预诱导与全反式维甲酸并脑源性神经营养因子体外诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞的分化

背景：骨髓基质干细胞可定向诱导分化为神经元样细胞,但目前培养的方法尚不统一。 目的：采用预诱导与全反式维甲酸和脑源性神经营养因子为培养体系,拟在体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向神经细胞分化。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-12/2008-06在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心干细胞室完成。 材料：清洁级雄性SD大鼠2只,由新疆医科大学动物试验中心提供。 方法：采用贴壁法体外分离培养大鼠骨髓基质干细胞,经反复传代细胞逐渐纯化。取生长状态良好的第3代骨髓基质干细胞,按8×107 L-1密度接种后,改换含10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子的神经干细胞培养体系进行预诱导,48 h后去除预诱导液,加入含10 μg/L脑源性神经生长因子、1 μmol/L全反式维甲酸的神经干细胞培养体系定向诱导骨髓基质干细胞分化为神经细胞。以未诱导的骨髓基质干细胞作为对照。 主要观察指标：流式细胞仪检测第3代骨髓基质干细胞表面标志的表达,诱导后免疫荧光染色和流式细胞仪检测巢蛋白阳性的表达,免疫荧光染色鉴定神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达。 结果：第3代骨髓基质干细胞CD29,CD44表达率分别为97.1%,99%,CD45表达率为0.5%,CD34呈阴性表达。预诱导48 h后巢蛋白阳性率为24%,而对照组仅为4.6%。诱导48 h后,巢蛋白染色呈阳性,并可见大量神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞出现;对照组均呈阴性表达。 结论：神经干细胞培养体系联合全反式维甲酸与脑源性神经生长因子,可在体外高效、稳定地诱导骨髓基质干细胞转化为神经元样细胞,并进一步向神经元和神经胶质细胞方向分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。 方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。 结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

Wnt信号分子诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

间充质干细胞可向神经方向转化,但分子机制目前不清楚。 目的：观察Wnt3a和Wnt5a在骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中的作用。 方法：体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传代后通过形态学和流式细胞仪检测细胞表面标志物CD14,CD44,CD9,CD34,CD45表达。采用碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a和Wnt5a的诱导方案,免疫组织化学法和RT-PCR检测Wnt3a、Wnt5a在骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化过程中的作用。 结果与结论：骨髓间充质干细胞为长梭形,表面标志物CD9,CD44高表达,CD34,CD45低表达。诱导后细胞Wnt3a诱导组巢蛋白,神经元特异性烯醇化酶呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白无明显表达,细胞活力良好。Wnt5a诱导组巢蛋白呈弱阳性表达,而神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性。RT-PCR结果显示Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后5 d可见明显的扩增条带,10 d后更加明显。胶质纤维酸性蛋白在诱导10 d后出现较弱的扩增条带。提示Wnt3a分子能够促进体外培养的间充质干细胞向神经元样细胞分化。     

建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞作为种子细胞在组织工程等领域应用广泛,建立稳定的分离培养体系和统一鉴定标准尤为重要。 目的：以不同方法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。 设计、时间及地点：细胞学体外对比观察,于2005-08/12在暨南大学完成。 材料：SPF级3月龄SD雌性大鼠5只,由中山大学实验动物中心提供。 方法：无菌条件下分离大鼠双下肢,低糖DMEM培养液冲出骨髓,分别运用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞,利用差速贴壁原理对细胞进行纯化扩增。取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分别加入成骨、成脂、成软骨诱导培养基,培养14 d。 主要观察指标：倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞的生长状态,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,采用碱性磷酸酶染色鉴定成骨能力,以油红O染色鉴定成脂能力,以甲苯胺蓝染色鉴定成软骨能力。 结果：与密度梯度离心法相比,全骨髓贴壁法分离获得的骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经传代后能够纯化。第3代骨髓间充质干细胞形态单一均匀,呈典型的极性漩涡状生长,不表达造血前体细胞标志抗原CD34和白细胞标志抗原CD45,表达整合素家族成员CD29和黏附分子CD44,经诱导后碱性磷酸酶染色、油红O染色和甲苯胺蓝染色均呈阳性。 结论：采用全骨髓贴壁法可稳定获得均质性良好的大鼠骨髓间充质干细胞,效果优于密度梯度离心法。经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为大鼠骨髓间充质干细胞。     

绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞的成骨及成脂潜能

背景：为便于进一步追踪骨髓间充质干细胞,常需对其进行标记。 目的：采用绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞,观察标记后其诱导成骨及成脂能力。 设计、时间及地点：细胞观察实验,于2007-12/2008-10在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室进行。 材料：4月龄健康新西兰大耳白兔6只,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心。 方法：无菌条件下取兔双侧股骨,应用密度梯度离心法及贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞。取传至第3代细胞,用脂质体介导法将绿色荧光蛋白质粒转入,经G418筛选得到稳定转染的细胞,分别进行成骨、成脂诱导。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞的形态、表面标志表达、绿色荧光蛋白标记情况,骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化潜能。 结果：经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞多呈纺锤形或梭形,成纤维细胞样,流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达,CD34呈阴性。经G418筛选后,镜下可见大量发出绿色荧光的骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞成骨诱导21 d后有较多的钙盐沉积,茜素红染色呈红色;成脂诱导3 d后,细胞内有小脂滴出现,2 周后油红O染色示有大量脂质沉积。 结论：绿色荧光蛋白标记的兔骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分化潜能。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化

背景：骨髓中的间充质干细胞含量极少,每1×104~1×105个单核细胞中约有1个骨髓间充质干细胞,需要在体外分离、纯化、扩增后才能满足体内移植要求。 目的：观察体外分离培养的骨髓间充质干细胞生物学特性及多向分化潜能。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-10/2008-12在福建医科大学附属协和医院泌尿外科研究室完成。 材料：清洁级雄性近交系SD大鼠30只,由上海斯莱克实验动物有限公司提供。 方法：通过全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,待细胞融合至80%~90%胰蛋白酶消化传代。取传至第3代细胞,分别向成骨、成脂方向诱导分化。 主要观察指标：倒置相差显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测其表面标记,茜素红染色检测其成骨能力,油红O染色检测其成脂能力。 结果：原代及传代的骨髓间充质干细胞均呈长梭形成纤维细胞样,连续传代10代以上,细胞始终保持旺盛的生长及扩增能力。第3代骨髓间充质干细胞CD90,CD44,CD106均呈阳性表达,而CD34,CD45,CD11b呈阴性。成骨诱导21 d后,可见大量橘红色矿化结节形成。成脂诱导2周后,可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴。 结论：全骨髓贴壁培养法可大量分离纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性*

背景：培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是其作为种子细胞在组织工程等领域广泛应用的重要前提。 目的：寻求快捷有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性。 方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,免疫荧光分析细胞骨架,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测其表面标记。 结果与结论：分离培养的细胞呈长梭形或多边形;细胞生长曲线呈S形;微丝免疫荧光染色结果显示,培养的骨髓间充质干细胞具有良好的细胞骨架系统。第3代骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD71、CD90均呈阳性表达,而CD13、CD34、CD45、CD133呈阴性。提示,经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学和细胞表面标志物表达方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为骨髓间充质干细胞,其第3代活性最佳,可用于后续实验。     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景：目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少。 目的：采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点。 方法：全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化。 结果与结论：培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性。扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多,表明细胞功能活跃。     

成人骨髓间充质干细胞培养条件优化及多向分化的能力

背景：成人骨髓中间充质干细胞数量少,要使其能够更好地应用于组织工程和细胞治疗,就必须建立成熟、简便、有效的分离培养扩增体系。 目的：建立成人骨髓间充质干细胞最佳培养方法,并观察诱导其向成脂肪、成骨及软骨细胞分化结果。 方法：分别采用密度梯度离心法和全骨髓培养法,分离培养成人骨髓间充质干细胞,通过光镜观察细胞形态,绘制生长曲线比较不同培养方法对骨髓间充质干细胞的影响;免疫荧光法鉴定表面抗原CD34、CD44和CD105的表达。不同诱导培养基诱导成人骨髓间充质干细胞,采用油红O、茜素红染色以及阿利新蓝染色检测成脂、成骨和成软骨诱导情况。 结果与结论：全骨髓培获得的骨髓间充质干细胞,其增殖能力和生长特性明显优于密度梯度离心法;细胞表面抗原CD44、CD105强阳性,CD34阴性;经过诱导培养,油红O、茜素红染色以及阿利新蓝染色均为阳性,证明全骨髓培养法获得细胞具有更强的生长增殖能力,并具有向脂肪,骨和软骨等组织多向分化的潜能。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖与多向分化的能力

背景：生理条件下机体内多数骨髓间充质干细胞增殖并不明显,然而在一定刺激下可表现出旺盛的有丝分裂活动,具有很强的增殖倍增能力,且体外实验表明其具有多向分化潜能。 目的：进一步验证体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖与多向分化潜能。 方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,MTT法绘制细胞生长曲线,免疫组化法对细胞表面干细胞标志CD44进行鉴定。取传至第4代细胞,分别用成骨、成软骨、成脂肪和成神经诱导剂予以培养,通过碱性磷酸酶染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、油红O染色、NeuN抗体免疫组化染色进行分化能力鉴定。 结果与结论：分离培养的细胞呈长梭形或多边形,细胞生长曲线呈S形,群体倍增时间约为31 h,免疫细胞化学染色后CD44呈阳性表达,CD34呈阴性。第4代骨髓间充质干细胞成骨诱导2周后出现钙盐沉积,成软骨诱导培养2周后Ⅱ型胶原检测呈阳性,成脂肪诱导培养2周后在细胞的胞浆内充满大量红色脂肪滴,成神经诱导6 h后细胞出现突起,类似神经元的轴突和树突纤维,NeuN免疫组化染色呈阳性。表明体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖能力旺盛,可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞方向分化。     

Enteric neural crest‐derived cells and neural stem cells: biology and therapeutic potential

The enteric nervous system arises from two regions of the neural crest; the vagal neural crest which gives rise to the vast majority of enteric neurones throughout the gastrointestinal tract, and the sacral neural crest which contributes a smaller number of cells that are mainly distributed within the hindgut. The migration of vagal neural crest cells into, and along the gut is promoted by GDNF, which is expressed by the gut mesenchyme and is the ligand for the Ret/GFRα1 signalling complex present on migrating vagal‐derived crest cells. Sacral neural crest cells enter the gut after it has been colonized by vagal neural crest cells, but the molecular control of sacral neural crest cell development has yet to be elucidated. Under the influence of both intrinsic and extrinsic cues, neural crest cells differentiate into glia and different types of enteric neurones at different developmental stages. Recently, the potential for neural stem cells to form an enteric nervous system has been examined, with the ultimate aim of using neural stem cells as a therapeutic strategy for some gut disorders where enteric neurones are reduced or absent.     

神经干细胞的来源

神经干细胞是近年来神经科学领域研究的一个热点。神经干细胞可来源于胚胎干细胞和成年干细胞，前者包括早期胚胎细胞和胎儿神经组织细胞，由于从胚胎获取干细胞面l临伦理学的束缚，从成年来源的神经干细胞将是未来临床应用更具可行性的途径。成年来源的神经干细胞包括存在于成年神经组织中的干细胞和从其他组织中分化得到的干细胞，其中骨髓基质细胞具有多分化潜能，在适当的条件下可以诱导分化出神经干细胞，目前备受关注。     

Derivation of primitive neural stem cells from human-induced pluripotent stem cells

Human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have facilitated studies on organ development and differentiation into specific lineages in in vitro systems. Although numerous studies have focused on cellular differentiation into neural lineage using hPSCs, most studies have initially evaluated embryoid body (EB) formation, eventually yielding terminally differentiated neurons with limited proliferation potential. This study aimed to establish human primitive neural stem cells (pNSCs) from exogene-free hiPSCs without EB formation. To derive pNSCs, we optimized N2B27 neural differentiation medium through supplementation of two inhibitors, CHIR99021 (GSK-3 inhibitor) and PD0325901 (MEK inhibitor), and growth factors including basic fibroblast growth factor (bFGF) and human leukemia inhibitory factor (hLIF). Consequently, pNSCs were efficiently derived and cultured over a long term. pNSCs displayed differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. These early NSC types potentially promote the clinical application of hiPSCs to cure human neurological disorders.     

Extracellular matrices,artificial neural scaffolds and the promise of neural regeneration

Over last 20 years, extracellular matrices have been shown to be useful in promoting tissue regeneration. Recently, they have been used and have had success in achieving neurogenesis. Recent developments in extracellular matrix design have allowed their successful in vivo incorporation to engender an environment favorable for neural regeneration in animal models. Promising treatments under investigation include manipulation of the intrinsic extracellular matrix and incorporation of engineered naometer-sized scaffolds through which inhibition of molecules serving as barriers to neuroregeneration and delivery of neurotrophic factors and/or cells for successful tissue regeneration can be achieved. Further understanding of the changes incurred within the extracellular matrix following central nervous system injury will undoubtedly help design a clinically efficacious extracellular matrix scaffold that can mitigate or reverse neural degeneration in the clinical setting.     

Direct reprogramming of somatic cells into neural stem cells or neurons for neurological disorders

Direct reprogramming of somatic cells into neurons or neural stem cells is one of the most important fron-tier ifelds in current neuroscience research. Without undergoing the pluripotency stage, induced neurons or induced neural stem cells are a safer and timelier manner resource in comparison to those derived from induced pluripotent stem cells. In this prospective, we review the recent advances in generation of induced neurons and induced neural stem cellsin vitro andin vivo and their potential treatments of neurological disorders.     

快速老化与正常老化小鼠脑内神经干细胞增殖的差异**★

背景：在老化过程中，脑内环境改变可引起脑内神经干细胞增殖能力改变。脑内神经干细胞与衰老和退行性神经病变疾病密切相关，增殖能力与年龄存在负相关，但以快速老化小鼠为衰老模型的相关研究未见报道。 目的：比较快速老化与正常老化小鼠嗅球、海马、皮质神经干细胞增殖的差异。 方法：分别取6只快速老化小鼠(SAMP8)和6只正常老化小鼠(SAMR1)的嗅球、海马、皮质组织，在固定、冰冻切片后，运用Ki-67/Nestin免疫荧光双标检测3个脑区的神经干细胞增殖情况。免疫荧光双标在荧光显微镜下通过Leica Qwin v3采图，在40倍物镜和10倍目镜下采图，每一张切片随机选取5 个相邻视野，通过Image-pro-Plus软件完成图像分析。 结果与结论：正常老化小鼠和快速老化小鼠均有神经干细胞增殖现象，但二者存在差异，其差异主要表现在海马和嗅球两个脑区(P < 0.05)。提示快速老化可能会导致海马、嗅球神经干细胞增殖能力降低。     

稳定增殖神经干细胞的实验研究

目的探讨稳定、可靠建立神经干细胞体外增殖的方法,并对增殖培养的细胞进行鉴定。方法获取胚胎大鼠的脑组织,通过加入神经生长因子和采用保留细胞联系技术操作,使脑组织中的神经干细胞在体外克隆增殖并稳定传代。以免疫荧光方法对增殖克隆的神经干细胞球进行鉴定。结果神经干细胞不断增殖形成神经干细胞球且神经干细胞能快速稳定传代增殖。培养的细胞为神经干细胞特异性巢蛋白(nestin)染色阳性细胞。结论在神经生长因子的作用下,利用保留细胞联系技术操作,神经干细胞可以在体外快速、稳定克隆增殖并传代。     

神经干细胞分化为神经元的基因调控(英文)

神经干细胞的研究进展为神经退行性病变和神经系统损伤的功能重建带来了令人振奋的希望。促使神经干细胞定向分化成所需神经元是实现神经干细胞临床应用的重要关键。目前对神经干细胞分化的分子机制还没有完全阐明。神经干细胞的分化与一系列因素促进转录因子表达有关,这些因子启动中枢神经系统基因表达程序从而导致神经干细胞向不同谱系分化。本文对神经干细胞分化为神经元过程中的基因调控的最新研究进展作一综述。     

神经干细胞分化为神经元的基因调控

神经干细胞的研究进展为神经退行性病变和神经系统损伤的功能重建带来了令人振奋的希望。促使神经干细胞定向分化成所需神经元是实现神经干细胞临床应用的重要关键。目前对神经干细胞分化的分子机制还没有完全阐明。神经干细胞的分化与一系列因素促进转录因子表达有关,这些因子启动中枢神经系统基因表达程序从而导致神经干细胞向不同谱系分化。本文对神经干细胞分化为神经元过程中的基因调控的最新研究进展作一综述。