瞬时性受体电位通道香草酸受体亚型6基因敲除小鼠模型的建立

目的 建立Trpv6基因剔除小鼠模型,为在体研究Trpv6的生物学功能及其与骨代谢关系创造条件。 方法 从Ensembl数据库中获得小鼠Trpv6基因组序列。设计基因剔除策略,构建基因剔除载体pBR322-MK-Trpv6。以电穿孔方法将基因剔除载体导入ES细胞,用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得双抗性克隆。PCR鉴定出正确同源重组的胚胎多能干细胞（ES细胞）克隆。将正确同源重组的ES细胞注射到C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得嵌合体小鼠。挑选嵌合率在50%的雄鼠与C57BL/6J小鼠交配,获得的灰鼠,PCR鉴定为杂合子小鼠。杂合子小鼠交配后获得纯合子小鼠。 结果 成功构建了打靶载体pBR322-MK-Trpv6。电穿孔后,共获得24个正确同源重组的克隆,同源重组效率为25%。同源重组的克隆经显微注射后,共获得4只嵌合率大于50%的雄鼠。嵌合鼠与野生型C57BL/6J交配,获得57只来源于ES细胞的灰鼠,PCR鉴定证实17只为杂合子小鼠,阳性率为33.3％。杂合子小鼠交配获得纯合子小鼠。经Western印迹证实纯合子小鼠无Trpv6蛋白的表达。 结论 已成功建立了Trpv6基因剔除小鼠模型,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象。     

低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型的构建

目的构建低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型。方法将Cchl1a3-knock-in打靶载体电转染ES细胞,经过G418和Ganciclovoir筛选阳性ES细胞克隆并用PCR和DNA测序法鉴定。将阳性ES克隆注射到小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠。通过杂交获得的杂合子小鼠与FLP小鼠交配繁育获得去neo杂合子小鼠,并用PCR和DNA测序进行鉴定。将去neo杂合子小鼠交配得到纯合子后代,进行生长发育等方面的观察。结果打靶载体成功转染ES细胞,PCR和DNA测序法证实9个ES细胞克隆发生正确的同源重组。通过显微注射获得7只嵌合体小鼠。将嵌合体小鼠交配繁育的杂合子小鼠和FLP小鼠交配获得9只去neo杂合子小鼠,最终得到15只去neo纯合子小鼠。该小鼠在发育至性成熟阶段,精神、饮食及活动状态良好,但是在4个月龄时逐渐出现脱毛,皮肤破溃甚至死亡。结论成功构建Cchl1a3基因R528H突变的纯合子小鼠,为研究人类CACNA1S基因功能和阐明低钾型周期性麻痹发生的分子机制奠定了基础。     

Sumf2条件性基因剔除小鼠模型的建立及初步表型分析

目的建立Sumf2条件性基因剔除小鼠模型,为整体水平研究Sumf2基因的生物学功能创造条件。方法运用生物信息学,采用ET克隆、同源重组、显微注射等技术成功建立Sumf2条件性基因剔除小鼠模型,并通过该模型与Ella-cre转基因小鼠交配,获得Sumf2基因剔除小鼠模型,通过PCR、RT-PCR、WesternBlot等方法在不同水平验证Sumf2基因的表达;对该小鼠模型进行初步的表型分析。结果经胚胎干细胞打靶,获得19个正确同源重组的克隆,重组效率为20％：阳性克隆经囊胚注射,获得2只嵌合体雄鼠;嵌合雄鼠与C57BL／6J小鼠交配,获得28只灰鼠,经PCR鉴定16只为杂合子小鼠,阳性率为57％;与Ella—ere转基因小鼠交配,获得了Sumf2基因剔除小鼠模型,DNA、RNA及蛋白水平证明该基因已成功剔除;初步的表型观察未发现Sumf2基因剔除小鼠生长发育、血常规及血生化指标等出现异常改变。结论成功建立Sumf2条件性基因剔除小鼠模型,该基因纯合缺失未发现明显的生长发育异常,为进一步的基因功能研究奠定了基础。     

Brevican基因敲除小鼠的制备

目的制备brevican基因敲除小鼠。方法采用ET克隆方法,构建brevican打靶载体。线性化打靶载体,电转化胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES),将正确同源重组的ES细胞注射入囊胚腔,生育嵌合体,再交配繁育杂合子及纯合子。PCR法鉴定小鼠的基因型。结果将PGK启动子指导的NEO表达框敲进Bcan第3外显子,敲除第3～8外显子序列,得到打靶载体,上游臂为2.4 kb,下游臂为4.8 kb。基因打靶后,得到双臂均发生正确同源重组的克隆数14个。利用阳性ES细胞克隆注射入囊胚,得到3只嵌合率大于50%的雄鼠,繁育得到6只Brevican-/-纯合子小鼠。结论利用同源重组方法,成功敲除干细胞靶基因,建立Brevican-/-建系小鼠。     

Rtn4-A/B基因敲除小鼠模型的制备

目的通过制备Rtn4-A/B基因敲除小鼠,探索Rtn4-B基因的生物学功能。方法用细菌人工染色体(BAC)载体构建Rtn4-A/B基因打靶载体并使其线性化,通过电转化法将其转入129SvEv品系雄性小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)。将正确同源重组的ES细胞注射入C57BL/6J小鼠囊胚腔,繁育出嵌合体小鼠后,进一步繁殖以获得杂合子小鼠。抽提小鼠尾尖组织DNA,采用PCR法鉴定小鼠的基因型。结果基因打靶后,得到14个发生双臂正确同源重组ES细胞克隆。利用阳性ES细胞克隆进行囊胚内显微注射,得到5只嵌合率大于50%的雄鼠,最终繁育得到4只Rtn4-A+/-B+/-杂合子小鼠。结论利用ES细胞基因打靶、同源重组等方法,成功获得Rtn4-A/B基因敲除杂合子小鼠。     

微小RNA簇miR-302s条件性基因打靶小鼠的制备和鉴定

目的 制备微小RNA簇miR-302s条件性基因打靶小鼠.方法 构建miR-302s打靶载体,通过电穿孔的方法转染胚胎干细胞(ES细胞),用正负筛选法筛选阳性ES细胞并进行PCR鉴定和Southern分析.利用显微注射技术将正确同源重组的ES细胞注射至B6(Cg)-Tyr＜sup＞c-2J＜/sup＞/J小鼠囊胚腔内,注射后的囊胚植入受体小鼠子宫.将得到的嵌合体小鼠与野生型雌鼠交配获得miR-302s-LoxP基因打靶小鼠.结果 获得嵌合体小鼠11只,其中4只嵌合雄鼠嵌合率＞50％.利用嵌合体小鼠进行繁育交配,得到miR-302s基因打靶杂合子小鼠11只.结论 成功建立miR-302s条件性基因打靶小鼠模型,为进一步研究miR-302s基因功能打下基础.     

基于Cre/loxP系统的糖皮质激素受体基因条件性打靶嵌合鼠的获得

目的:应用Cre/loxP系统建立诱导型糖皮质激素受体(GR)基因剔除小鼠模型,为在体内直接进行GR基因的研究提供条件.方法:针对GR基因第2外显子构建诱导型目标载体,将打靶载体电穿孔转染胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES),经Southern杂交筛选发生正确同源重组的ES细胞,囊胚注射法制备嵌合体并进行生殖系检测及纯化建系.结果:成功构建了针对GR基因第2外显子的诱导型目标载体,转染ES细胞获得了工程化的ES细胞,经囊胚注射获得了由工程化的ES细胞和体细胞共同发育而来的嵌合体小鼠.结论:基于Cre/loxP系统的GR基因条件性打靶嵌合鼠的获得,为得到理想的诱导型GR基因剔除小鼠模型奠定了基础.     

HIF-1α条件性基因敲除嵌合体小鼠的获得

目的应用Cre/loxP系统建立HIF-1α条件性基因敲除小鼠模型。方法电击法将构建好的HIF-1α条件性基因敲除载体转染入小鼠ES细胞,用G418与Ganciclovir对转染的ES细胞进行正负筛选,经Southern杂交鉴定得到阳性ES细胞克隆后,将已发生正确重组的ES细胞显微注射入小鼠囊胚腔,对子代鼠进行基因型鉴定。结果经G418与Gan-ciclovir筛选培养得到490个阳性克隆,用5′端探针进行Southern杂交鉴定获得1株发生同源重组的ES细胞克隆,经显微注射,得到5只由基因敲除ES细胞和供体囊胚细胞共同发育而来的嵌合体小鼠。结论成功得到基于Cre/loxP系统的HIF-1α条件性基因敲除嵌合体小鼠模型。     

小鼠胚胎干细胞凝血因子IX基因的定向敲除

目的:将小鼠胚胎干细胞中凝血因子Ⅸ(mFⅨ)基因定向敲除,为建立血友病B的转基因小鼠模型奠定基础;摸索建立ES细胞基因打靶技术体系.方法:将线性化的针对小鼠mFⅨ基因组的基因打靶置换型载体(pMFⅨDEL)DNA用电穿孔法转入小鼠ES细胞,经过G418和GANC分组药物选择,用PCR和基因组Southern杂交两种方法,鉴定药物抗性细胞中发生同源重组的情况.结果:(1)从药物抗性细胞克隆中鉴定获得了4个发生了按所设计的方式进行了同源重组的ES细胞克隆;(2)观察到在Es细胞中,pMFⅨDEL载体DNA与内源mFⅨ基因发生同源重组的频率平均为1.67×10-6.结论:得到了4个mFⅨ基因已被敲除的ES细胞克隆;建立了ES细胞基因打靶的技术体系.     

心肌乙酰胆碱敏感钾通道基因敲除小鼠模型的建立

目的建立Kcnj5基因敲除小鼠模型,构建病理生理或药理实验平台,以确定钾通道和东莨菪碱等药物和心衰治疗的关系。方法用细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC）载体构建了缸面5打靶载体,电穿孔到129／S6／SvEv品系雄性小鼠的胚胎干细胞SCR012后,用300μg／mlG418、2μmol／LGanC筛选克隆8d。打靶后的干细胞显微注射到囊胚后．生育嵌合体再交配繁育杂合子及纯合子。用PCR方法结合片段克隆后基因测序鉴定基因型。免疫组化法证实基因型的表达。结果挑取抗性克隆96个中正确同源克隆数20个,阳性率为20．8％。显微注射C57BL／6J囊胚180枚．14只受体出生12只小鼠中得到4只大于50％嵌合率雄鼠。配育获得29只尉r3．4 1代杂合子。现繁育F4后代获得尉r3．4＇纯合子约百只。用单抗对敲除鼠心进行免疫组化鉴定,提示纯合子敲除鼠心为阴性。结论用同源重组法敲除了干细胞靶基因,成功建立腼r3．4‘建立鼠系。成功建立鲋r3．4钾通道分子病动物模型。该基因的完全缺如模型有利于隔离了该基因的作用,对与之相关的基因的进一步阻断、拈抗或激活等药物研究．也是一个很好的模型。     

小鼠MPI基因的打靶载体的构建和筛选

目的　构建小鼠MPI基因的基因打靶载体转染ES细胞 ,构建用于同源重组筛选的对照载体。方法根据计算机分析小鼠MPI基因的基因组序列 ,构建用于同源重组载体的长臂和短臂并且转染小鼠ES细胞 ,经抗性筛选后得到阳性克隆 ,抽提基因组DNA后用PCR的方法进行重组子的初步筛选。结果　成功构建了MPI基因的基因打靶载体并且摸索了用PCR的方法进行重组细胞初步筛选的方法。结论　这个载体的构建为MPI基因功能的研究打下了基础 ,同时用PCR方法进行初步筛选大大减少了Southern杂交的工作量 ;利用实验小鼠来研究印迹基因是非常有效的方法 ,它不仅能了解印迹基因在小鼠生长发育过程中的功能 ,而且进而有助于研究人的相应印迹区。     

碳水化合物反应元件结合蛋白条件性基因敲除小鼠模型的建立及鉴定

目的 建立转录因子碳水化合物反应元件结合蛋白（ChREBP）的条件性基因敲除小鼠模型,为研究ChREBP的体内生物学功能提供技术手段。方法和结果 利用Cre/loxP基因打靶策略,通过构建基因打靶载体和基于胚胎干细胞（ES细胞）的基因同源重组,在ChREBP基因第8外显子的两侧分别引入loxP位点;将打靶成功的ES细胞显微注射至小鼠囊胚,然后植入假孕雌鼠子宫获得嵌合鼠,进一步获得可种系传代的ChREBP^flox/+小鼠;将ChREBP^flox/+小鼠与Alb-Cre小鼠交配,获得ChREBP的肝脏特异性基因敲除小鼠。结论 建立了ChREBP条件性基因敲除小鼠模型,为揭示不同组织中ChREBP的生理功能和病理学意义提供了重要手段。     

基于Cre重组酶体系的小鼠HPRT定点整合打靶载体的构建及其应用

目的：构建带有Cre重组酶识别位点变异体lox66的针对小鼠HPRT基因的基因打靶载体,并用于小鼠胚胎干细胞基因打靶研究。方法：利用含HPRT基因组DNA片段的质粒pMP8和人工合成含lox66序列的寡核苷酸,构建含Cre重组酶识别位点变异体lox66的置换型打靶载体,经过限制性内切酶酶切鉴定其结构正确后,用电穿孔法对小鼠胚胎干细胞R1株进行基因转染,经G418／6－TG（6－thioguanine)分组药物筛选,进行pSP-HPRT-lox66-Neo载体的应用研究。结果：得到了与设计一臻的置换型打靶载体pSP-HPRT-lox66-Neo;将线性化的打靶载体导入ES细胞后,能与靶位点有效地发生同源重组,获得了20个靶基因被灭活了的ES细胞克隆。结论：此研究成功构建了含Cre重组酶识别位点变异位lox66针对小鼠HPRT基因位点的置换型打靶载体,在胚胎干细胞基因打勒中得到有效的应用。     

Trp53基因剔除小鼠的制备及其在药物致癌性评价中的应用

目的建立Trp53基因剔除小鼠模型。方法本研究拟通过基因工程技术建立Trp53基因剔除小鼠模型,通过RT—PCR、Western—blot等技术检测野生型、杂合子、纯合子小鼠中Trp53基因的表达;观察三种基因型小鼠自发肿瘤情况并进行病理分析;以N．甲基亚硝基脲（MNU）为致癌剂,探索该模型用于药物致癌性评价的可行性。结果DNA、RNA及蛋白水平的研究证实,已成功获得Trp53基因剔除小鼠模型。初步的表型分析显示：Trp53基因纯合缺失小鼠自出生13周起陆续发生肿瘤,至36周时所有观察纯合小鼠均死于肿瘤,以恶性胸腺淋巴瘤为主（60％）。与野生型小鼠相比,基因杂合缺失小鼠对致癌剂的敏感性显著提升,杂合小鼠经75mg／kg体重的N一甲基亚硝基脲（MNU）诱导,90％的小鼠发生肿瘤,其中86％为恶性胸腺淋巴瘤,而野生小鼠经药物诱导后只有60％发生肿瘤。腹腔注射枸橼酸缓冲液的80只对照组小鼠均未观察到肿瘤的发生。结论这一模型的建立为Trp53基因功能研究和药物致癌性评价提供了理想的动物模型。     

小鼠PKD1基因的克隆及打靶载体的构建

目的：克隆小鼠的多囊肾病１（ＰＫＤ１）基因,构建ＰＫＤ１基因的Ｋｎｏｃｋｏｕｔ载体,为产生ＰＫＤ１基因缺陷小鼠品系准备条件。方法;以正常小鼠基因组ＤＮＡ为模板,扩增小鼠ＰＫＤ１基因部分序列为探针,应用噬斑原位杂交技术筛选１２９ＳｖＴｅｒ小鼠基因组ＤＮＡ库,并应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,亚克隆及测序等方法鉴定所得克隆。对克隆到的ＰＫＤ１基因组ＤＮＡ片段进行结构分析,选择合适的亚克隆片段,以ｐＴＫ－Ｎ