甲状腺相关眼病患者眼眶前脂肪细胞分化前后相关基因表达

目的 探讨甲状腺相关眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)患者眼眶前脂肪细胞分化前后相关基因表达的改变,进一步验证脂肪细胞分化在TAO发病中的重要作用.方法 培养TAO患者(14例)眼眶前脂肪细胞,并诱导其向脂肪细胞分化,采用RT-PCR法检测分化前后脂肪细胞分化转录因子前脂肪细胞因子-1(Pref-1)、过氧化物酶体增殖体激活受体γ(PPARγ)、脂肪细胞分泌因子瘦素(Leptin)、脂联素(Adiponectin)以及共同抗原促甲状腺激素受体(TSHR)5个基因mRNA表达的改变.结果 RT-PCR法测的TAO眼眶前脂肪细胞分化后各基因mRNA表达的相对灰度值为Leptin 0.82±0.09、Adiponetic 0.79±0.05、PPARγ 0.62 4±0.05、TSHR 0.86±0.08、Pref-10.70±0.04,其中前4个基因表达明显较分化前增强(P＜0.05),Pref-1则未见统计学差异.结论 TAO患者眼眶前脂肪细胞在一定条件下可向成熟脂肪细胞转化,并伴随着相关基因的改变,在TAO的发生、发展中可能起着重要作用.     

美伐他汀对甲状腺相关眼病眶前脂肪细胞分化及炎症反应的抑制作用

背景脂肪增生和炎症反应是甲状腺相关眼病（TAO）活动期的两大主要病理过程,美伐他汀被证明有抑制前脂肪细胞分化的作用。目的观察美伐他汀对TAO来源眼眶前脂肪细胞分化的作用,及对环氧合酶-2（COX-2）与过氧化物酶体增生物激活受体-γ（PPAR-γ）表达的影响,探讨其对脂多糖（LPS）诱导炎症反应及TAO眼眶前脂肪细胞分化的调控作用。方法从4例TAO患者眼眶减压术中获取眼眶球后脂肪组织,用组织块培养法体外培养TAO眼眶成纤维细胞,为观察美伐他汀对TAO炎症反应过程中COX-2的作用,将培养细胞分为5个组,A组用1000μg／L的LPS,B、C、D组采用1000μg／LLPS分别联合5、10、20μmol／L美伐他汀,E组不加任何干预药物作为对照,均作用8h。观察美伐他汀对眶脂肪细胞分化后的作用,将A组再亚分为A1-A6组,1000μg／LLPS作用8h后,加入诱导液诱导各组细胞向脂肪细胞分化,A,组不加任何干预药物,A2、A3、A4组分别在分化全程中加入5、10、20μmol／L美伐他汀,A5、A6组分别在分化的第4天与第8天加入10μmol／L美伐他汀直至分化结束。采用油红O染色法测定分化后脂肪细胞的相对含量,应用Western blot法和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测成纤维细胞中COX-2和PPAR—v蛋白及其mRNA的表达,用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清液中前列腺素E2（PGE,）的表达。结果B、C、D组眶成纤维细胞中COX-2蛋白及其mRNA的表达和PGE,的分泌水平均较A组明显降低（P〈0．05）。随着美伐他汀浓度的升高,COX-2蛋白及其mRNA的表达和PGE2的分泌水平均逐渐降低,各组间总体差异均有统计学意义（F=228．380、101．745、1586．881,P〈0．05）。E组COX-2蛋白及其mRNA的表达和PGE,的分泌水平较A、B、C组明显减弱,差异均有统计学意义（P〈0．05）,但与D组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。A1、A2、A3、A4组前脂肪细胞分化后吸光度（A492）值逐渐下降,分化后的细胞PPAR-γ蛋白及其mRNA表达均依次下降,组间两两比较差异均有统计学意义（P〈0．05）;A1与A6组间的A492值、PPAR-1蛋白及其mRNA的表达差异均无统计学意义（P〉0．05）;A1、A5、A3组的A492值及PPAR-γ蛋白及其mRNA表达均依次下降,组间比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论美伐他汀以剂量依赖的方式抑制LPS激活的TAO眼眶成纤维细胞中COX-2表达、TAO眼眶前脂肪细胞的分化、PPAR-γ的表达和PGE2的分泌,前脂肪细胞分化的早期抑制作用更强。     

甲状腺相关眼病患者眼眶脂肪组织相关基因的异常表达

目的 探讨甲状腺相关眼病（thyroid-associated ophthalmopathy, TAO）患者眼眶脂肪组织相关基因的表达.方法 选用TAO患者（20例）及正常对照（17例）眼眶脂肪组织,采用RT-PCR法对脂肪细胞分化转录因子前脂肪细胞因子-1（Pref-1）、过氧化物酶体增殖体激活受体γ（PPARγ）,脂肪细胞分泌因子瘦素、脂联素以及共同抗原TSHR等5个基因进行检测.比较TAO及正常人眶脂肪组织基因表达的改变.结果 RT-PCR法测得的TAO患者眼眶脂肪组织中各基因mRNA表达的相对灰度值为：瘦素1.23±0.03、脂联素1.16±0.08、PPARγ 1.03±0.06、 TSHR 0.96±0.04、 Pref-1 0.48±0.07,其中瘦素、脂联素、PPARγ、TSHR mRNA表达明显较正常对照组增强,而Pref-1表达则减弱（P《0.05）.结论 TAO患者眼眶脂肪组织中存在着异常的基因表达,在TAO的发生、发展中可能起着重要作用.     

重组人抵抗素对TAO患者眼眶前脂肪细胞分化的影响

目的探讨重组人抵抗素对甲状腺相关眼病（TAO）患者眼眶前脂肪细胞分化的影响及其在TAO发病中的可能作用。方法10例严重TAO患者眼眶脂肪组织来自眼眶减压术中,正常对照组来自各种原因行眼球摘除术者。培养眼眶前脂肪细胞,并诱导分化,在分化液中分别加入0、10、25、50、100μg／L质量浓度的重组人抵抗素,采用逆转录PCR（RT—PCR）法检测分化过程中过氧化物酶增生体激活受体γ（PPARγ）基因的表达,研究重组人抵抗素对前脂肪细胞分化的作用。结果TAO患者及正常对照组眼眶前脂肪细胞在体外均可被诱导分化成脂肪细胞。分化成熟的脂肪细胞可被油红O染成橘红色。重组人抵抗素对眼眶前脂肪细胞的分化有抑制作用,RT-PCR结果显示PPARγ基因的表达随着抵抗素质量浓度的升高而减弱,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论重组人抵抗素可抑制人眼眶脂肪组织来源前脂肪细胞的分化,脂肪细胞标记性PPARγ基因的表达减弱,有望在TAO治疗方面开创新的研究方向。     

AdPLA基因在Ⅲ级静止期甲状腺相关眼病眼眶脂肪内高表达研究

目的 检测甲状腺相关眼病(thyroid associated ophthalmopathy,TAO)患者和正常人眼眶脂肪组织中脂肪特异性磷脂酶A2(adipose-specific phospholipase A2,AdPLA) mRNA的表达水平.方法 2015年8月至2016年10月16例静止期Ⅲ级TAO患者(TAO组)在深圳市眼科医院接受眼眶减压术,同期29位正常人(正常对照组)行眼部整形手术.术中取患者和正常对照一眼的眼眶脂肪;记录每位受试者的年龄、性别、身高、体质量,计算体质量指数(body mass index,BMI),测量取脂肪一侧眼的眼球突出度和眼眶脂肪体积;用实时定量多聚酶链式反应定量检测眼眶脂肪组织中AdPLA mRNA的表达水平.结果 TAO组与正常对照组年龄、性别和BMI相比差异均无统计学意义(均为P＞0.05),TAO组的眼球突出度(20.406±1.369)mm明显多于正常对照组(14.207±1.146) mm,TAO组的眼眶内脂肪量(32.162 ±1.923) mL明显多于正常对照组(24.279±1.070) mL.TAO组眼眶脂肪中AdPLA mRNA的表达量为0.039 42±0.009 85,正常对照组眼眶脂肪中AdPLA mRNA的表达量为0.004 42±0.001 36,两组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 静止期Ⅲ级TAO患者的眼球突出度和眼眶内脂肪量明显多于正常人,眼眶脂肪组织中AdPLA mRNA的表达量明显高于正常人.AdPLA的高表达可能使TAO眼眶脂肪水解减少,造成眼眶脂肪堆积,加重了眼球突出.     

IL-6对甲状腺相关眼病分化后眼眶脂肪细胞瘦素mRNA表达的影响

目的 探讨白介素-6(interleukin-6,IL-6)对体外培养的甲状腺相关眼病(thyroid associated ophthalmopathy,TAO)分化后眼眶脂肪细胞瘦素mRNA表达的影响.方法 取TAO患者行眼眶减压术的眼眶脂肪组织,体外培养眼眶前脂肪细胞,诱导分化,采用0.5 μg·L-1、5 μg·L-1和50 μg·L-1的IL-6处理分化后的脂肪细胞24 h(设空白对照组),以及5 μg·L-1的IL-6分别处理分化后的脂肪细胞0 h、12 h、24 h、48 h,实时荧光定量PCR检测瘦素mRNA的表达.结果 体外培养的眼眶前脂肪细胞在诱导分化刺激下,分化为脂肪细胞;0.5 μg·L-1、5 μg·L-1和50 μg·L-1的IL-6作用24 h,瘦素mRNA表达分别为1.61±0.53、0.88±0.62、0.21±0.56,随质量浓度的增大而下降,呈量效依赖性,但与对照组(1.84±0.82)相比,差异没有统计学意义(P＞0.05);5 μg·L-1的IL-6作用12 h、24 h、48 h,瘦素mRNA表达分别为1.43±0.46、1.05±0.62、0.20±0.75,随时间的延长而下降,呈时效依赖性,但与0 h组(1.73±0.31)相比,差异没有统计学意义(P＞0.05).结论 IL-6对TAO分化后眼眶脂肪细胞的瘦素mRNA表达有下调作用,但无统计学意义.     

肿瘤坏死因子α对甲状腺相关眼病眼眶成纤维细胞的去分化作用及调控机制

目的探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)对甲状腺相关眼病(TAO)眼眶成纤维细胞(OF)分化的影响及其机制。方法收集2019年12月至2020年8月在天津医科大学眼科医院诊断为TAO且拟行眼眶减压术的患者6例6眼, 术中收集眼眶脂肪结缔组织, 组织块培养法分离培养OF并进行波形蛋白免疫荧光鉴定。诱导OF成脂分化并油红O染色鉴定。分别采用含0、0.1、1.0、10.0 μg/L TNF-α的完全培养液诱导眼眶成熟脂肪细胞去分化。分别收集原代、分化14 d和去分化20 d细胞, 通过实时荧光定量PCR检测过氧化物酶体增生物激活受体γ(PPARγ)、细胞外调节蛋白激酶1(ERK1)、ERK2及脂肪包被蛋白1(perilipin1) mRNA相对表达量;采用Western blot法检测PPARγ、P-ERK1/2、perilipin1蛋白相对表达量。结果体外成功培养人TAO来源OF, 细胞呈梭形或多角形, 呈旋涡状紧密排列, 波形蛋白免疫荧光染色呈阳性。OF成脂分化诱导后, 部分细胞的细胞质中可出现脂滴样结构, 油红O染色可见细胞质内被着染的脂滴结构, 证实分化后所得到细胞为脂肪细胞。0.1 μ...     

TNF-α对甲状腺相关眼病分化后眼眶脂肪细胞瘦素mRNA表达的影响

目的探讨肿瘤坏死因子-α（TNF—α）对体外培养的甲状腺相关眼病（TAO）分化后眼眶脂肪细胞瘦素mRNA表达的影响。方法取TAO患者行眼眶减压术的眼眶脂肪组织，体外培养眼眶前脂肪细胞，诱导分化，采用不同质量浓度、不同作用时间的TNF-α处理分化后的脂肪细胞，实时荧光定量PCR检测瘦素mRNA的表达。结果体外培养的眼眶前脂肪细胞在诱导分化刺激下，分化为脂肪细胞；0．5～50ng／mL的TNF—α作用24h，瘦素mRNA表达随质量浓度的增大而下降，呈量效依赖性；5ng／mL的TNF-α作用12～48h能下调瘦素mRNA的表达，呈时效依赖性；与对照组相比，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论TNF-α对TAO分化后眼眶脂肪细胞的瘦素mRNA表达有下调作用。     

CD40在人球后成纤维细胞的表达

目的:探讨rhIFN-γ作用下,正常人和TAO患者球后成纤维细胞(RF)CD40 mRNA的表达情况.方法:用RT-PCR法,对rhIFN-γ诱导正常人和TAO患者RF CD40的mRNA进行半定量分析.结果:经100,200,400,1 000kU/L rhIFN-γ作用48h后,正常人和TAO患者RF CD40的吸光度比值分别为0.483±0.095和0.476±0.051,0.647±0.034和0.659±0.083,0.849±0.017和0.852±0.024,0.891±0.082和0.894±0.041与各自对照组0.203±0.032和0.213±0.020相比,差异有统计学意义(P≤0.01);两者同一浓度相比差异无统计学意义(P＞0.05).经400kU/L rhIFN-γ作用12,24,48,72h后,正常人和TAO患者RF CD40的吸光度比值分别为0.331±0.047和0.329±0.025,0.668±0.067和0.683±0.104,0.849±0.017和0.852±0.024,0.865±0.021和0.876±0.014与各自对照组0.203±0.032和0.213±0.020相比,差异有统计学意义(P＜0.05),两者同一时间相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论:rhIFN-γ可上调正常人和TAO患者RF CD40mRNA的水平,呈浓度和时间依赖.     

脂多糖诱导炎症反应对TAO眼眶成纤维细胞环氧合酶-2及前列腺素E_2表达的影响

目的观察脂多糖（LPS）对甲状腺相关眼病（TAO）眼眶成纤维细胞环氧合酶-2（COX-2）表达及前列腺素E2（PGE2）分泌的影响。方法眼眶组织分别取自3例3眼因眼球萎缩行义眼台植入（正常对照组）和4例4眼因TAO行开眶减压术（TAO组）的患者。细胞原代培养采用组织块法。将体外培养的2组眼眶成纤维细胞,分别采用0、10、100、1000μg/L的LPS作用24h,或1000μg/LLPS分别作用0、4、8、12、24h。半定量逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检测各组COX-2mRNA的表达,ELISA法检测上清液中PGE2的表达。结果组织块培养法第3天即有成纤维样细胞自组织块边缘游出,细胞呈长梭形和多角形。10、100、1000μg/LLPS作用后,与未用LPS刺激时相比,正常对照组和TAO组眼眶成纤维细胞COX-2mRNA的表达均增强,PGE2的分泌增加。与正常对照组相比,1000μg/LLPS作用时间相同时,TAO组COX-2mRNA表达及PGE2的分泌增加更为明显（P〈0.05）。结论 COX-2通路可能参与了活动期TAO的炎症过程;在疾病的活动期,采用抑制COX-2的治疗,可减轻局部炎症反应,可能对活动期TAO的治疗有效。     

Graves''''眼病患者眼眶前脂肪细胞抵抗素诱导的表达

目的通过检测抵抗素在Graves’眼病患者眼眶前脂肪细胞培养分化过程中的表达,进一步研究前脂肪细胞的分化过程。方法在体外通过组织块培养法获取前脂肪细胞,前脂肪细胞在分化液的作用下转化为成熟脂肪细胞。利用RT-PCR法检测前脂肪细胞及成熟脂肪细胞中抵抗素mRNA的表达情况,对前脂肪细胞及成熟脂肪细胞进行免疫组化检测抵抗素蛋白的表达情况。结果前脂肪细胞中无抵抗素mRNA及蛋白的表达。成熟脂肪细胞中有抵抗素mRNA及蛋白的表达。免疫组化结果显示抵抗素蛋白位于成熟脂肪细胞胞浆中。结论Graves’眼病患者眼眶组织中存在功能活跃的前脂肪细胞,能够在体外分化为脂肪细胞。抵抗素是脂肪细胞分泌的一种脂肪细胞因子,仅存在于成熟脂肪细胞中,可作为脂肪细胞分化的标记物。     

甲状腺相关眼病患者和正常人眼眶脂肪组织中脂肪特异性磷脂酶A2的表达

目的　测量甲状腺相关眼病患者和正常人眼眶脂肪组织中脂肪特异性磷脂酶Ａ２（ａｄｉｐｏｓｅ-ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＡ２,ＡｄＰＬＡ）的表达水平。方法　用实时定量聚合酶链反应定量检测３例甲状腺相关眼病患者和４例正常人眼眶脂肪组织的ＡｄＰＬＡｍＲＮＡ的表达水平。结果　甲状腺相关眼病患者眼眶脂肪组织中ＡｄＰＬＡｍＲＮＡ的表达量为０．０８８８２±０．０１３９１（中位数０．８２２００）,正常人眼眶脂肪组织中ＡｄＰＬＡｍＲＮＡ的表达量为０．０１２１９±０．０５１２９（中位数０．００８７６）,两组差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论　ＡｄＰＬＡｍＲＮＡ在甲状腺相关眼病患者和正常人眼眶脂肪组织中均有表达,而且甲状腺相关眼病患者的表达量明显高于正常人。     

小蘖碱对甲状腺相关眼病眼眶脂肪组织形态学影响的研究

目的:了解小蘖碱对甲状腺相关眼病眼眶脂肪组织形态学的影响。方法:将接受眼眶减压术的静止期甲状腺相关眼病(thyroid associated ophthalmopathy,TAO)患者48例随机分为4组,每组12例,第一至四组于接受眼眶减压术前口服小蘖碱0,4,8,12wk,行眼眶减压术时切除球后眼眶脂肪组织。将眼眶脂肪组织行冰冻切片、HE染色,分析脂肪细胞形态的变化。结果:正常对照组眼眶脂肪细胞平均差异截面积为5909.4625±664.91(pixel2),TAO患者术前使用小蘖碱0,4,8,12wk后脂肪细胞平均差异截面积分别为46077.5357±11263.27,19634.100±3512.43,17529.69±4342.99,27980.1304±6123.96(pixel2),正常对照组与TAO对照组及使用小蘖碱4wk的实验组差异明显,TAO对照组与各实验组间差异明显。正常对照组眼眶脂肪细胞平均截面积为13780.104±7542.28(pixel2),TAO患者术前使用小蘖碱0,4,8,12wk后脂肪细胞平均截面积分别为45210.250±25854.40,45554.80±15544.69,39163.94±12696.71,27184.889±10703.85(pixel2),正常对照组与各实验组差异明显,TAO对照组与术前使用12wk小蘖碱的实验组间有明显差异。结论:TAO患者眼眶脂肪细胞较正常对照组平均截面积明显增大且截面积差异性增大,手术前使用小蘖碱一段时间后能够减少TAO患者眼眶脂肪细胞大小的差异性,使增大的脂肪细胞有一定程度的缩小。     

重组人瘦素蛋白对甲状腺相关眼病眼眶前脂肪细胞诱导分化的影响

目的探讨重组人瘦素蛋白对体外培养的甲状腺相关眼病（TAO）患者眼眶前脂肪细胞诱导分化的影响。方法体外培养TAO患者眼眶前脂肪细胞,鉴定并传代,设加入不同质量浓度的重组人瘦素蛋白为瘦素组,另设对照组,进行诱导分化及油红染色,图像分析系统计算分化后脂肪细胞内脂质／核的平均积分光密度（IOD）值。结果体外培养的前脂肪细胞经免疫组织化学染色鉴定为间叶来源。不同质量浓度瘦素组分化后脂肪细胞内脂质／核的平均IOD值呈剂量依赖性降低;50、100、500μg／L瘦素组与对照组相比,差异均有统计学意义（P〈0,05）。结论重组人瘦素蛋白能够抑制眼眶前脂肪细胞的分化和细胞内脂质的形成,提示瘦素可能在TAO的发病中起反馈调节作用。     

COX-2在甲状腺相关眼病眼眶脂肪增生中的作用

甲状腺相关眼病（thyroid-associatedophthalmopathy,TAO）是一种自身免疫性疾病,发病机制与成纤维细胞和T细胞的相互作用所致炎症反应有关,脂肪增生是其重要的病理过程。环氧化酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）是一种重要的致炎因子,与多种自身免疫疾病的炎症过程相关。TAO患者眼眶中活化的T淋巴细胞过量表达COX-2,并通过与眼眶CD90-成纤维细胞表达的过氧化物酶体增生物激活受体1（peroxisomeproliferatoractivatedreceptor1,PPARγ）结合,诱导CD90-眼眶成纤维细胞分化为成熟脂肪细胞,从而促进眼眶脂肪增生的发生,因此COX-2在TAO眼眶脂肪增生中起重要作用。（国际眼科纵览,2012,36：336-340）     

夏枯草、浙贝提取物对体外培养TAO眼眶成纤维细胞的影响

目的探讨夏枯草、浙贝治疗甲状腺相关眼病（TAO）的机制。方法采用体外培养的正常人和TAO患者的眼眶成纤维细胞,将夏枯草、浙贝提取物、刺激药物干扰素-γ和阳性对照药物地塞米松分成不同质量浓度组,以MTT法、磁性均相化学发光免疫分析法、流式细胞仪检测其对细胞的增生、透明质酸（HA）的分泌以及黏附分子（ICAM-1）表达的影响。结果夏枯草、浙贝提取物具有与地塞米松相似的抑制作用,对于TAO患者HA的分泌,133mg／mL的夏枯草质量浓度组与10ug／mL地塞米松组比较差异无统计学意义（P〉0．05）,但浙贝各质量浓度组较夏枯草和地塞米松弱（P〈0．01）;对于ICAM—1的表达,夏枯草组的抑制作用较地塞米松组弱（P〈0．01）,但较浙贝组强（P〈0．01）。结论夏枯草、浙贝对TAO的治疗作用可能是通过抑制眼眶成纤维细胞的增生、在IFN-γ刺激下HA的分泌和ICAM-1的表达而实现的,且夏枯草作用强于浙贝。