外侵袭迁移实验,观察乳腺癌细胞恶性生物学行为的改变.结果:Annexin Ⅱ-siRNA能有效抑制Annexin Ⅱ mRNA和蛋白表达(P<0.05);经siRNA处理的细胞,细胞生长速度明显降低(P<0.05),侵袭迁移力显著下降(P相似文献   

RNA干扰Slug基因表达抑制胰腺癌侵袭转移的实验研究

目的探讨RNA干扰Slug基因表达对胰腺癌转移的抑制作用。方法用脂质体转染法将表达siRNA-Slug的真核表达载体pGenesil-1-Slug-siRNA(pSlug-siRNA)和空载体pGenesil-1-Neg-siRNA(pNeg-siRNA)导入PANC-1细胞,G418筛选阳性细胞,获得稳定转染的阳性克隆。观察siRNA-Slug对Slug表达的沉默及对胰腺癌细胞体外侵袭转移的抑制作用,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测不同处理组细胞中Slug mRNA的表达水平,Western-blot测定蛋白表达水平。建立不同组裸鼠原位胰腺癌模型,观察Slug沉默对裸鼠原位胰腺癌转移的抑制作用。结果pSlug-siRNA组细胞内Slug mRNA及Slug蛋白的表达被有效沉默。重组细胞基底膜(Matrigel)侵袭实验显示,pSlug-siRNA组、空白对照组、pNeg-siRNA组穿透基底膜细胞数分别为(35±10)、(228±71)、(219±72)个/高倍镜(×200),pSlug-siRNA组明显低于空白对照组和pNeg-siRNA组,差异分别有统计学意义(P<0.05)。裸鼠体...     

基质金属蛋白酶-2与肝细胞癌侵袭转移性的关系

揭示基质金属蛋白酶－２（ＭＭＰ－２）与肝细胞癌（ＨＣＣ）侵袭转移性的关系。并探索以ＭＭＰ－２来判断肝细胞癌侵袭转移性的可能性及方法。方法通过酶谱法和免疫组织化学法对正常肝、ＨＣＣ及其癌旁肝组织中的ＭＭＰ－２表达进行定量和细胞来源的研究，并与ＨＣＣ侵袭转移的病理指标进行统计学分析。结果正常肝、ＨＣＣ及其癌旁肝组织均有ＭＭＰ－２表达；ＨＣＣ组织中ＭＭＰ－２含量升高及其活性形式的出现与ＨＣＣ侵袭转移性有关；ＨＣＣ癌组织ＭＭＰ－２含量高于其癌旁肝组织含量，是通过ＭＭＰ－２判断ＨＣＣ侵袭转移性的重要指标；ＭＭＰ－２阳性细胞可见于正常肝细胞、胆管上皮细胞、Ｉｔｏ细胞、再生肝细胞、新生胆管细胞和ＨＣＣ细胞。结论ＭＭＰ－２与ＨＣＣ侵袭转移有关；ＨＣＣ癌组织ＭＭＰ－２含量是否高于其癌旁肝组织含量可作为通过ＭＭＰ－２判断ＨＣＣ侵袭转移性的指标。     

组织因子促进人类大肠癌细胞的侵袭及与基质金属蛋白酶类的相关性研究

目的:探讨组织因子促进人类大肠癌细胞侵袭的机制,研究其与MMP-2和MMP-9的相关性.方法:获取转染正义/反义TFcDNA的人类大肠癌HT-29细胞系/LoVo细胞系裸鼠皮下种植瘤标本,应用Western blot和RTPCR技术,检测转染组和对照组肿瘤组织中MMP-2和MMP-9的蛋白和mRNA表达水平;同时采用明胶酶谱法检测转染反义LoVo细胞系培养上清中的MMP-2和MMP-9活性的变化.结果:与对照组相比较,转染正义TFcDNA的HT-29细胞系成瘤标本TF表达升高,其所对应的MMP-9和MMP-2蛋白水平和mRNA水平表达也明显升高;转染反义TFcDNA的LoVo细胞系成瘤标本中的TF,MMP-9和MMP-2蛋白和mRNA水平表达明显低于对照组,转染反义TFcDNA的LoVo细胞系培养上清液中的MMP-9和MMP-2活性较对照组低;MMP-9和MMP-2表达与组织因子表达具有相关性.结论:组织因子促进人类大肠癌细胞的侵袭,其部分机制可能与组织因子上调MMP-9和MMP-2的表达有关,组织因子可能是大肠癌细胞分泌MMPs的内在激动剂.     

体外RNA干扰下调ezrin表达对肝癌细胞生长和运动能力的影响

目的探讨膜-细胞骨架联接蛋白ezrin对肝癌生长和运动转移能力的影响。方法选取4株肝癌细胞系(SF/SMMC7721、MHCC97-H、MHCC-1和HepG2)作为研究材料,针对ezrin基因设计小干扰RNA(siRNA)并通过脂质体转染入细胞。分别通过荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)和Western印迹验证siRNA对ezrin在基因和蛋白水平的下调及下调作用随转染时间的变化。根据Western印迹的结果选取ezrin蛋白表达最低的时间点检测干扰后肝癌细胞生物学行为的改变。运用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测肝癌细胞增殖能力的变化;流式细胞仪检测细胞周期;电子显微镜观察细胞伪足的形态和数量改变;transwell实验检测肝癌细胞运动和转移能力的变化。结果荧光实时定量PCR和Western印迹显示ezrin siRNA对ezrin在基因和蛋白水平均有显著的下调作用。下调ezrin蛋白可显著减慢4株肝癌细胞的生长速度,处于分裂期的肝癌细胞比例明显下降(SF/SMMC7721:28·07%下降到21·53%;MHCC97-H:24·94%下降到13·92%;MHCC-1:19·30%下降到13·2%;HepG2:7·73%下降到4·24%)。肿瘤细胞的运动侵袭能力下降,细胞伪足变短,且伪足的形成数量显著减少(SF/SMMC7721:20·8个/细胞±3·0个/细胞与13·2个/细胞±2·4个/细胞,P<0·05;MHCC97-H:18·4个/细胞±2·7个/细胞与14·0个/细胞±2·9个/细胞,P<0·01;MHCC-1:22·6个/细胞±3·5个/细胞与13·3个/细胞±1·9个/细胞,P<0·01;HepG2:31·0个/细胞±2·9个/细胞与17·8个/细胞±2·3个/细胞,P<0·01;每株计数5个细胞)。穿过人工基底膜的细胞数量也明显减少(SF/SMMC7721:49·9个±7·7个与31·9±5·2个,P<0·05;MHCC97-H:58·5个±4·2个与33·0个±3·3个,P<0·01;MHCC-1:57·6个±6·1个与28·3个±3·4个,P<0·01;HepG2:37·3个±3·0个与25·3个±2·3个,P<0·01;每株8个视野)。结论ezrin在肝癌生长和侵袭转移过程中发挥重要的作用,有可能成为抑制肝癌复发转移的关键分子。     

靶向封闭CapG基因对胰腺癌细胞运动侵袭能力的影响

目的观察靶向封闭CapG基因对胰腺癌细胞株BxPC3运动侵袭能力的影响。方法设计并体外合成靶向CapG的小干扰RNA,将其转染到BxPC3细胞中,蛋白质印迹法检测转染前后细胞中CapG蛋白的表达,采用Transwell小室检测转染前后细胞运动侵袭能力的改变。结果CapGsiRNA能有效降低BxPC3细胞中CapG的表达,CapG在蛋白质水平的表达抑制率达80％左右。抑制BxPC3细胞中CapG的表达后,BxPC3细胞的运动侵袭能力明显下降,穿过人工基底膜的细胞数显著低于阴性对照组和空白对照组（P〈0．05）。结论封闭CapG表达能明显抑制胰腺癌细胞BxPC3在体外的运动侵袭能力。     

裸鼠人肝癌原位移植转移模型的生长特性及转移潜能

为了研究癌转移的机理和筛选抗转移治疗因子，用原位移植方法建立了裸鼠人肝癌高转移模型ＬＣＩ－Ｄ２０。对该模型的体内生长与转移规律、缩主血清甲胎蛋白（ＡＦＰ）水平，不同植入环境对转移能力的影响进行了观察，并检测了其细胞形态学、染色体核型和ＤＮＡ含理。结果表明：由原位移植方法建立的裸鼠人肝癌转移模型，能在人体外模拟人肝癌转移的自然过程，是一株可供研究人肝癌转移问题的较为理想的模型。     

HER4基因抑制对食管癌细胞Eca-109迁移和侵袭能力的影响

 目的 探讨HER4在食管癌细胞侵袭和转移过程中的作用。方法 应用RNA干扰技术抑制HER4在食管癌细胞系Eca-109中的表达,Western blot 方法观察细胞MMP-9、VEGF蛋白表达水平的变化,细胞划痕实验和Transwell侵袭实验观察细胞迁移、侵袭能力的变化。结果 酶切鉴定和DNA测序分析显示HER4靶向RNA干扰重组载体构建成功;荧光实时定量PCR和Western Blot检测筛选得到最佳干扰效果质粒;该质粒转染细胞后,MMP-9、VEGF蛋白表达水平出现明显降低,细胞迁移、侵袭能力显著下降。结论 HER4与食管癌的侵袭转移潜能相关,敲减HER4的表达可明显抑制食管癌细胞系Eca-109的运动和侵袭能力。     

survivin基因在人原发性肝癌组织中的表达及其意义

目的： 探讨survivin基因在人原发性肝癌发生发展中的作用及可能的机制。方法：应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测15例原发性肝癌患者的肝癌组织、癌旁组织及肝正常组survivin基因及相关基因c-myc、p53、STAT3和VEGF的mRNA表达水平，应用Western blotting法及免疫组织化学染色法检测上述组织中survivin基因的蛋白表达水平及其定位。结果： 肝癌组织及癌旁组织中survivin基因mRNA的表达量均显著高于正常肝组织（P<0.01）, 肝癌组织中survivin基因mRNA的表达量明显高于癌旁组织（P<0.01），肝癌及癌旁组织中c-myc、 STAT3、VEGF基因mRNA的表达量均显著高于正常肝组织（P<0.01），而p53基因mRNA的表达量显著低于正常肝组织（P<0.01）。肝癌组织及癌旁组织中survivin基因的蛋白表达水平均显著高于正常肝组织（P<0.01），且肝癌组织中survivin基因的表达水平显著高于癌旁组织（P<0.01）。结论:survivin基因的异常表达在肝癌的发生发展中起促进作用，可作为治疗的理想靶点。     

人肝癌组织裸鼠腹腔内和肝正位移植显示的肿瘤侵袭与转移

目的；研究裸鼠人肝癌局部侵袭的转移。方法：应用裸鼠人肝癌组织（ＳＭＭＣ－ＬＴＮＭ）建成腹腔与肝正位移植瘤模型，通过光镜、电镜及图像分析等方法进行病理研究。     

沉默CRAF基因表达对肝癌细胞侵袭和迁移的影响

目的：探讨肝癌细胞中原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（CRAF）高表达对肝细胞癌（HCC）侵袭和转移的影响,并阐明其机制。方法：以CRAF高表达的SMMC-7721细胞作为研究对象,采用shRNA技术下调CRAF表达。将SMMC7721细胞分为对照组和沉默组（shCRAF#1转染组和shCRAF#2转染组）。细胞划痕法观察各组SMMC7721细胞创口愈合指数,Transwell实验检测各组SMMC-7721细胞的穿膜细胞数,Western blotting法检测各组SMMC7721细胞中基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达水平。结果：细胞划痕实验,与对照组比较,沉默组SMMC7721细胞的创口愈合指数明显降低（P<0.05）。Transwell实验,与对照组比较,沉默组SMMC7721细胞的穿膜细胞数降低（P<0.05）。Western blotting法检测,沉默组细胞中MMP-2和MMP-9表达水平明显低于对照组（P<0.05）。结论：下调CRAF可以通过抑制MMP-2和MMP-9表达抑制肝癌SMMC7721细胞的侵袭和迁移。