前列腺特异性膜抗原人源Fab抗体可变区基因的筛选与鉴定

目的:筛选、鉴定抗中国人前列腺特异性膜抗原(PSMA)的人源Fab抗体可变区的编码基因,为PSMA蛋白质生物学功能的研究及前列腺癌的基因治疗研究开辟新途径。方法:采用噬菌体表面展示技术,以PSMA原核表达重组子pET30 a(+)-PSMA诱导表达并纯化后的PSMA为固相抗原,从噬菌体Fab可变区抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得抗原结合活性和特异性较强的PSMA人源Fab可变区抗体基因片段的阳性克隆,并对其进行免疫检测及序列测定。结果:筛选得到Fab抗体克隆的Fd段基因核苷酸序列为696 bp,编码由232个氨基酸残基组成的多肽,与人免疫球蛋白γ链恒定区的同源性为98%;轻链κ基因核苷酸序列为630 bp,编码由210个氨基酸残基组成的多肽,与κ链恒定区同源性为93%。结论:利用噬菌体抗体库技术,成功获得了PSMA人Fab抗体可变区编码基因克隆,该克隆抗体基因具有典型的免疫球蛋白轻链和重链可变区的结构特点,基因编码产物具有与PSMA反应的免疫学活性和特异性。     

前列腺癌噬菌体抗体库的构建及抗特异性膜抗原抗体的筛选

目的建立国人前列腺癌噬菌体Fab抗体片段库，筛选、鉴定抗前列腺特异性膜抗原（PSMA）的人源Fab抗体可变区的编码基因，为前列腺癌的诊断与基因治疗研究开辟新途径。方法20例前列腺癌患者外周血分离淋巴细胞，提取其总RNA，经RTPCR及半套式扩增得到免疫球蛋白全部轻链和重链Fd段基因，克隆进载体pComb3，并电转化大肠杆菌XLl-Blue，构建前列腺癌噬菌体Fab抗体片段库。采用噬菌体表面展示技术，以PSMA原核表达重组子pET30a（＋）-PSMA诱导表达并纯化后的PSMA为固相抗原，从噬菌体Fab抗体库中经过“吸附洗脱扩增”筛选过程，获得抗原结合活性和特异性较强的PSMA人源Fab可变区抗体基因片段的阳性克隆，并进行免疫检测及序列测定。结果成功构建前列腺癌噬菌体抗体Fab片段库，其轻链及重链Fd段与载体DNA的重组率分别为87％、79％，库容为2．32×10^7，滴度为8．7×10^13pfu／ml。筛选得到Fab抗体克隆的Fd段基因核苷酸序列为696bp，编码由232个氨基酸残基组成的多肽，与人免疫球蛋白γ链恒定区的同源性为98％；轻链κ基因核苷酸序列为630bp，编码由210个氨基酸残基组成的多肽，与κ链恒定区同源性为93％。结论成功构建了前列腺癌噬菌体抗体库，并获得了PSMA人Fab抗体可变区编码基因克隆，该克隆抗体基因具有典型的免疫球蛋白轻链和重链可变区的结构特点，基因编码产物具有与PSMA反应的免疫学活性和特异性。     

人髓样细胞触发受体-1原核表达载体的构建和表达及多克隆抗体的制备

目的 构建人髓样细胞触发受体-1(TREM-1)原核表达载体使其表达并制备多克隆抗体。方法 采用特异性引物扩增人TREM-1胞外段cDNA,经酶切、连接、构建到原核表达载体pET28a(+),将构建的重组表达质粒转化入E.coli BL21( DE3)菌株,采用IPTG诱导表达、Ni-NTA 柱亲和层析纯化目的蛋白、SDS-PAGE分析蛋白纯度,将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯化及鉴定。结果 序列测定证实构建的重组表达载体pET28a(+)-TREM-1含有人TREM-1编码序列,其序列分析与Genbank中公布序列对比一致,质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为21.80 kDa的目的蛋白,SDS-PAGE分析表明纯化后的目的蛋白达到电泳纯,双向琼脂扩散法检测抗体效价为1:16,ELISA法检测抗体效价为1:25 600,Western blot分析显示抗体能特性结合人TREM-1重组蛋白。结论 成功构建高表达重组人TREM-1蛋白的原核表达载体及制备高效价兔抗人TREM-1多克隆抗体。     

重组人前列腺特异性抗原的原核表达、纯化与鉴定

目的：用分子克隆技术体外制备人前列腺特异性抗原（PSA）重组蛋白，并对其活性进行鉴定。方法：用分子克隆技术从前列腺癌cDNA文库中扩增PSAcDNA，再将cDNA和准备插入的质粒载体PET-12α分别用限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ消化，然后用T4连接酶将两者连接，序列正确的阳性克隆转染B121（DE3）大肠埃希菌，诱导表达重组人PSA蛋白，从细菌包涵体中纯化PSA蛋白，再用小剂量胰岛素激活PSA活性，观察活化的PSA是否分解其变色底物S-2586和天然底物精囊蛋白Semenogelin（Sg）。结果：利用原核表达技术得到了重组人PSA，在胰岛素作用下PSA被激活，活性PSA水解其天然底物Sg和变色底物S-2586。结论：用基因克隆方法体外获得的重组人PSA蛋白可表现与天然PSA同样的丝氨酸蛋白酶活性和功能。     

重组人前列腺特异性抗原的原核表达、纯化与鉴定

目的:用分子克隆技术体外制备人前列腺特异性抗原(PSA)重组蛋白,并对其活性进行鉴定。方法:用分子克隆技术从前列腺癌cDNA文库中扩增PSAcDNA,再将cDNA和准备插入的质粒载体PET-12α分别用限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ消化,然后用T4连接酶将两者连接,序列正确的阳性克隆转染BL21(DE3)大肠埃希菌,诱导表达重组人PSA蛋白,从细菌包涵体中纯化PSA蛋白,再用小剂量胰岛素激活PSA活性,观察活化的PSA是否分解其变色底物S-2586和天然底物精囊蛋白Semenogelin(Sg)。结果:利用原核表达技术得到了重组人PSA,在胰岛素作用下PSA被激活,活性PSA水解其天然底物Sg和变色底物S-2586。结论:用基因克隆方法体外获得的重组人PSA蛋白可表现与天然PSA同样的丝氨酸蛋白酶活性和功能。     

肾癌肿瘤相关抗原G250及G250蛋白多糖(PG)区基因的克隆、表达及鉴定

目的 探讨肾癌肿瘤相关抗原G250及G250蛋白多糖(PG)区基因的克隆,蛋白表达及鉴定.方法 从肾癌细胞786-0中提取mRNA,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出G250及G250 PC,区cDNA.将获得的cDNA片段插入pET28a(+)表达载体,构建重组质粒pET-28a(+).G250/pET-28a(+)-G250 PG,转化DH5α大肠杆菌.通过PCR鉴定筛选出正确的重组子,并用其转化BL21 Codon Plus菌.采用IPTG诱导工程菌进行诱导表达,SDS-PAGE及Westernblot鉴定.结果 克隆的基因经测序证实,G250/G250 PG区序列正确.构建重组质粒pET-28a(+).G250/pET-28a(+)-G250 PG,并在原核系统中表达G250/G250 PC重组蛋白,目的 蛋白均具有较好的抗原性和特异性.结论 成功完成G250/G250 Pc区基因克隆及表达,为在G250/G250PG蛋白纯化基础上进行抗体制备和G250功能研究提供了实验依据.     

马尔尼菲青霉菌溶血磷脂酶基因的克隆、表达及纯化

目的 研究马尔尼菲青霉菌(PM)溶血磷脂酶(LysoPLs)基因的克隆、表达和纯化,为研究其致病机制奠定基础.方法 采用生物信息学方法,从PM酵母相全长 cDNA 文库中识别出PMLysoPLs基因的同源序列及其全长编码区.通过PCR方法 扩增PMLysoPLs基因的编码区序列,构建原核表达载体pET 30a(+)-PMLysoPLs,经DNA 序列测定鉴定其序列,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,重组产物采用His-镍蛋白纯化柱进行纯化.结果 PMLysoPLs基因长度为991 bp,其全长编码序列长度为732 bp,编码243个氨基酸,其编码蛋白理论分子量为26.8 kDa.重组表达载体经序列测定及酶切鉴定与理论推测结果 相符.经IPTG诱导,该基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中得到高效的可溶性上清表达,纯化后的重组蛋白分子量为25~35 kDa,其单一蛋白纯度达95%以上.结论 本研究成功构建了PMLysoPLs基因的pET 30a(+)原核重组质粒,获得的可溶性重组蛋白表达效率高,可用于进一步研究PM溶血磷脂酶的功能.     

人源性抗前列腺特异性膜抗原单链抗体的基因构建、表达及鉴定

目的:分别构建人源性抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)单链抗体(sc Fv)/鱼精蛋白截短体(tp)、sc Fv/弗林蛋白酶识别位点(Fdt)/流感病毒融合肽结构域(HA2)/tp融合蛋白基因。利用原核表达体系表达、纯化并检测sc Fv、sc Fv-tp、sc Fv-Fdt-HA2-tp融合蛋白的活性。方法:采用PCR的方法,扩增融合基因sc Fv、sc Fv-tp、sc Fv-Fdt-HA2-tp,将获得的基因克隆入原核表达载体p ET28,在大肠杆菌BL21中表达,表达产物经SDS-PAGE和Western印迹鉴定,通过Ni2+-NTA螯合层析纯化。ELISA分析融合蛋白抗原亲和活性。结果:成功构建了人源性抗PSMA融合基因,经IPTG诱导后在M15中以包涵体形式表达。表达的目的蛋白均能与PSMA抗原结合。结论:融合蛋白具有结合抗原的活性,为靶向递送siRNA的研究奠定了基础。     

肾癌肿瘤相关抗原G250/MN/CAⅨ基因的克隆、表达及鉴定

目的报道G250/MN/CAⅨ基因的克隆,蛋白表达及鉴定。方法从肾癌组织中提取总RNA,采用RTPCR法扩增G250/MN/CAⅨ全长cDNA,将获得的cDNA片段插入pET22b(+)表达载体,转化BL21大肠杆菌中,以IPTG诱导进行蛋白表达,SDSPAGE凝胶电泳观察结果,实验验证。结果克隆的G250/MN/CAⅨ基因经测序证实序列正确,构建重组质粒pET22b(+)/G250并在原核系统中表达G250/MN/CAⅨ重组蛋白,该蛋白具有较好的抗原性和特异性。结论成功完成G250基因克隆,为在G250蛋白纯化基础上进行抗体制备和G250功能研究提供了实验依据。     

肾癌肿瘤相关抗原G250/MN/CAIX基因的克隆、表达及鉴定

目的 报道G250／MN／CA Ⅸ基因的克隆，蛋白表达及鉴定。方法 从肾癌组织中提取总RNA，采用RT—PCR法扩增G250／MN／CA Ⅸ全长cDNA，将获得的cDNA片段插入pET22b（＋）表达载体，转化BL-21大肠杆菌中，以IPTG诱导进行蛋白表达，SDS—PAGE凝胶电泳观察结果，实验验证。结果 克隆的G250／MN／CA Ⅸ基因经测序证实序列正确，构建重组质粒pET22b（＋）／G250并在原核系统中表达G250／MN／CA Ⅸ重组蛋白，该蛋白具有较好的抗原性和特异性。结论 成功完成G250基因克隆，为在G250蛋白纯化基础上进行抗体制备和G250功能研究提供了实验依据。     

Data,information, knowledge,wisdom, and understanding

The digital age commenced in the mid-20th century and since we have seen approximately exponential growth in information. This period has also seen the rapid growth of computer technology that has facilitated, for instance, the derivation of whole genomes and automated drug discovery. Data, information, knowledge and wisdom lay the foundations for understanding how experience is formed from evidence and observations. When data are put into context, the resultant information can drive growth and further contribute to increased knowledge. Appreciating the source of data enables us to recognize and hopefully correct for inherent error and bias. Ultimately knowledge discovery can be automated to gain information from data and so on, enhancing our understanding of a given subject and expanding collective wisdom.     

MRSA: Resistenzmechanismen,Epidemiologie, Risikofaktoren,Prophylaxe, Therapie

Zusammenfassung Methicillin-resistente Staphylococcus aureus-Stämme (MRSA) sind inzwischen in vielen Ländern verbreitete Erreger, denen eine besondere Aufmerksamkeit geschenkt wird. In der vorliegenden Übersichtsarbeit werden der Resistenzmechanismus, die Epidemiologie der Verbreitung im Krankenhaus (H-MRSA) bzw. in Einrichtungen des Gesundheitswesens (HCA-MRSA) und außerhalb des Krankenhauses (C-MRSA), Ursachen der Zunahme des Nachweises, Besiedlungsdynamik, Erkrankungsrisiko und Letalität, das Vorgehen bei MRSA-Nachweis, Methoden zur Dekolonisierung, Überwachungskulturen sowie therapeutische Optionen diskutiert.     

骨密度没量中精密度的重要性

骨密度测定,不论采取何特殊技术,即使严格地按照厂家建议的操作程序,也常常不能达到完美的重复性.必须确定每台骨密度仪不同骨骼部位的精确度.精密度,如标准差平均方根或变异系数平均方根,被用来确定骨密度的变化,即精密度决定最小显著性变化值和随访需要的至少时间间隔.除非确定了精密度,否则就不能确定任何水平的统计可信度最小显著性变化值,使得随访的研究结果难以解释.     

Leak,fistula, sepsis,sinus, portal vein thrombosis

The creation of an ileal pelvic pouch is a complex procedure. While many perioperative complications are possible, surgery specific complications may include a pouch leak, fistula, abscess with sepsis, anastomotic sinus, and portal vein thrombosis. In this chapter, each of these are individually discussed along with evaluation and treatment options.