枸杞多糖对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响

目的：研究枸杞多糖对小鼠骨髓树突状细胞（DC）表型及功能成熟的影响。方法：小鼠骨髓细胞用GM-CSF和IL-4培养5d，然后用免疫磁珠法纯化DC细胞，实验组加入枸杞多糖（100μg／ml），空白对照组加等量RPMI1640，阳性对照组加LPS（100ng／ml），3组分别同时作用48h。流式细胞仪检测细胞表型和细胞摄取抗原的能力，ELISA检测产生的细胞因子IL-12，混合淋巴细胞反应检测细胞提呈抗原的能力。结果：用枸杞多糖刺激的小鼠骨髓DC表达I-A／I-E、CD11c和分泌IL-12能力比空白对照组增加，吞噬FITC-dextran的能力下降，并可促进同种异基因T细胞的增殖。结论：枸杞多糖可以促进体外培养的小鼠骨髓DC的成熟，促进DC诱导的免疫应答启动。     

紫外线照射未成熟树突状细胞诱导小鼠同种抗原免疫耐受及其机制研究

目的探讨应用紫外线照射未成熟树突状细胞诱导C3H小鼠对Balb/c小鼠同种抗原免疫耐受及其免疫学机制。方法 (1)用紫外线B(ultraviolet B,UVB)照射Balb/c(H-2d)小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞(immature dendritic cells,im DC),诱导其凋亡,随后将其输注到C3H(H-2k)小鼠体内,诱导C3H小鼠对Balb/c抗原免疫耐受。(2)检测诱免疫耐受小鼠体内调节T细胞以及细胞因子白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)和干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)分泌以研究其耐受机制。结果 (1)UVB-Balb/c im DC免疫的C3H小鼠对Balb/c抗原产生了免疫耐受,不能产生抗Balb/c抗体。(2)免疫耐受C3H小鼠不能排异注射到体内的Balb/c脾细胞。(3)UVB-Balb/c im DC免疫的C3H小鼠T细胞分泌IL-10增加,并且产生更多的FOX-P3+调节T细胞。结论 (1)应用UVB-Balb/c im DC免疫C3H小鼠可以使C3H小鼠对Balb/c抗原产生完全彻底的免疫耐受。(2)免疫耐受C3H小鼠对Balb/c抗原产生免疫耐受的可能原因是由于其T细胞分泌IL-10增加,并且产生更多的FOX-P3~+调节T细胞。     

树突状细胞的特性和功能

树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌ，ＤＣ）是目前所知功能最强的一种抗原提呈细胞，也是近几年肿瘤免疫领域的研究热点之一。本文就其特性、起源、成熟过程和功能综述如下。１ＤＣ的特性Ｓｔｅｉｎｍａｎ和Ｃｏｈｎ（１９７３）［１］首次分离出一类与粒细胞、巨噬细...     

溶血性链球菌制剂OK432联合肿瘤冻融抗原诱导小鼠骨髓树突状细胞的成熟

目的 探讨溶血性链球菌制剂(OK432)联合肿瘤冻融抗原诱导小鼠骨髓树突状细胞(DCs)成熟的作用,改进体外诱导DCs成熟的方案,为后期制备临床使用的抗肿瘤DCs疫苗提供新的技术路线.方法 分离小鼠骨髓单核细胞(BMMCs),并在含10%胎牛血清(FCS)、重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)的培养体系中诱导培养,部分加入OK432和/或肿瘤冻融抗原冲击,光镜和透射电镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面分子CD83和CD86的表达情况.结果 经OK432联合肿瘤细胞冻融抗原冲击的DCs形态学特征典型.肿瘤冻融抗原冲击后,DCs表面CD83和CD86的表达上调,OK432进一步刺激后,CD83和CD86的表达率显著升高.结论 采用OK432联合肿瘤冻融抗原诱导DCs成熟的方案相对简便;OK432能有效促进肿瘤冻融抗原冲击后的骨髓DCs进一步成熟.     

不同成熟状态小鼠树突状细胞的体外诱导

目的：体外诱导小鼠骨髓来源的不同成熟状态树突状细胞(dendritic cells，DCs)。方法：rmGM—CSF体外培养小鼠骨髓细胞，5～6d后，利用磁性细胞分离器(MACS)分离CD11C^ 细胞，部分细胞加入rmTNFα继续培养1～2d，通过流式细胞仪检测分别检测细胞表面标志，同种混合淋巴细胞反应检测细胞的体外刺激能力。结果：小鼠骨髓细胞经rmGM-CSF培养5～6d，再经过MACS分离可获得大量未成熟DCs，细胞表面出现少量短而粗的突起，低水平表达MHCI／分子和共刺激分子CD80、CD86及CI40，刺激同种CD4^ T细胞的混合淋巴细胞反应能力较弱：加入rmTNFα继续培养可获得成熟DCs，细胞表面出现大量细长突起，细胞表面高水平表达MHC Ⅱ分子和共刺激分子CD80、CD86及CI40，刺激同种CI4^ T细胞的混合淋巴细胞反应能力较强。结论：通过rmGM-CSF或rmGM-CSF rmTNFα体外培养体系可以获得大量未成熟DCs或成熟DCs，为进一步研究DCs的生物学功能提供实验基础。     

小鼠精子与子宫内膜细胞融合及嵌合细胞生物特性研究

【立论依据】 宫颈癌和子宫内膜癌是我国妇女常见的恶性肿瘤。虽然大量的研究数据表明人乳头状瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌的发生密切相关,但仍有许多妇女在未感染HPV情况下发生宫颈癌,因此宫颈癌的发病机制迄今为止尚未完全阐明。一些研究发现在妇女体内存在含有Y染色体的细胞,这提示精子与女性体细胞相互作用和融合的可能,而与精子融合的体细胞是否会产生恶性特征目前尚不清楚。如果精子与宫颈或子宫内膜的直接接触可导致细胞的融合,而融合细胞可表现恶性特征则提示无保护的性生活具有导致宫颈或子宫内膜癌患病的风险。 【设计思路】 在体外证实小鼠精子对子宫内膜细胞的穿透性,并观察融合后嵌合细胞的生物特性及转归,通过标志性蛋白分析完成对嵌合细胞的干细胞特性或恶性特征的初步鉴定。 【实验内容】 附睾尾和精囊部获得成年雄鼠的精子,精子获能后用特异荧光分子标记精子细胞膜或顶体结构,然后进行精子与原代培养的雌鼠子宫内膜细胞的共培养,根据荧光染料在细胞膜的弥散特征证实精子与子宫内膜细胞的融合。采用流式细胞仪分选嵌合细胞并进行体外的长期培养。取对数生长期的嵌合细胞进行其生物学特性鉴定,包括:增殖能力、干性特征及恶性特征的鉴定。 【材料】 实验动物:SPF级 KM小鼠;主要试剂:DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、荧光染料等;实验仪器:二氧化碳培养箱、超净工作台、恒温水浴箱、倒置显微镜、激光共聚焦荧光显微镜、流式细胞仪等。 【可行性】 精子-体细胞融合已有部分体外研究报道,本研究借鉴了这些研究的实验方法并对具体的实验方案进行了优化。参与本研究的成员前期研究已经证实精子与宫颈癌Hela细胞的融合现象并已掌握了进行相关实验的生物学技术。 【创新性】 小鼠精子对子宫内膜细胞穿透性的体外研究目前尚未见相关报道,本研究旨在建立一种新型的精子-子宫内膜细胞融合模型,并将对这一模型的生物特征进行初步的研究。     

肝癌细胞对成熟树突状细胞生物物理学特性的影响

目的:研究肝癌细胞微环境成熟树突状细胞(Mature dendritic cells,mDCs)的生物物理学特性的影响,从交叉学科的角度来探索肿瘤细胞的免疫逃逸机制.方法:用免疫磁珠从人外周血分离CDl4+单核细胞,加人rhGM-CSF和rhIL-4将单核细胞诱导分化为imDCs,利用TNF-α将未成熟树突状细胞(Immature dendritic cells,imDCs)诱导为mDCs,mDCs与HCCs在Transwell 中共培养48 h,分别利用微吸管法、荧光偏振法和Transwell法研究细胞粘弹性、膜流动性和迁移能力.结果:与肝癌细胞(Hepa tocellular carcinoma cells,HCCs) 共培养后,mDCs的粘弹性和膜流动性显著下降,细胞的迁移能力受到显著的损伤.结论:HCCs可能能够损伤mDCs的生物物理学特性来影响其迁移能力,这可能是肿瘤逃脱机体免疫监视的方式之一,这对进一步深入理解肿瘤的免疫逃逸机制具有重要意义.     

小鼠树突状细胞亚群与T细胞关系的研究进展

树突状细胞(dendritic cells,DCs)是目前已知机体内功能最强的专职性抗原提呈细胞,其最大特点是能够显著刺激初始型T细胞(naive T cells)增殖,是机体免疫反应的始动者。近年来,随着对小鼠DCs研究的不断深入开展,本文在此对DCs亚群与T细胞之间相互关系的研究取得的进展综述如下。     

小鼠树突状细胞的体外培养与鉴定

目的: 探索、优化体外诱导和扩增小鼠树突状细胞(DC)的方法,并进行形态学观察和生物学鉴定. 方法: 应用环磷酰胺200 mg/kg经尾静脉注射Balb/c小鼠,8 d后处死小鼠,常规培养脾细胞,第3日加入含有IL-4, GM-CSF细胞因子的条件培养液,第5日补加TNF-α,第8日制备标本进行相差显微镜、扫描电镜、透射电镜观察,并分别在培养第3, 5, 7日经流式细胞仪检测成熟细胞表面标志. 结果: 刺激培养细胞经相差显微镜、扫描电镜、透射电镜观察,具有典型的DC形态,流式细胞仪检测发现细胞表面表达CD11c, CD86, ⅠAb, H2D6标志物. 结论: 在小鼠脾脏细胞培养中加入IL-4, GM-CSF, TNF-α等刺激,可获得足量、较高纯度的DC,为DC的基础研究与临床应用奠定了基础.     

树突状细胞-结直肠癌细胞融合疫苗的制备及生物学特性的研究

目的：研究树突状细胞（DC）与结直肠癌（Lovo）细胞融合疫苗的制备及其生物学特性。方法：①应用PEG融合技术融合树突状细胞和Lovo细胞，制备融合疫苗。②通过描记细胞生长曲线、倒置显微镜和激光共聚焦显微镜、流式细胞仪检测观察细胞生物学特性。③通过检测疫苗的克隆形成率、促进T淋巴细胞增殖能力和疫苗的成瘤活性来观察疫苗的安全性和免疫学效应。结果：融合疫苗呈悬浮生长，具有两种亲代细胞的形态结构特点，CD80、CD83、CD86等在融合细胞表面的表达较单纯DC显著丰富；融合细胞不出现明显的细胞倍增；融合疫苗在软琼脂上培养21d，未见明显的细胞克隆形成；通过^3H—TdR掺人法检测融合细胞刺激T淋巴细胞增殖情况，发现融合疫苗可强烈刺激T淋巴细胞增殖；融合疫苗接种于裸鼠体内观察30d，未见肿瘤组织生长。结论：融合细胞具有作为抗肿瘤疫苗应具备的低增殖能力和不成瘤的安全性；融合疫苗可明显促进T淋巴细胞的增殖能力说明将其作为抗结直肠癌特异性免疫治疗方法有进一步研究的意义。     

人骨髓间充质干细胞抑制单核细胞来源的树突状细胞的成熟和功能

目的研究人骨髓间充质干细胞(MSC)的免疫调节作用以探讨防治异基因造血干细胞移植中移植物抗宿主病(GVHD)的可能途径。方法将培养第5天的人单核细胞来源的树突状细胞(DC)以每孔1×106密度种于24孔培养板,与等体积3~6代MSC上清混合培养48h,加脂多糖(100ng/m l)、肿瘤坏死因子α(TNF-α,10ng/m l)促DC成熟,观察试验组与对照组树突状细胞免疫表型的变化及其分泌细胞因子白细胞介素(IL)-10、IL-12的变化,并通过混合淋巴细胞反应检测树突状细胞刺激淋巴细胞增殖能力的变化。结果流式免疫分型显示与对照组相比,树突状细胞成熟表面标志CD83、协同刺激分子CD80表达降低,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定IL-12浓度混合培养组减少41.7%(P<0.05),IL-10浓度无变化,刺激淋巴细胞增殖能力混合培养组降低(P<0.01)。结论骨髓间充质干细胞上清可抑制单核细胞来源的树突状细胞的成熟和功能,诱导免疫耐受。     

Optimal in vitro culture conditions for murine predominant immature CD8a+ dendritic cells

Background The prospects of using immature CD8a^＋ dendritic cells （DC2） to establish transplant immunologic tolerance and treatments for autoimmune diseases in the future are promising. However, the methods for inducing DC2 are still being explored. The present study was aimed to investigate the optimal in vitro conditions for preparing large numbers of predominant DC2 from murine bone marrow cells. Methods Three groups of bone marrow cells cultured under different conditions were examined, namely a cytokine-induced experimental group （cytokine group）, a control group with a low concentration of granulocyte-macrophage colony stimulating factor （GM-CSF, low GM-CSF group） and a control group without endogenous cytokines. The cytokine group was cultured with 5 ng/ml GM-CSF, 25 ng/ml Fit3 ligand （FIt3L）, 20 ng/ml interleukin 4 （IL-4） and 100 ng/ml stem cell factor （SCF）. The low GM-CSF control group was cultured with 0.4 ng/ml GM-CSF, 25 ng/ml FIt3L and 100 ng/ml SCF, without IL-4. The control group without exogenous cytokines was cultured without additional cytokines. All cells were cultured at 37℃ under 5% CO2. On days 3, 7 and 16, 4-color flow cytometry was carried out to analyze the cell phenotypes, and the total cell numbers were counted to analyze the cell yields. Phase-contrast microscopy was used to observe the cell morphologies. Results The cytokine group exhibited higher proportions of typical immature CD8a^＋ DC, especially on day 3, but the total cell number and DC2 proportion decreased during prolonged culture. The low GM-CSF control group showed the same tendencies as the cytokine group on days 16 and 22, but produced higher total cell numbers （P 〈0.05） with lower DC2 proportions and cell numbers. The control group without exogenous cytokines spontaneously generated a certain proportion of DC2, but with low total cell and DC2 numbers that decreased rapidly, especially during prolonged culture （days 7 and 16, P 〈0.05）, Conclusions Culture in the presence of 5 ng/ml GM-CSF, 25 ng/ml FIt3L, 20 ng/ml IL-4 and 100 ng/ml SCF can rapidly induce large quantities of predominant immature CD8a^＋ DC from murine bone marrow cells. Therefore, these represent optimal culture conditions for preparing murine immature DC2 in vitro.     

树突状细胞和巨噬细胞对外源性抗原内吞路径的比较研究

目的 观察并比较小鼠树突状细胞（ＤＣ）和巨噬细胞对外源性抗原的内吞路径的差异,方法 制备小鼠骨髓ＤＣ和腹腔巨噬细胞,然后让ＤＣ和巨噬细胞与辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）－５ｎｍ胶体金共孵育１０分钟后再培养０～１２０分钟,进行酸性磷酸酶细胞化学反应和组织相容性抗原（ＭＨＣ）Ⅱ免疫胶体金标记,最后在电镜下观察５ｎｍ胶体金的细胞内运行路径。结果 ＤＣ内吞ＨＲＰ５－ｎｍ胶体金１０分钟后再培养３０分钟,大部分５ｎ     

七氟醚对树突状细胞成熟及成熟树突状细胞活力的影响

目的探讨吸入性麻醉药七氟醚对脐血来源未成熟树突状细胞成熟及成熟树突状细胞(DCs)活力的影响。方法密度梯度离心法分离脐血来源单核细胞,并随机分为3组,即常规培养组(C组)作为对照组、未成熟DC组(I组)和成熟DC组(M组)。C组加入重组人粒细胞—单核细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)50 ng/ml和重组人白介素-4(rhIL-4)10 ng/ml共培养12d,然后加入肿瘤坏死因子(TNF-α)50ng/ml,持续培养至第14天。I组、M组分别于第6、13天用含2.5%七氟醚的混合气体处理,余同C组。倒置显微镜及扫描电镜下观察细胞形态,流式细胞技术(FCM)检测细胞表面免疫表型表达(CD80/CD86、CD83/HLA-DR),MTT法检测DC刺激T细胞增殖活力,ELISA法检测上清液中IL-12水平。结果 (1)DCs形态学:C组及M组细胞表面有大量较长突起,面I组细胞表面树突状突起短,分支少。(2)CD80/CD86、CD83/HLA-DR表达率:C组、M组、I组分别为(36.9±2.8)%和(12.9±2.4)%、(39.4±2.1)%和(14.4±3.0)%、(19.6±2.6)%和(7.1±1.4)%,I组与C组比较,差异有统计学意义(P<0.05),而M组与C组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(3)DCs刺激T细胞增殖活力:C组、M组、I组分别为1.44±0.23、1.37±0.10和0.56±0.12,I组与C组比较,差异有统计学意义(P<0.05),而M组与C组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(4)DCs分泌IL-12水平:C组、M组、I组分别为(958±321)pg/ml、(982±408)pg/ml和(377±312)pg/ml,I组与C组比较,差异有统计学意义(P<0.05),而M组与C组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论七氟醚可抑制脐血来源树突状细胞成熟,但对成熟树突状细胞活力影响不明显。     

中性粒细胞诱导适应性免疫应答过程中树突状细胞成熟活化

目的 探讨T辅助（Th）1细胞免疫应答过程中,中性粒细胞（PMN）对树突状细胞（DC）的调节作用。方法 将脂多糖（LPS）刺激的中性粒细胞（LPS-PMN）和未成熟树突状细胞（imDC）共培养,流式细胞术检测DC表面CD40和CD86,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测白细胞介素12（IL-12）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）。将与LPS—PMN共培养后DC（PMN-DC）提纯,与FITC标记的卵清蛋白（FITC-OVA）培养,检测其吞噬功能。将PMN-DC与D011．10T细胞和OVA17肽共培养,计活细胞数,胞内染色测干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素4（IL-4）。结果 LPS-PMN可刺激imDC CD40和CD86上调并分泌IL-12、肿瘤坏死因子（TNF）-α,且这种能力能被抗TNF-α单抗所抑制。与imDC对照,PMN—DC吞噬功能下降,能显著刺激D011．10T细胞增殖,分泌高水平IFN-γ、少量IL-4。结论 LPS-PMN具有促使imDC成熟活化,刺激其分泌细胞因子,发挥其在Th1免疫应答中抗原呈递,促进Th1分化的作用。     

Wistar大鼠树突状细胞的体外培养、扩增与鉴定

目的：探讨体外分离、培养和扩增大鼠骨髓来源树突状细胞（DC）的有效方法。方法：采用改良的Chen－WoanDC培养方法，梯度离心提取骨髓单核细胞中的非粘附细胞，加入GM CSF 5?ng/ml、IL 4 5?ng/ml进行诱导扩增，对培养的目的细胞进行形态学、OX62－FITC免疫荧光检查以及功能学鉴定。结果：DC前体细胞培养10?d呈典型树突状结构，表面标志物染色阳性，流式细胞学检查OX62单抗阳性率86％，不同培养时段的DC诱发混合淋巴细胞反应以培养10?d的DC最强，培养10?d的DC诱发混合淋巴细胞反应对同源淋巴细胞有更好的活性。结论：改良的Chen－Woan法为体外诱导扩增大鼠骨髓来源DC的有效方法。     

术前输注负载供者抗原的受者未成熟树突状细胞延长移植心存活时间的实验研究

目的:利用负载供者抗原的受者未成熟树突状细胞(imDC)干扰T细胞抗原间接识别途径,观察对同种异体移植心存活时间的影响。方法:用低剂量粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)培养受者小鼠骨髓源性imDC,并在培养过程中加入供者可溶性抗原共同孵育,流式细胞术检测细胞表型,观察其在体外刺激自体T细胞增殖的能力,并于术前1周将约2.0×106个树突状细胞(DC)输入受者体内,观察其对同种异体移植心存活时间的影响。结果:受者DC可通过共同孵育的方式有效负载供者抗原,负载供者抗原的受者imDC在体外不能有效刺激自体T细胞活化增殖,将其于术前输入受者体内,移植心的存活时间由(7.2±1.7)天延长至(17.7±3.3)天。结论:术前输注负载供者抗原的受者imDC,可明显延长移植心的存活时间。