三种检测乙型肝炎病毒YMDD自然变异方法的比较

目的筛选一种特异性及灵敏性较高的检测乙型肝炎病毒YMDD自然变异的方法。方法通过分子克隆的方法,构建YMDD、YVDD及YIDD三种质粒;通过检测不同比例混合的质粒,比较PCR产物直接测序法、单探针特异性荧光PCR技术及引物特异性荧光PCR技术三种检测方法。结果经酶切鉴定及直接测序鉴定,显示三种质粒构建成功;当待测模板占总模板的比例大于20%时,直接测序法才能准确检测;当突变株占总毒株的比例占50/51时,单探针特异性荧光PCR法才能判定该样品为YMDD变异型;当突变株占总毒株的比例高于1/11时,引物特异性荧光PCR技术非特异结合的影响可忽略,具有很好的特异性,同时具有较高的灵敏性,检测突变株占总毒株的最低比例可达到1/11。结论引物特异性荧光PCR技术特异性及灵敏性较高,适合用于乙型肝炎病毒YMDD自然突变株的检测。     

慢性HBV感染YMDD自然变异的研究进展

HBV DNA聚合酶(polymerase,P)的变异主要发生在YMDD区域,并与拉米夫定的耐药有关.尽管这些变异株会在应用拉米夫定之后出现,但是他们也会自然产生.很多学者都已证实了YMDD自然变异株的存在.目前检测YMDD变异的方法有多种,但还没有一个完全统一的方法.HBV YMDD变异可能与HBVDNA水平及其基因型等有一定的关系.     

基因芯片技术检测乙型肝炎病毒YMDD变异

核苷类似物拉米夫定(3TC)治疗慢性乙型肝炎(CHB)过程中,乙型肝炎病毒(HBV)P基因YMDD基序中的甲硫氨酸密码子(M)易突变为缬氨酸(V)或异亮氨酸(I),形成YMDD变异的两种氨基酸序列,即YVDD和YIDD。国内外研究发现[1,2],YMDD基序变异与拉米夫定耐药、肝炎复发有密切关系。我们采用HBV基因多态性芯片检测技术,对102例长期用拉米夫定治疗CHB患者血清进行了检测,进一步探讨YMDD变异与临床的关系。材料和方法一、临床资料102例为2002年7月～2002年12月就诊于我科门诊患者,服用拉米夫定(100mg/d)时间在9～30个月者,其中男70例,女32例,…     

拉米夫定治疗前后乙型肝炎病毒YMDD变异的相关因素分析

目的 了解遵义地区HBV基因型以及拉米夫定治疗前后发生YMDD变异的相关因素,及早进行拉米夫定疗效及耐药的预测. 方法 53例慢性乙型肝炎患者分别在口服拉米夫定前及治疗后3、6、12、18、24个月进行血清HBV DNA定量、乙型肝炎标志物、ALT、AST、总胆红素,白蛋白的检测.同时在接受拉米夫定治疗前采用基因测序法检测HBV基因型及YMDD变异株,治疗后HBV DNA定量下降又反弹升高,且血清HBV DNA＞1×104拷贝/ml时,再次进行YMDD变异株检测.率的比较用卡方检验及确切概率法,两组均数之间比较采用独立样本t检验,有序变量之间的比较采用秩和检验.结果 遵义地区的HBV基因型由B、C及B+C基因型构成.拉米夫定治疗后18例检出YMDD变异株,用药1年和2年的变异率分别为15.1%和34.0%.HBV突变类型有rtL180M/M204V、rtL180M/M204I、rtM204I和rtL180M四种,其中C区rtM204V全部合并rtL180M突变(100%),C基因型中rtL180M/M204V联合突变及rtL180M/M204I联合突变明显高于B基因型(77.8%比25.0%及22.2%比12.5%);C基因型中未见点突变,而rtM204I、rtL180M的点突变仅见于B基因型.YMDD变异与未变异组性别、民族、乙型肝炎家族史及HBeAg情况差异无统计学意义(P＞0.05),病程≥2年组和年龄＜35岁组变异率明显升高(X2值分别为4.707和5.853,P值均＜0.05).不同HBV DNA滴度患者YMDD变异率差异无统计学意义(X2=0.801,P＞0.05),但HBV DNA＜105拷贝/ml者未发现YMDD变异.结论 拉米夫定治疗后YMDD变异可能与HBV基因型及P基因突变类型有关,并随治疗时间的延长而增加.为了减少YMDD变异的发生,应选用病程短、HBV DNA水平较低、肝损害较重的患者进行拉米夫定治疗,有条件的应检测HBV基因型.     

贵阳地区乙型肝炎病毒YMDD变异与基因分型

本研究旨在了解贵阳地区乙型肝炎病毒(HBV)基因型分布，探讨YMDD耐药变异株与基因型的关系。     

未经拉米夫定治疗的乙型肝炎病毒YMDD变异检测

乙型肝炎病毒(HBV)YMDD变异被认为与拉米夫定治疗有关。为证实YMDD变异是由药物所致,还是因为其本身与野生株病毒共存,在药物作用下逐渐成为优势株,对未经治     

拉米夫定治疗前后乙型肝炎病毒YMDD变异的相关因素分析

Objective To identify factors associated with YMDD mutation in patients with chronic hepatitis B before and after Iamivudine treatment in Zunyi region.Methods 53 patients with chronic hepatitis B were enrolled in this study,HBV DNA,HBV markers,ALT,AST,TBil,albumin in the serum were examined at 0,3,6,12,18 and 24 months after lamivudine treatment.HBV genotype and YMDD mutation were determined by sequencing before lamivudine treatment.YMDD mutation was checked again if serum HBV DNA rebound to more than 1×104 copies/ml after the initial decrease.Results HBV genotype in Zunyi region iS constitute of B.C and B+C genotype.YMDD mutation occurred in 18 cases after lamivudine treatment.the rate of YMDD mutation was 15.1%,and 34.0% after 1 year and 2 years treatment.There are four types of mutation:nL180M/M204V,rtL180M/M2041,rtM204I,nL180M.rtM204V mutation in C gene was always acompanied by rtL180M mutation (100%). The rate of rtL180M/M204V mutation in genotype C group was significantly higher than that in genotype B group (77.8% to 25.0%),the same was true for the rtL180M/M204I mutation (22.2% to 12.5%). There was no point mutation in genotype C group. The point mutation of rtM204I and rtL180M appeared only in genotype B group. Gender,nation,family history of hepatitis B and HBeAg were not associated with YMDD mutation (P ＞ 0.05),while the mutation rate was associated with the disease course and severity of disease. YMDD mutation did not occure in patients with low HBV DNA level (＜105 copies/ml). Conclusion YMDD mutation after lamivudine therapy is associated with HBV gnnotype and P gene mutation type,and prolonged treatment increases the the mutation rate. In order to reduce the incidence of YMDD mutation,patients with shorter disease course,lower HBV DNA level,more serious liver damage should be treated with iamivudine.     

未抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者YMDD变异分析

我们对近1年内未经抗病毒治疗的25例慢性乙型肝炎患者进行血清乙型肝炎病毒聚合酶P区变异(YMDD)变异检测，以探讨未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者YMDD变异情况及其与HBV基因型的相关性。     

慢性乙型肝炎患者血清中病毒的YMDD自然变异

近年来,随着拉米夫定的广泛应用,部分患者出现YMDD变异而产生耐药性,最常见的有YVDD(M552V)和YIDD(M552I)变异.因此,服用拉米夫定后患者的YMDD变异成为近几年的研究热点[1-2];但有研究证实存在YMDD自然变异[3].国内目前尚缺乏大样本YMDD自然变异率的研究,我们对未经治疗的449例慢性乙型肝炎患者进行YMDD变异株的检测,探讨了不同慢性乙型肝炎患者血清中HBV YMDD的自然变异率及其与血清HBV DNA水平的关系.     

HBeAg阳性和阴性慢性乙型肝炎患者YMDD的变异

目的研究YMDD变异在HBeAg阳性和HBeAg阴性乙型肝炎病毒（HBV）感染者中发生的情况.方法对我科接受拉米夫定治疗的247例慢性乙型肝炎患者进行定期随访,检测肝功能和HBV病毒学指标,利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）检测YMDD变异,利用实时定量PCR检测HBV DNA定量以及利用Abbott试剂检测HBV标志物,对比分析HBeAg阳性和HBeAg阴性患者中YMDD变异的发生情况.结果247例患者中共有42例出现YMDD变异,YMDD变异的累积发生率随着时间的延长逐年增加.与治疗前HBeAg阴性患者相比,治疗前HBeAg阳性患者YMDD变异的发生率明显高于治疗前HBeAg阴性患者.结论HBeAg阳性患者YMDD变异年累积发生率高于HBeAg阴性患者.     

未接受抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者多聚酶P基因YMDD变异检测

目的 了解未经拉米夫定及干扰素抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者中HBV多聚酶YMDD变异情况。方法 应用错配PCR扩增方法检测病人血清HBV的YMDD位点，选择65例病史超过半年以上、肝功能异常、HBV DNA阳性的慢性乙型肝炎患者。结果 在65例患者中，YMDD变异阳性6例(9．07％)，阴性59例，6例变异中2例为YIDD阳性，其中1例为YMDD野毒株和变异株混合存在，4例为YYDD阳性，其中1例为YMDD野毒株和变异株混合存在。结论 本检测方法简便、实用，在未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者中可存在YMDD变异株，其与野生株一样是自然存在的。     

拉米夫定治疗2年时乙肝病毒的YMDD变异情况

观察核苷类似物拉米夫定治疗慢性乙肝病人２年时ＹＭＤＤ变异情况及其与血清ＨＢＶＤＮＡ，ＡＬＴ水平等指标的关系。第一阶段（１－１２周）为随机、双盲、安慰剂对照研究，７２名ＨＢｓＡｇ．ＨＢｅＡｇ阳性至少６个月，ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性的慢性乙肝患者分别口服拉米夫定１００ｍｇ／ｄ（ｎ＝５４）或安慰剂（ｎ＝１８）；第二阶段（１３－１０４周）所有患者均服用拉米夫定 １００ｇ／ｄ。５２周和 １０４周检查病毒的 ＹＭＤＤ变异．其总变异率分别为 １３．７％（８／５８）和 ３９．７％（２３／５８）。１０４周时变异组血清 ＨＢＶＤＮＡ，ＡＬＴ水平高于无变异组（３９４．９±７２７．９比 １６．３±５０．９，Ｐ＝０．００４８；６２．７±５７．９比２６ ４±２７．５，Ｐ＝０．００３），ＨＢＶＤＮＡ阴转率低于未变异组（１７．４％比４８．６％，Ｐ＜０．０５）；服用拉米夫定的慢性乙肝患者的ＹＭＤＤ发生率与服药时间长短有关，血清ＨＢＶＤＮＡ及ＡＬＴ水平与ＹＭＤＤ相关。     

乙型肝炎病毒基因型、YMDD变异与拉米夫定治疗后HBV DNA反弹关系的研究

目的探讨HBV基因型、YMDD变异与拉米夫定抗病毒治疗后HBV DNA反弹的关系。方法应用多引物对巢式PCR法、PCR-序列分析法检测拉米夫定治疗的27例乙型肝炎患者和19例从未用过抗病毒治疗的患者HBV基因型和P区（YMDD）的突变位点。结果在27例HBV DNA反弹的患者中，13例（48．15％）检出YMDD变异，而对照人群无YMDD变异（P〈0．05）。YMDD变异的位点为rtM204V／I（C区）±rtL180M（B区）；在治疗组YMDD变异的患者中，B、C基因型构成比（46．15％和59．26％）与对照组（53．85％和68．42％）比较无显著性差异（P〉0．05）。结论YMDD变异是拉米夫定治疗后出现耐药导致HBV DNA反弹的主要原因；YMDD变异的常见位点依然为rtM204V／I（C区）±rtL180M（B区）；YMDD变异在B、C基因型病人中无差别。     

乙型肝炎病毒YMDD变异对临床病情的影响

目的　研究拉米夫定治疗乙型肝炎出现YMDD变异后对临床病情及病毒量的影响 ,以及YMDD变异与前C区变异的相关性。方法　对 13 5例曾用过拉米夫定治疗后复发的住院病例 ,按检查结果分为两组 ,YMDD变异组 61例 ,未变异组 74例 ,对两组病情诊断、病毒载量、肝功能指标 ,YMDD变异与HBeAg、前C区变异的关系进行对照分析。结果　YMDD变异与未变异在慢性肝炎 (轻度 )分别为 9.8% ( 6/ 61)与 8.1% ( 6/ 74)、慢性肝炎 (中度 )分别为 44 .3 % ( 2 7/ 61)与 48.6% ( 3 6/ 74)、慢性肝炎 (重度 )分别为 2 6.2 % ( 16/ 61)与 2 9.7% ( 2 2 / 74)、慢性重型肝炎分别为 9.8% ( 6/ 61)与 14 .9%( 11/ 74)、肝硬化分别为 4.9% ( 3 / 61)与 10 .8% ( 8/ 74) ,各组比较均无显著性差异 (P >0 .0 5 )。两组病毒载量 <1×10 4copies/ml者分别为 1.6% ( 1/ 16)与 2 0 .3 % ( 15 / 74,P <0 .0 1)、1× 10 4～ 10 6copies/ml者分别为 9.8% ( 6/ 61)与 2 9.7% ( 2 2 /74,P <0 .0 1)、≥ 1× 10 7copies/ml者分别为 88.5 % ( 5 4/ 61)与 5 0 .0 % ( 3 7/ 74,P <0 .0 1)。肝功能 6项指标中ALT、ALB、A/G、TBIL对比无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ,AST、PTA对比差异显著 (P <0 .0 5 )。YMDD变异组中HBeAg阳性率 68.9% ( 4 2 / 61) ,未变异     

YMDD mutations in patients with chronic hepatitis B untreated with antiviral medicines

AIM: To polymerase P region (YMDD) mutations of hepatitis B virus gene (HBV DNA) in patients with chronic hepatitis B (CHB) untreated with antiviral medicines and to explore its correlation with pre-c-zone mutations, HBV genotypes and HBV DNA level, and to observe its curative effect. METHODS: A total of 104 cases (38 cases in group of familial aggregation and 66 cases in group of non-familial aggregation) were randomly chosen from 226 patients with CHB who did not receive the treatment of lamivudine (LAM) and any other antivirus drugs within the last one year. Their serum YMDD mutations were detected by microcosmic nucleic acid and cross-nucleic acid quantitative determination, HBV genotypes by PCR-microcosmic nucleic acid crossELISA, HBV DNA quantitative determination and fluorescence ration PCR analysis, hepatitis B virus markers (HBVM) by ELISA. LAM was taken by 10 patients with YMDD mutations and its curative effect was observed. RESULTS: Twenty-eight cases (26.9%) had YMDD mutations, of them 11 cases (28.9%) were in familial aggregation group (38 cases) and 17 cases (25.8%) in nonfamilial aggregation group (66 cases) with no significant difference between the two groups. Twenty-seven point one percent (16/59) cases were positive for HBeAg YMDD mutations, and 26.7% (12/45) cases were negative for HBeAg and positive for anti-HBe. There was also no significant difference between the two groups. Different YMDD incidence rate existed in different HBV genotypes. HBV DNA level did not have a positive correlation with the incidence of YMDD mutations. LAM was effective for all patients with mutations. CONCLUSION: Wild mutant strains in HBV and their incidence rate have no significant difference between familial aggregation and non-familial aggregation. It may have no significant relationship between YMDD mutations and pre-c-zone mutations. HBV DNA level may not have a positive correlation with YMDD mutations. LAM is clinically effective for CHB patients with YMDD mutations.     

基因芯片和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法检测拉米夫定耐药的慢性乙型肝炎患者YMDD变异

目的对基因芯片和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)两种方法检测YMDD变异进行比较。方法取40例临床考虑拉米夫定耐药的患者血清，分别用基因芯片和PCR-RFLP法检测YMDD基序变异情况。随机抽取8份血清标本进行测序验证两种方法的准确性。结果40例患者血清标本中，用基因芯片法检测出YMDD变异阳性标本27例，其中，YIDD变异4例，YVDD变异16例，YVDD／YMDD共存12例；YIDD与YVDD混合变异7例。用PCR-RFLP法检测出变异阳性标本21例。在变异株中，YIDD变异和YVDD变异各9例，YIDD／YVDD混合变异3例，明显低于基因芯片的检出率。结论1、用基因芯片能快速灵敏地检测YMDD变异情况，并能检测到患者体内变异株与野生株混合存在形式；2、基因芯片能同时检测两种YMDD变异株和YMDD野生株，优于PCR-RFLP法，适用于临床检测乙型肝炎病毒YMDD变异。     

拉米夫定抗乙型肝炎病毒感染中YMDD变异类型及时间研究

目的 研究拉米夫定抗乙型肝炎病毒(HBV)感染中P基因发生YMDD变异的类型和出现时间。方法 取拉米夫定治疗过程中HBV DNA由阴性再次转为阳性33例患者及HBV DNA始终保持阳性达一年或一年以上2例患者的血清,经PCR扩增HBV的P基因,对扩增产物进行测序及用3个限制性内切酶分析HBVP基因的YMDD变异。 结果 14例出现YMDD变异,其中6例YVDD变异,4例YIDD变异,3例YI/VDD混合变异,1例YI/MDD变异。变异出现时间平均为(11.07±3.65)个月,最短5个月,最长7个月。其中YIDD为(10.00±1.41)个月,YVDD为(11.67±4.41)个月,YI/VDD为(13.33±3.31)个月,三种变异类型的出现时间差异无显著性(F=0.543,P>0.05)。3例YMDD变异后拉米夫定加量至200mg/d,未能消除变异病毒。 结论 拉米夫定抗HBV感染后变异有多种形式,包括YIDD、YVDD、YI/VDD、YI/MDD。变异发生时间一般在治疗后(11.07±3.65)个月。变异类型与用药时间无关。     

慢性乙型肝炎患者在YMDD变异后停用及继续使用拉米夫定的临床后果分析

目的　探讨YMDD变异后停用及继续使用拉米夫定对临床预后的影响。方法　观察 17例服用拉米夫定过程中出现YMDD变异而肝功能异常及 9例出现YMDD变异后停用拉米夫定肝功能异常而入院患者的临床过程。结果　前组患者的血清总胆红素、谷丙转氨酶、HBVDNA和HBeAg峰值分别为 43 .2± 61.4μmol/L、3 5 9.4± 2 66.6u/L、2 .7× 10 7± 2 .8× 10 7copies/ml和 1660 .2± 2 2 97.4PEIU/ml。经过 0 .5～ 4个月治疗 ,17例患者肝功能正常或接近正常出院 ,只有 1例发展为慢性重型肝炎。后组患者的血清总胆红素、谷丙转氨酶、HBVDNA和HBeAg峰值分别为 2 70 .6± 14 1.0 μmol/L、72 9.9± 3 97.1u/L、1.7× 10 8± 2 .4× 10 8copies/ml和 14 0 5 .4± 2 0 45 .5PEIU/ml。经过 1～ 7个月治疗 ,6例患者肝功能正常或接近正常出院 ,6例发展为慢性重型肝炎 ,其中 3例患者死亡。结论　YMDD变异后继续服用拉米夫定 ,虽有部分患者出现严重肝功能损害 ,但整体治疗难度远较停药患者容易、预后也较好。YMDD变异株转变为野生株的时间越短 ,其预后可能越差。两组患者中各有 1例使用阿德福韦取得了很好疗效