肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺样毒素Ⅱ毒素亚单位Stx2A的表达与纯化

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7志贺样毒素A亚单位(Shiga-like toxin,Stx2A),并对其初步纯化.方法设计引物采用PCR法自EHEC O157:H7基因组扩增Stx2A的编码基因stx2a,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-11c(+)-stx2a,经测序鉴定后转化E.coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDSPAGE和Westen blot分析目的蛋白的表达,并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白.结果扩增的stx2a基因约950bp;原核表达质粒pET-11c(+)-stx2a经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在E.coli.BL21(DE3)中得到高效表达,蛋白表达率约30%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量约31×103;经固相镍离子亲和层析纯化后,蛋白纯度可达92.3%.结论EHEC O157:H7 Stx2A的高效表达与初步纯化,为探讨O157:H7菌的感染机制奠定基础.     

肠出血性大肠杆菌O157P:H7紧密黏附素的基因克隆、表达及功能研究

目的 获得高纯度的eae基因表达蛋白紧密黏附素(Intimin),研究其黏附作用.方法 从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7全基因组中扩增出eae基因,T-A克隆后,将eae插入载体pET28a(+),并转化至E.coli BL21(DE3)中表达;用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出重组蛋白;SDS-PAGE检测目的 蛋白相对分子质量,免疫印记分析其免疫反应性,免疫荧光检测其黏附性.结果 获得了大小约2805 bp的eae片段;构建r重组载体pET28a(+)-eae,并在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达Intimin,Mr约97 000;Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出Intimin;大肠杆菌O157:H7多抗血清在Mr约97 000处检测出一条特异性Intimin带;Intimin可黏附在HEp-2细胞表面.结论 高纯度的重组蛋白Intimin具有一定的免疫反应性,能与HEp-2细胞黏附,为进一步研究Intimin蛋白与宿主受体蛋白的相互作用奠定基础.     

肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密黏附素的基因克隆、表达及功能研究

目的 获得高纯度的eae基因表达蛋白紧密黏附素(Intimin),研究其黏附作用.方法 从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7全基因组中扩增出eae基因,T-A克隆后,将eae插入载体pET28a(+),并转化至E.coli BL21(DE3)中表达;用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出重组蛋白;SDS-PAGE检测目的 蛋白相对分子质量,免疫印记分析其免疫反应性,免疫荧光检测其黏附性.结果 获得了大小约2805 bp的eae片段;构建r重组载体pET28a(+)-eae,并在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达Intimin,Mr约97 000;Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出Intimin;大肠杆菌O157:H7多抗血清在Mr约97 000处检测出一条特异性Intimin带;Intimin可黏附在HEp-2细胞表面.结论 高纯度的重组蛋白Intimin具有一定的免疫反应性,能与HEp-2细胞黏附,为进一步研究Intimin蛋白与宿主受体蛋白的相互作用奠定基础.     

肠出血性大肠杆菌O157:H7感染的研究进展

ＷＨＯ不久前指出在过去的 2 0年里 ,世界上出现了大约 30种新的传染病 ,1982年美国首次报告的Ｏ15 7:Ｈ7大肠埃希氏菌 (ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＯ15 7:Ｈ7)引起的出血性肠炎即是其中之一。肠出血性大肠埃希氏菌 (Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒ ｈａｇｉｃＥ .Ｃｏｌｉ,ＥＨＥＣ)是大肠埃希氏菌众多血清型中非常重要的一组 ,其中目前公认的能引起人血性腹泻的血清型有Ｏ15 7:Ｈ7、Ｏ2 6 :Ｈ11、Ｏ111:Ｈ8等 ,而Ｏ15 7:Ｈ7则是其主要的血清型[1] 。近年来 ,ＥＨＥＣ感染已成为世界性卫生问题。由Ｏ15 7:Ｈ7引起的食物中毒的暴发流行在发…     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7志贺样毒素Ⅱ毒素亚单位Stx2A的表达与纯化

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(Enterohem orrhagic Escherichia col,i EHEC)O157∶H7志贺样毒素A亚单位(Sh iga-like toxin,Stx2A),并对其初步纯化。方法设计引物采用PCR法自EHEC O157∶H7基因组扩增Stx2A的编码基因stx2 a,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-11 c( )-stx2 a,经测序鉴定后转化E.coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDS-PAGE和W esten b lot分析目的蛋白的表达,并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白。结果扩增的stx2 a基因约950bp;原核表达质粒pET-11 c( )-stx2 a经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在E.coli.BL21(DE3)中得到高效表达,蛋白表达率约30%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量约31×103;经固相镍离子亲和层析纯化后,蛋白纯度可达92.3%。结论EHEC O157∶H7 Stx2A的高效表达与初步纯化,为探讨O157∶H7菌的感染机制奠定基础。     

大肠杆菌表达rhIL—8的纯化和生物学活性鉴定

应用钙盐沉淀法将ｈＩＬ－８重组质粒ｐＨＮＰ１０１转化感觉态大肠杆菌ＨＢ１０１，转化菌经扩增培养，其包涵体及胞浆内均发现有重组蛋白的表达（约１０：１），表达蛋白经初步分离，肝素柱，离子交换柱和凝胶柱进一步纯化，获得了高纯度的ｒｈＩＬ－８（〉９５％），纯化的ｒｈＩＬ－８在新西兰兔体内白细胞动员试验中显示了较高的生物学活性。     

肠出血性大肠杆菌O157：H7感染性腹泻

肠出血性大肠杆菌 (ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃＥ .Ｃｏｌｉ,ＥＨＥＣ)因其引起出血性肠炎 (ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｃｏｌｉｔｉｓ,ＨＣ)而得名 ,Ｏ1 5 7∶Ｈ7是最主要的血清型之一 ,其它血清型还包括Ｏ2 6∶Ｈ1 1、Ｏ1 1 1∶Ｈ8等十余种。Ｏ1 5 7∶Ｈ7是目前与ＨＣ及溶血性尿毒综合征 (ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｒｅｍｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅ,ＨＵＳ)有关的主要病原菌。该菌主要通过食物传播[1] 。 1 982年首次在美国爆发ＨＣ中分离出病原菌以来 ,在发达国家已发生多次流行 ,主要分布在北欧、日本、加拿大、美国等地 ,年发生人数为 8/1…     

肠出血性大肠杆菌O157：H7体外抑杀的实验研究

本文报道了临床常用抗生素和生活中常用植物果蔬类对肠出血性大肠杆菌O_(157):H_7的体外抑杀作用,研究发现蒜头液汁具有极强的抑杀效果。药物敏感试验表明,O_(157):H_7大肠杆菌对新霉素、链霉素、氯霉素、复方新诺明和呋喃妥因等高度敏感。     

PD-L1蛋白的表达、纯化与鉴定

目的克隆人PD-L1的基因,纯化Flp-In CHO系统表达PD-L1蛋白.方法用RT-PCR方法制备PD-L1基因,以哺乳细胞高效表达质粒载体pSec/WG为载体构建重组PD-L1/pSec/WG质粒,重组体用载体上的通用引物为测序引物,鉴定克隆的正确性.再将鉴定过的重组质粒用脂质体法转化转染Flp-In CHO细胞收集上清,G蛋白亲和层析法纯化蛋白.用免疫印迹法鉴定转化细胞所分泌上清的PD-L1基因的表达.结果正确构建了PD-L1/pSec/WG重组质粒,并且在转化细胞所分泌的上清中检测出了PD-L1基因的表达.亲和层析法成功纯化出PD-L1蛋白,分子量为40×10 3.结论成功地构建了PD-L1/pSec/WG重组质粒,纯化出PD-L1蛋白,可进行下一步mAb制备,进一步研究其功能.     

CTLA-4/Ig融合蛋白在COS-7中的表达、纯化及鉴定

探讨ＰＣＴＬＡ－４／Ｉｇ融合蛋白表达载体在哺乳动物细胞中的表达及表达产物的鉴定,纯化为其功能研究和临床应用奠定基础。方法将ｐＣＴＬＡ－４／Ｉｇ表达质粒转染ＣＯＳ－７细胞,双抗体夹心ＥＬＩＳＡ检测细胞培养上清中融合蛋白表达：ＰｒｏｔｅｉｎＡ亲和层析纯化,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹、＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入等进行分子量,纯度、抗原特异性及生物知性鉴定。结果在ＰＣＴＬＡ－４／Ｉｇ质粒转染后的４８ｈ的     

GST-p16融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的利用GST融合基因表达系统表达、纯化及鉴定GST-p16融合蛋白。方法以质粒pM-p16为模板,扩增出p16基因片段,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1,将所构建的重组质粒pGEX-p16转化大肠杆菌B121并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约42kD蛋白,其分子量与GST-p16融合蛋白相符。Westernblot结果显示该蛋白能够被p16．抗体特异性识别。结论本实验在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GSTipl6融合蛋白并可用于以后的实验研究。     

肝型脂肪酸结合蛋白基因的原核表达、纯化和鉴定

目的 克隆肝型脂肪酸结合蛋白(LFABP)基因,构建其原核表达载体,并进行表达、纯化及鉴定.方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法从cDNA中扩增出LFABP基因片段,通过酶切和连接,构建原核表达载体pET-m-LFABP,转化入E.Coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达;应用亲和层析、凝胶过滤层析和 Lipidex1000 凝胶层析分级纯化目的蛋白.圆二色谱分析检测目的蛋白的二级结构和热稳定性.结果 SDS-PAGE 分析表明,表达产物的相对分子质量约为15×103,与理论值相一致;应用亲和层析、凝胶过滤层析和 Lipidex1000 凝胶层析分级纯化目的蛋白,得到纯度较高的蛋白.蛋白的圆二色谱分析表明在大肠杆菌中表达的LFABP蛋白可以形成正确的折叠,热稳定性检测结果表明 LFABP 蛋白在高温下具有较高的稳定性.结论 利用大肠杆菌表达系统,获得了较高纯度的目的蛋白,为进一步研究脂肪酸结合蛋白 LFABP 的生物学特性、参与脂肪酸代谢调控及其机制研究、与药物的相互作用提供重要基础和研究依据,并将为相关疾病的治疗奠定基础.     

Escherichia coli 0157: H7 — Two case reports

Since the early 1980s the reports of infection and illness associated withEscherichia coli 0157:H7 have increased dramatically worldwide, and particularly in the USA, Canada and UK. The spectrum of disease varies from asymptomatic carriage to haemorrhagic colitis and haemolytic uraemic syndrome (HUS). This infection is new to Ireland, and we report on 2 cases of isolation which outline the presentation of this organism with haemorrhagic colitis and HUS.     

PTD-mLumin-HMGB1 A原核蛋白的表达、纯化及初步鉴定

目的： 构建含有蛋白转导结构域(protein transduction domain, PTD)和荧光蛋白mLumin的人HMGB1 A 盒原核表达载体,表达并纯化PTD-mLumin-HMGB1 A融合蛋白。方法： 利用基因重组技术构建pET28a- PTD-mLumin-HMGB1 A融合蛋白原核表达载体,并在大肠埃希菌 Rosette(DE3)中表达融合蛋白,经Ni2+分离柱纯化PTD-mLumin-HMGB1 A融合蛋白,激光共聚焦显微镜观察其穿膜能力。结果： 成功构建了PTD-mLumin-HMGB1 A原核表达载体,并表达和纯化了PTD-mLumin-HMGB1 A融合蛋白,该融合蛋白能高效地穿过细胞膜进入细胞内。结论： 成功地表达和纯化了PTD-mLumin-HMGB1 A融合蛋白,此融合蛋白具有良好的穿膜能力,为更好地研究HMGB1 A的细胞内定位和体内定位提供了重要的依据。