视网膜神经节细胞无血清上清培养液诱导大鼠视网膜干细胞的分化

目的　探讨视网膜神经节细胞无血清上清培养液对视网膜干细胞分化的影响。方法　分离大鼠视网膜干细胞和视网膜神经节细胞;采用免疫荧光法鉴定体外培养的大鼠视网膜干细胞与视网膜神经节细胞,视网膜干细胞以Nestin抗体进行鉴定,视网膜神经节细胞以Thy-1抗体进行鉴定;以视网膜神经节细胞无血清上清培养液培养视网膜干细胞,以不加入条件培养液培养的视网膜干细胞为对照组,收集分化细胞,采用qPCR法检测Nestin、Pax6、Thy-1及Brn-3的基因表达。结果　培养的视网膜干细胞Nestin抗体染色阳性,视网膜神经节细胞Thy-1抗体染色阳性。培养视网膜干细胞72 h后,与对照组相比,无血清上清培养液组细胞Nestin和PAX6基因相对表达量降低,差异均有统计学意义（均为P<0.000 1）;Thy-1和Brn-3基因相对表达量升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　视网膜神经节细胞无血清上清培养液能够诱导视网膜干细胞分化为视网膜神经节样细胞。     

大鼠视网膜神经细胞体外培养

目的 建立视网膜神经层分散细胞的培养方法，以进一步对视网膜神经元细胞(尤其是视网膜神经节细胞)和神经胶质细胞进行体外实验研究。方法 取出生后1～3d的SD乳鼠的视网膜，用胰酶消化法制备分散细胞悬液后，接种于置有包被poly-D-lysine玻片的24孔培养板中培养，倒置相差显微镜观察细胞生长规律。培养第7d，用抗神经元特异性核(NeuN)抗体和抗神经丝(Neurofilament-200，NF-200)抗体分别标记视网膜神经元细胞和神经节细胞(RGCs)，并计算每10个高倍镜下的细胞数以及RGCs所占百分数。结果 体外培养的视网膜神经元细胞经历了贴壁、重聚、迁移和相互接触的过程，有突起样生长，其中RGCs占神经元的55％左右。结论 视网膜神经层分散细胞体外培养成功，并有较好的RGCs生长率，为进一步进行视网膜疾病的研究创造了条件。     

Staurosporine诱导RGC-5细胞分化作用的研究

目的 观察Staurosporine是否可以诱导视网膜神经节细胞-5(RGC-5)的分化.方法 正常培养RGC-5细胞,应用500 nmol/L Staurosporine诱导RGC-5细胞分化,并在诱导后不同时间段连续观察细胞形态的变化.应用免疫荧光检测视网膜神经节细胞(RGCs)阳性标志因子Thy-1和Brn-3的表达,应用Western Blot、RT-PCR分别定量检测诱导分化后RGC-5细胞中的Thy-1和Brn-3蛋白表达及mRNA的转录情况.结果 应用500 nmol/L Staurosporine诱导后的RGC-5形态上表现出增生停止,胞体周围纤长轴突生长,轴突末端可见类似突触结构.500 nmol/L Staurosporine可以诱导RGC-5细胞中RGCs阳性标志因子Thy-1和Brn-3转录及表达上调.结论 500 nmol/L Staurosporine可以有效地诱导RGC-5细胞向成熟RGCs分化.     

激活的小胶质细胞在大鼠视网膜缺血再灌损伤模型中的作用

目的探讨活化的小胶质细胞在视网膜缺血再灌注损伤过程中的作用。方法前房灌注法建立视网膜缺血再灌注动物模型,在损伤发生后2 h、12 h、24 h、48 h、72 h,采用免疫组织化学染色方法检测特异性抗原标志物CD68的表达,观察活化小胶质细胞的分布、活化程度等,同时观察相应时间点的视网膜超微结构变化。结果对照组中视网膜小胶质细胞主要位于神经节细胞层。缺血再灌注损伤后2 h组视网膜小胶质细胞的分布部位、表达量等基本与对照组相同;缺血再灌注损伤后12 h组视网膜中CD68+细胞表达增多,内丛状层可见阳性细胞。缺血再灌注损伤后24 h组CD68+细胞表达明显增多,部分向视网膜外层迁移。缺血再灌注损伤后48 h组进入视网膜外层的CD68+细胞多数出现于视网膜内丛状层、内核层、外丛状层。缺血再灌注损伤后72 h组活化小胶质细胞数量达到最高水平。视网膜超微结构显示:缺血再灌注损伤后12 h组开始出现损伤表现,视网膜神经节细胞间隙扩大、光感受器细胞外节膜盘疏松变形、可见散在小胶质细胞;缺血再灌注损伤后24 h组病变继续加重,小胶质细胞数量明显增多;缺血再灌注损伤后72 h组病变继续加重,视网膜神经节细胞数量明显减少,细胞核膜肿胀溶解,细胞器溶解,大鼠视网膜神经节细胞层内可见凋亡小体、小胶质细胞,证明了小胶质细胞对光感受器的损伤作用。结论视网膜缺血再灌注损伤出现明显小胶质细胞活化,活化的小胶质细胞在视网膜超微结构的损伤中发挥着重要作用。     

实验动物视网膜神经节细胞的定量研究方法

尼氏染色、逆行标记和免疫标记是目前对视网膜神经节细胞(RGCs)进行定量研究的基本方法。尼氏染色是用碱性染料与神经元细胞内的尼氏体结合,使RGCs染色,并行计数,记数时需要排除非神经元的干扰。逆行标记是将荧光染液注射或贴附到上丘、外侧膝状体或视神经,染液通过神经元细胞轴突内的逆行轴浆运输,向视网膜神经节细胞的胞体内移行,并使其染色。免疫标记是使用特异性的Brn-3b或者Thy-1抗体与视网膜神经节细胞上的抗原结合标记,再行染色和计数。本文综述尼氏染色,逆行标记及免疫标记3种方法对RGCs进行定量计数的研究进展。     

新生SD大鼠视网膜神经节细胞体外原代培养

目的:建立简便易行的新生SD大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)体外原代培养方法。方法:取出生后24h的SD大鼠视网膜,胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,接种于多聚赖氨酸包被的预先置入盖玻片的24孔培养板中培养,倒置相差显微镜观察细胞生长规律,使用Thy-1mAb免疫细胞化学法鉴定RGCs。结果:该方法培养的RGCs体外存活时间可达5d,免疫细胞化学法显示RGCs的纯度约为80%。结论:使用不添加附加成分的普通培养液SD大鼠RGCs体外培养成功,且RGCs较纯化,是一种较理想的细胞培养实验模型。     

体外无血清培养新生SD大鼠视网膜神经细胞

目的 采用无血清培养建立新生SD大鼠视网膜神经细胞的体外培养方法,为视网膜神经细胞的体外实验研究奠定基础.方法 取出生后3～5d的SD大鼠视网膜,用胰蛋白酶消化分离获取细胞悬液,使用无血清神经原培养基(Neurobasal TM-A Medium)和添加剂B-27 Supplement Minus AO进行培养.倒置相差显微镜观察细胞形态及轴突生长情况.培养至第5天,用抗微管相关蛋白2抗体、抗视紫红质蛋白抗体及抗胶质纤维酸性蛋白抗体,行免疫细胞化学鉴定并计算视网膜视杆细胞的纯度.结果 采用无血清法培养的视网膜神经细胞生长良好,细胞伸出突起,部分神经元的突起交织呈网状.生长至第5天经免疫细胞化学证实其中神经元细胞占95.6％,而38.6％为视网膜视杆细胞,同时神经胶质细胞的生长得到了很好地抑制.结论 无血清培养法可以获取纯度较高的视网膜神经细胞,为研究视网膜光感受器细胞提供了理想的体外实验模型.     

无血清神经基质培养基培养纯化的视网膜神经节细胞

目的 建立无血清培养基培养纯化原代视网膜神经节细胞（RGCs）的方法，为研究青光眼等引起的RGCs损伤及防护提供理想的细胞模型。 方法 出生后1～3 d的SD大鼠视网膜细胞悬液，分别经抗大鼠信号调节蛋白（CD172G）单克隆抗体筛除巨噬细胞、抗大鼠Thy-1单克隆抗体筛选RGCs的两步筛选法，得到纯化的RGCs。用加入B27、睫状神经营养因子等的无血清神经元专用神经基质（neurobasal）培养基进行培养，通过细胞形态学观察、Thy-1免疫荧光细胞化学染色、钙黄绿素-乙酰乙酸酯（AM）染色等方法观察原代培养的视网膜神经细胞及纯化培养的RGCs生长并进行鉴定。 结果 原代培养的视网膜细胞中约91%为神经细胞。纯化培养的RGCs接种后24 h有突起长出;第4～8天可见细胞形态均一，细胞体较大，细胞突起较长;至第14天，仍有超过60%的细胞有活性。Thy-1的免疫荧光细胞染色结果显示RGCs纯度约为90%。钙黄绿素-AM染色存活的RGCs，结果显示RGCs细胞体较大，多数细胞有长度大于细胞体直径2倍的突起。 结论 该方法培养的RGCs大小均一、形态理想、纯度高，适宜研究各种因素引起的RGCs损伤及保护剂效果评价。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 200-203)     

青光眼视网膜神经节细胞凋亡的实验研究

目的 研究兔的实验性青光眼视网膜神经节细胞的死亡是否有凋亡参与。方法 前房注入固定的红细胞悬液使免眼压升高,分别在术后７,１４,２１,２８天处死动物,取视网膜组织,ＴＵＮＥＬ标记染色,电镜观察。结果 电镜下可见视网膜神经节细胞死亡特征为典型的凋亡早期特征－核浓染。免疫组ＴＵＮＥＬ法实验组发现神经节细胞凋亡,而正常对照组没有发现。结论 实验性青光眼的视网膜神经节细胞死亡有凋亡参与。这为通过调探凋亡而治疗青光眼的视网膜视神经损伤提供可能。     

兔实验性高眼压视网膜神经节细胞的凋亡

目的 探讨实验性高眼压免眼中是否存在视网膜神经节细胞的凋亡。方法 血细胞注射法诱导青光眼建立大白兔血细胞诱导的高眼压实验动物模型。通过制作视网膜组织超薄切片，透射电镜鉴定视网膜神经节细胞(RGCS)凋亡的存在。制备视网膜细胞悬液，利用流式细胞仪检测高眼压兔眼视网膜神经节细胞凋亡的数量。结果 实验组血细胞注射后眼压有不同程度的升高，透射电镜下可见典型的RGCs凋亡阳性细胞存在，经流式细胞仪检测凋亡率为O.76％，～O．93％。结论血细胞诱导青光眼可得到良好的慢性高眼压实验动物模型，实验性高眼压兔眼中有视网膜神经节细胞的凋亡缔朐稠亡旱免高眼RGCs损伤；流式细胞术     

Neuron stress and loss following rodent anterior ischemic optic neuropathy in double-reporter transgenic mice

PURPOSE: Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is an optic nerve infarct involving axons of retinal ganglion cell (RGC) neurons. The rodent NAION model (rAION) can use transgenic mouse strains to reveal unique characteristics about the effects of sudden optic nerve ischemia on RGCs and their axons. The impact of rAION on RGC stress patterns, RGC loss, and their axons after axonal infarct were evaluated. METHODS: A double-transgenic mouse strain was used, containing a construct with cyan fluorescent protein (CFP) under Thy-1 promoter control, and a construct with beta-galactosidase (lacZ) linked to the stress gene c-fos promoter. Thy-1 in the retina is expressed predominantly in RGCs, enabling stereologic analysis of CFP(+) RGC numbers and loss post-rAION-using confocal microscopy. RGC loss was correlated with axonal counts using transmission electron microscopy (TEM). LacZ immunohistochemistry was used to evaluate retinal cell stress after rAION. RESULTS: The 45,000 CFP(+) cells in the RGC layer of control animals compared with previous RGC quantitative estimates. rAION produced RGC stress, defined as lacZ expression, in patterns corresponding with later RGC loss. rAION-associated RGC loss correlated with regional nerve fiber layer loss. Axonal loss correlates with stereologically determined RGC loss estimates in transgenic mice retinas. CONCLUSIONS: Post-ON infarct RGC stress patterns correlate with regional RGC loss. Cellular lacZ levels in most RGCs are low, suggesting rAION-affected RGCs express c-fos only transiently. CFP(+) cell loss correlates closely with quantitative axonal loss, suggesting that the Thy-1 (CFP) transgenic mouse strain is appropriate for RGC stereologic analyses.     

银杏叶提取物对培养的人眼视网膜神经节细胞的保护作用

目的 探讨银杏叶提取物（EGb761）对培养的人眼视网膜神经节细胞(RGC)的保护作用。方法 对照实验研究。将培养的人眼视网膜细胞分为对照组、谷氨酸组、EGb761组及谷氨酸+EGb761组,用Thy-1作为RGC特异性荧光抗体,以免疫流式细胞技术评价EGb761对人眼RGC的保护作用。多组间细胞存活率比较采用重复测量的方差分析,组间两两比较采用LSD t检验。结果 在不同干预因素作用下,RGC存活率呈现不同变化,对照组为(61.94±7.75)％,谷氨酸组为(44.59 +4.19)％,EGb761组为(75.05 +3.90)％,EGb761+谷氨酸组为(63.19±9.44)％;各组间RGC存活率比较差异有统计学意义(F=13.329,P＜0.01)。各组与对照组RGC存活率两两比较,显示谷氨酸组RGC存活率降低(P =0.010),EGb761组RGC存活率升高(P=0.019),EGb761+谷氨酸组与对照组RGC存活率差异无统计学意义(P =0.801);与谷氨酸组相比EGb761组和EGb761+谷氨酸组RGC存活率明显升高(P=0.000,0.020)。死亡RGC中大RGC所占百分比,EGb761组为(24.63+7.21)％,EGb761+谷氨酸组为(25.99±5.05)％,与对照组(36.69±2.92)％比较,两组死亡RGC中大RGC所占百分比均降低(P=0.001,0.002);与谷氨酸组(40.78±3.34)％相比,两组大RGC死亡百分比亦降低(P =0.000,0.000)。结论 EGb761可对抗谷氨酸兴奋性毒性造成的RGC损伤,对体外培养的人眼RGC具有明显的保护作用。     

银杏叶提取物对幼年大鼠大视网膜神经节细胞保护作用的研究

目的 观察银杏叶提取物（EGb761）对培养幼年大鼠大视网膜神经节细胞（RGC）的保护作用;建立用荧光金逆行上丘标记鉴定体外培养大鼠RGC的方法。方法 12只鼠龄20 d Sprague-Dawley大鼠用荧光金行双侧上丘注射,标记RGC。6 d后摘除眼球,其中一只眼球行视网膜铺片,荧光显微镜下观察标记情况。另一只眼球摘除后分离视网膜,制成细胞悬液,倒置荧光显微镜下观察荧光着染的RGC形态。将细胞悬液分为对照组及浓度分别为0.03%、0.10%、0.30%、1.00%、3.00%的EGb761组,接种后3 h,1、3、5、7 d锥虫蓝染料排斥 法检测RGC的存活情况,同时记录细胞存活率。结果 逆行上丘标记后观察到RGC标记良好,视网膜细胞悬液中大RGC特征明显,离体后迅速死亡,荧光消失。锥虫蓝染料排斥法观察到在视网膜细胞悬液中,这种大RGC死亡迅速。加入不同浓度的EGb761后大RGC存活率明显增加,不同时间点与对照组比较大RGC存活率均有统计学意义（P＜0.01）,且呈明显剂量依赖关系（P＜0.01）。结论 EGb761对体外培养的RGC具有明显的保护作用;荧光金逆行上丘标记鉴定体外培养的RGC方法可行。     

A system for inducible gene expression in retinal ganglion cells

PURPOSE: To develop a system for inducible gene expression in retinal ganglion cells, Thy1 and ckit promoters were used to direct expression of a second-generation reverse tetracycline transactivator (rtTA2S-M2). METHODS: Transgenic mice were generated that harbor rtTA2S-M2 under the control of either the Thy1 or ckit promoter. These animals were crossed with mice transgenic for the LacZ gene downstream of a cassette of tet operator (TRE) binding sites. Induction of the LacZ reporter gene in vivo after either oral or subcutaneous doxycycline administration and in vitro in cultured retinal cells was assessed. To examine induction of a secreted protein, expression of pigment epithelium-derived factor (PEDF) in mice harboring Thy1-rtTA and TRE-PEDF constructs was quantified. RESULTS: Five of seven Thy1-rtTA lines showed induction with subcutaneous doxycycline: maximum induction in one line (Thy1-C), moderate in one line (Thy1-F), and minimal in three lines. There was no detectable retinal LacZ expression in the ckit-rtTA lines, despite expression of the ckit-rtTA transgene at the RNA level. In Thy1-rtTA lines, LacZ reporter expression as measured by X-gal staining was evenly dispersed throughout all quadrants of the retina, present in a subpopulation of retinal ganglion cell (RGC) bodies, RGC axons projecting through the retina and optic nerve, and some cells in the inner nuclear layer. Immunostaining for beta-galactosidase demonstrated more uniform expression in RGCs and cells of the inner aspect of the inner nuclear layer, which, by double staining with anti-beta-galactosidase and anti-calretinin antibodies, were consistent with amacrine cells. More than 95% of Thy-1 antigen-positive cells in the retina expressed the induced transgene. Subcutaneous doxycycline resulted in a more robust induction of LacZ than did oral administration. In vitro, the number of cells induced in culture increased in a dose-dependent manner, with maximum expression at 10 microg/mL at a level 3.4-fold over background. Thy1-rtTA/TRE-PEDF mice treated with doxycycline had 1000-fold induction in their retinal PEDF expression in comparison with nontransgenic mice and 600-fold induction over noninduced Thy1-rtTA/TRE-PEDF mice. CONCLUSIONS: A transgenic system for inducible RGC expression has been developed that demonstrates minimal leakiness and significant induction with doxycycline. This system will be useful for several applications.     

Retinal-cell-conditioned medium prevents TNF-alpha-induced apoptosis of purified ganglion cells

PURPOSE: Retinal ischemic processes occurring in glaucoma or diabetic retinopathy induce the secretion of tumor necrosis factor (TNF)-alpha. This cytokine was reported to be either toxic to or protective of retinal ganglion cells (RGCs). In the present study, its effect on RGCs was analyzed in different culture conditions. METHODS: Adult rat RGCs were prepared in mixed retinal cell cultures and in purified cultures. They were incubated in normoxic or ischemic conditions, in the presence or absence of TNFalpha and/or conditioned media isolated from rat retinal glial cell cultures and from adult mixed retinal cell cultures. RESULTS: In mixed retinal cell culture, RGCs were insensitive to TNF-alpha, whereas it induced their degeneration in purified adult RGC cultures. This TNFalpha-elicited toxicity was suppressed by TNFalpha-R1-neutralizing antibodies or caspase 8/10 inhibitors. Analyses of mRNA and protein content in purified RGCs revealed a time-dependent reduction in the expression of the inhibitor of caspase-8, c-FLIP. c-FLIP mRNA was also undetectable after 5 days of culture in the presence of TNFalpha. The retinal cell-conditioned medium protected the RGCs from TNFalpha-induced death and prevented the decrease in c-FLIP mRNA and protein in purified cultures. This medium promoted NF-kappaB translocation in purified RGCs, whereas an NF-kappaB inhibitor induced RGC death in mixed retinal cells. CONCLUSIONS: The results confirm that TNFalpha can induce RGC death by TNF-R1 activation. They indicate, however, that other retinal cells can release a molecule that promotes NF-kappaB translocation in RGCs, the synthesis of the anti-caspase-8, c-FLIP, and thereby prevents TNFalpha-mediated RGC death.     

Rat retinal ganglion cells in culture.

A stable cell culture system of identified retinal ganglion cells would facilitate the investigation of cellular mechanisms of damage from glaucoma and other disorders. We have developed a reliable technique to culture retinal ganglion cells on a glial cells monolayer which extends viability and promotes extensive neurite outgrowth. Dissociated retinal cells from 5-7-day-old Sprague-Dawley rats were cultured on glial monolayers derived from rat cerebral hemispheres. Retinal ganglion cells were labeled with retrograde fluorescent markers injected into the superior colliculus or in culture with monoclonal antibody to Thy-1 antigen. Since Thy-1 antigen is not entirely specific for retinal ganglion cells, and fluorescent markers fade in older cultures, the identity of Thy-1 marked cells was confirmed with whole-cell electrophysiologic recordings. Labeled, physiologically intact retinal ganglion cells were identified for at least 31 days in culture. Many retinal ganglion cells showed neurite elongation of 2 mm or more and developed complex intercellular networks. This cell culture system may be used to form the basis for future studies of the electrophysiology and transport properties of retinal ganglion cells under normal culture conditions and under adverse conditions such as those that mimic ischemia or mechanical deformation.     

人视网膜祖细胞和脑神经干细胞的体外培养和诱导分化研究

目的比较人视网膜祖细胞和脑神经干细胞的体外分化潜能。方法分离8-12周人胎儿神经视网膜和脑皮质、纹状体神经干细胞,进行无血清体外培养;采用光镜和免疫细胞化学或荧光免疫细胞化学染色方法,分别观察在无血清和10％胎牛血清培养条件下,两种来源的神经干细胞分化后的细胞特性。结果两种来源的神经干细胞,均能在体外有或无血清培养条件下增殖并分化。视网膜祖细胞不但表达视网膜祖细胞标志物Pax-6,也可表达神经干细胞标志物．巢蛋白（Nestin）、成熟神经元标志物-微管相关蛋白2（Map2）、星形胶质细胞标志物-胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、节细胞标志物Thy-1和视杆细胞标志物视紫红质（Rhodopsin）;脑神经干细胞也能表达这些特异性细胞标志物。血清诱导分化时,视网膜祖细胞较难贴壁,贴壁细胞球伸出少而短的突起,单个细胞形态不清;而脑神经干细胞球易贴壁并伸出较长突起交织成网,大量细胞从细胞球中沿突起徙出,单个细胞形态清晰。结论人胎儿视网膜祖细胞和脑神经干细胞体外培养均具有向神经元、胶质细胞及视网膜终末细胞分化的能力;两种干细胞在进行血清诱导分化时,细胞的贴壁、迁移能力及分化后的细胞形态均存在差异。（中华腠科杂志,2006,42：901．907）     

睫状神经营养因子对培养大鼠视网膜神经节细胞的影响

目的 观察不同浓度睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)对培养大鼠视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）生长、存活的影响。 方法 取15只生后2～3d Wistar大鼠视网膜组织进行细胞培养，通过Thy-1单克隆抗体免疫细胞化学对培养的RGC进行鉴定。实验分对照组和10、20、40 ng/mlCNTF组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组），记录RGC存活时间，将培养第3、5、7天的RGC行四甲基偶氮唑盐（methylthio tetrazole,MTT）法测量吸光度(A)值［旧称光密度(OD)］。 结果 Thy-1单克隆抗体免疫组织化学检查显示培养3d的存活细胞90%以上为RGC。细胞存活期间实验组与对照组细胞均无明显突起,细胞体积无明显增大，实验组细胞存活时间比对照组长3~4d。培养第5、7d，Ⅰ组A值分别为0.075 8±0.0139、0.0693±0.0113，Ⅱ组A值分别为0.0902±0.0114、0.0825±0.0125，Ⅲ组A值分别为0.0792±0.0133、0.0653±0.0086，对照组A值分别为0.0620±0.0071、0.0513±0.0068。实验组与同时间对照组A值相比差异有显著性的意义（Ⅱ组与对照组相比P＜0.01，Ⅰ、Ⅲ组与对照组相比P＜0.05）。 结论 一定浓度的CNTF能促进培养大鼠RGC的存活，对RGC形态无影响。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 283-285)     

雪旺细胞源性神经营养活性物质对培养视网膜节细胞正常及缺气损伤环境中存活及生长的作用

目的：探讨雪旺细胞（Schwann cells,SC)源营养神经活性物质（SC derived neurotrophic activity,SCNA)对体外培养视网膜节细胞正常及缺血损伤环境中存活及生长相关蛋白（GAP）43表达的作用。方法：培养乳鼠SC，制备不同蛋白浓度的SCNA，加入原代培养的视网膜细胞中，MTT法检测SCNA活性培养荧光金逆行标记的新生3d的SD乳鼠视网膜细胞，接种于24孔板中。培养第2d时SCNA作用组培养液中加入300mg/L SCNA,对照组不加；培养第5d缺气损伤组在培养液表面加入液体石蜡造成缺气损伤。12h后去除液体石蜡，观察细胞形态和计数荧光金逆行标记的视网膜节细胞（retinal ganglion cell,RGC).Western Blot法分析SCNA对视网膜细胞GAP43表达的影响。结果：SCNA能促进培养视网膜细胞的存活，并有蛋白浓度依赖关系。加SCNA后，视网膜细胞生长明显旺盛，悬浮的死细胞较少，RGC数量明显多于视网膜细胞单纯培养组（F＝62．89，P＜0．01）。缺气损伤组视网膜细胞出现肿胀改变，加有SCNA缺气损伤组细胞形态大致正常，RGC数与对照组相比有显著性差异（F＝49．27，P＜0．01）。GAP43的表达在视网膜细胞正常及缺气损伤SCNA作用组上调。结论：SCNA对培养RGC具有明显营养作用，并上调GAP43的表达。在培养液中加入SCNA，可以减轻“缺气”造成的损伤，提高体外培养RGC在损伤环境中的存活。     

577nm阈下微脉冲激光与577nm激光光凝对兔视网膜组织影响的比较

背景 近年来研究表明,577 nm阈下微脉冲激光治疗视网膜疾病可达到传统577 nm激光光凝的治疗作用且对视网膜组织损伤小,但其具体作用机制和敏感的靶细胞尚未完全阐明. 目的 探讨和比较577 nm阈下微脉冲激光与577 nm激光光凝视网膜后成年中华黑兔视网膜组织形态学变化,为577 nm阈下微脉冲激光光凝在临床上的应用提供依据.方法 采用抽签法按照视网膜光凝条件不同将26只中华黑兔分为正常对照组(2只)、577 nm激光组(6只)和阈下微脉冲激光组(18只),其中阈下微脉冲激光组按照激光工作负载率的不同亚分为9％、12％和15％阈下微脉冲激光组,每组各6只,正常对照组不做任何处理.光凝后行彩色眼底照相及OCT检查,摘取兔眼球壁行苏木精-伊红染色,光学显微镜下观察兔脉络膜和视网膜组织结构的变化.结果 彩色眼底照相和OCT显示正常对照组兔眼视网膜组织结构清晰.9％阈下微脉冲激光组OCT扫描可见视网膜神经上皮层稍模糊;12％阈下微脉冲激光组光凝斑处视网膜神经上皮层轻度水肿,视网膜色素上皮(RPE)层稍模糊;15％阈下微脉冲激光组可见光凝斑处视网膜神经上皮层明显水肿,RPE层局限性隆起;各阈下微脉冲激光组彩色眼底照相均未见光凝斑.577 nm激光组兔眼彩色眼底照相可见灰白色光凝斑,OCT扫描层面可见视网膜呈多灶性隆起,视网膜各层组织结构模糊,伴浆液性神经上皮层脱离.视网膜组织病理学检查可见,与正常对照组兔眼相比,9％和12％阈下微脉冲激光组兔眼脉络膜血管变形或出血,但视细胞形态结构、双极细胞层和视网膜神经节细胞(RGC)层未见明显改变;15％阈下微脉冲激光组视细胞扁平状膜盘肿胀,双极细胞层和RGC层未见明显改变;577 nm激光组兔眼视细胞层、双极细胞层和RGC层结构紊乱,RPE层变薄.结论 577 nm阈下微脉冲激光对脉络膜层和RPE层具有高度选择性,视网膜光凝后对视网膜神经上皮层的损伤程度轻微,既可发挥治疗作用,又不损伤视网膜神经上皮;577 nm激光视网膜光凝可对视网膜全层造成损伤.