耐辐射奇球菌pprM基因回补株的构建与鉴定

目的 构建耐辐射奇球菌pprM基因缺失回补菌株, 为进一步研究PprM蛋白的功能奠定实验基础。 方法 设计并合成HA-pprM基因(HA为流感病毒血凝素)全长的引物, 以无突变的pGEX-6p-1-pprM载体为模板, PCR扩增出携带NdeⅠ酶切位点的HA-pprM基因全长, 经NdeⅠ酶切后, 与pRADK载体连接并转化大肠杆菌, 经培养、提取质粒及纯化后, 采用酶切鉴定以及基因测序方法确认插入序列的正确性; 采用CaCl₂法将构建好的重组质粒pRADK-HA-pprM转化到耐辐射奇球菌pprM基因缺失的菌株中, 通过Western blot验证HA-PprM融合蛋白的表达。 结果 构建的重组质粒pRADK-HA-pprM经NdeⅠ酶切鉴定结果符合目的条带大小(438 bp), 测序结果显示插入的寡核苷酸序列及方向与预期的一致, Western blot结果显示HA-PprM融合蛋白的相对分子质量约为13000。 结论 笔者成功构建了重组质粒pRADK-HA-pprM, 为进一步研究与PprM蛋白相互作用的靶DNA的筛选奠定了良好的基础。     

耐辐射奇球菌pprM基因在真核细胞中的表达

目的扩增耐辐射奇球菌辐射抗性基因pprM,构建pEGFP-C1-pprM重组载体,转入293T细胞并表达PprM蛋白,为研究原核细胞辐射抗性基因pprM是否提高真核细胞的辐射抗性及其可能存在的作用机制奠定实验基础。方法以无任何突变的pGEX-6p-1-pprM重组质粒为模版,设计引物PCR扩增pprM基因,利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收目的片段,EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切回收的目的片段及质粒pEGFP-C1,将双酶切产物进行连接,连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞后涂布于含卡那霉素（Kan）抗性的Luria-Bertani（LB）固体培养基上进行筛选,所筛选的阳性克隆进一步用菌落PCR,EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切及测序鉴定。通过Lipofectamine2000转染试剂将pEGFP-C1-pprM重组质粒转入293T细胞,倒置荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达。裂解细胞抽提蛋白,Western blot进一步验证PprM蛋白的表达。结果菌落PCR结果及双酶切结果显示,在400 bp左右处有一条明显的目的条带,测序结果显示碱基序列与原基因序列一致,载体构建成功。荧光拍照结果显示,pEGFP-C1-pprM重组质粒成功转染293T细胞并表达绿色荧光融合蛋白;Western blot结果显示在40×103处有融合蛋白表达。结论笔者成功将所构pEGFP-C1-pprM重组质粒转入293T细胞,并表达相应蛋白,为后续实验研究原核基因pprM及其产物对真核细胞辐射抗性的影响奠定了良好的实验基础。     

分化抑制因子ID1''基因酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用的检测

目的：构建酵母双杂交用分化抑制因子IDl’基因的诱饵载体，并检测其自激活作用。方法：PCR扩增ID1’，基因全长，酶切后与诱饵载体pHybLex/Zeo连接形成重组诱饵载体，电穿孔方法转化到酵母细胞EGY48中，β—半乳搪昔酶滤膜分析检测重组诱饵载体对报告基因LacZ的自激活情况。结果：扩增出IDl’基因全长，成功构建了重组诱饵载体pHybLex/Zeo—IDl’，经酶切和测序鉴定正确；重组诱饵载体无自发激活报告基因功能。结论：重组诱饵载体构建成功，对报告基因无自激活作用，为下一步cDNA文库筛选莫定了基础。     

霍乱弧菌ctxAB融合基因的克隆及原核表达

目的构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）和B亚基基因（ctxB）的融合表达载体，并在原核系统表达，为霍乱毒素（CT）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法以霍乱弧菌DNA为模板，利用重叠PCR技术，扩增出含有ctxA和ctxB的融合基因片段ctxAB，并与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组，构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）。经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后，以IPTG诱导表达TrxBB—CTAB融合蛋白，用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明，扩增出了霍乱弧菌1158bp的ctxAB融合基因，成功构建了重组质粒pET—ctxAB，SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxAB在原核系统中得到了高效融合表达。结论霍乱弧菌ctxA基因和ctxB基因通过重叠PCR成功地融合在一起，融合基因ctxAB在大肠杆菌中得到了高效表达。     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白5基因的克隆化研究

目的克隆乙型肝炎病毒（HBV）前-S1蛋白反式激活新基因PS1TP5的cDNA,并应用生物信息学技术初步探讨其结构及功能。方法应用聚合酶链反应（PCR）技术以HepG2细胞的cDNA为模板扩增PSlTP5,以pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到真核表达载体pcDNA^TM 3．1／myc-His A,通过PCR、限制性酶切分析进行鉴定,并应用生物信息学技术初步分析其物理化学性质、蛋白质结构和功能。结果PCR成功扩增出PS1TP5基因,并将其分别克隆进pGEM-T和pcDNA^TM3．1／myc-HisA载体,经PCR、限制性酶切鉴定后测序证实。因其可以被前-S1蛋白反式激活,故命名为前-S1反式激活蛋白5（PS1TP5）,已在GenBank中注册,注册号：AY427953。生物信息学分析确定其ORF为438个核苷酸（nt）,编码产物为145个氨基酸残基（aa）。结论发现了HBV前-S1蛋白反式激活新基因PS1TP5,构建了pcDNA^TM 3．1／myc-His A真核表达载体,为进一步研究其生物学功能及慢性乙型肝炎发病机制创造了条件。     

人骨形态发生蛋白12基因重组腺病毒载体的构建

目的:构建及制备人骨形态发生蛋白12(BMP12)基因重组腺病毒,证明其可感染脂肪组织来源干细胞并表达蛋白。方法:将包含有BMP12cDNA全长序列的BMP12-pED6质粒用限制性内切酶EcoRI进行酶切,得到一个1260bp大小的含有BMP12cDNA的目的基因片段。将目的基因片段插入质粒pcDNA3.1后,用KpnI和PmeI进行双酶切,插入pAdtrack-CMV。插入目的基因片段的穿梭质粒pAdtrack-CMV-BMP12用PmeI进行酶切线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1一起电转化入感受态BJ5183菌株。用PCR及多种酶切方法鉴定重组体。最终将线性化的重组质粒利用脂质体转入293A细胞中进行病毒包装。BMP12基因随着重组腺病毒在感染的293A细胞中扩增而得到复制,并通过CsCl梯度离心法得以纯化。Elisa法检测Ad-BMP12感染脂肪组织来源干细胞后BMP12的蛋白表达。结果:pAdtrack-CMV-BMP12经酶切证实有1260bp的插入片段。酶切及PCR鉴定证实BMP12基因重组腺病毒载体构建成功。GFP(green fluorescent protein)表明重组腺病毒扩增成功并制备出高滴度重组病毒。该重组病毒可成功感染脂肪来源组织干细胞并表达BMP12蛋白。结论:BMP12基因能够重组于腺病毒载体,可以进行有效扩增,产生高浓度的重组腺病毒,从而用于BMP12基因治疗的研究。     

微丝相关蛋白hHBRK1突变体的构建、表达及纯化

目的：构建微丝相关蛋白hHBRK1截短体和突变体原核表达载体，并表达及纯化融合蛋白。方法：采用常规PCR并结合定点突变技术，对hHBrkl基因进行缺失和点突变；利用限制性内切酶将PCR产物克隆至原核表达载体pGEX-4T；IPTG诱导融合蛋白表达，通过谷胱甘肽一琼脂糖纯化技术分离纯化GST融合蛋白。结果与结论：构建了包括氨基端缺失截短体hHBRK1-AN、羧基端缺失截短体hHBRK1-AC和点突变蛋白hHBRKl-S^56G^57在内的原核表达质粒，分离获得较高纯度的重组hHBRKl突变体融合蛋白，Western杂交证实纯化蛋白为GST融合蛋白。本实验为进一步研究hHBRK1的相互作用蛋白及其可能的结合位点提供了基础。     

基于生物信息学分析的人ID4基因启动子表达载体的构建及鉴定

目的:基于生物信息学分析构建人ID4基因启动子表达载体,以其作为研究ID4基因启动子表达调控分析的工作基础.方法:在分析人ID4基因启动子结构和调控元件的基础上,据UCSC基因组生物信息学中人ID4基因转录起始点(TSS)上游启动子区-643 bp及5'非翻译区(5'-UTR) 164 bp序列设计并合成引物,进行PCR扩增;以PCR产物作为模板经巢式PCR扩增了TSS上游启动子区-621 bp片段,将PCR产物回收、纯化后再连接到pGEM-T Easy载体上并转化至DH5α感受态大肠杆菌中构建成pGEM-T Easy-人ID4基因启动子重组质粒.转化产物经半巢式PCR及酶切鉴定,对得到的阳性克隆进行测序.结果与结论:成功构建出含有糖皮质激素受体、cAMP结合蛋白及雌激素受体反应调控元件序列的人ID4基因启动子表达载体.该表达载体的构建为进一步研究人ID4基因的启动子活性及表达调控奠定了基础.     

人CD40L胞外区和人CTLA4Ig双基因共表达腺病毒载体的克隆和鉴定

目的：构建人CD40L胞外区和CTLA4Ig双基因共表达重组腺病毒载体并鉴定。方法：RT-PCR扩增人CD40L胞外区片段，与致瘤素信号肽连接后构建穿梭质粒，经酶切、插入、同源重组，获质粒pAdshCD40L-IRES2-CTLA4Ig，经293细胞包装，获共表达双基因的腺病毒pAdvshCD40L-IRES2-CTLAg，并行凝胶电泳、PCR、共聚焦显微镜检测。结果：电泳、PCR扩增出了600bp和400bp的特异性片段、共聚焦显微镜观察到CD40L绿色荧光和CTLA4Ig红色荧光的共表达。结论：成功构建了人CD40L．胞外区和CTLA4Ig共表达双基因重组腺病毒载体。     

可溶性白细胞分化抗原40配体原核表达载体的构建与鉴定

目的构建原核表达载体pGEX4T含人可溶性白细胞分化抗原40配体(soluble cluster of differentiation antigen 40 ligand,sCD40L)重组质粒。方法通过反转录 聚合酶链反应扩增,获得人sCD40L的基因片段;将其连接入T载体,用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷与异丙基-β-D-硫代半乳糖苷筛选阳性克隆,鉴定正确后经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,再与pGEX-4T原核表达载体连接,最后经酶切及测序鉴定。结果以L02细胞的互补DNA为模板,扩增出474 bp的目的基因;将目的片段与T载体连接并进行蓝白筛选得到阳性克隆;构建pGEX-4T-sCD40L重组质粒,经转化和筛选获得重组菌,经酶切、基因测序证实序列正确。结论成功构建pGEX-4T-sCD40L原核表达载体,为进一步探讨sCD40L在肝癌诊断中的作用奠定基础。     

pEGFP-N1-UCH-L1重组质粒的构建

目的 构建pEGFP-N1-UCH-L1重组质粒,并进行鉴定。方法提取Wistar乳鼠大脑组织总RNA,逆转录合成cDNA,经PCR扩增UCH-L1基因,定向克隆至载体pEGFP-N1,构建重组质粒,经测序进行鉴定。结果 UCH-L1基因重组质粒经测序鉴定证明构建正确。结论成功构建了UCH-L1基因重组质粒,可用于神经细胞转染,进行后续研究。     

乙型肝炎病毒C基因G87变异对宿主细胞HLA-I表达的影响

目的 探讨HBV C基因G87变异对宿主细胞表面HLA-I表达的影响。方法 采用定点突变技术和亚克隆技术，将HBV野生型基因组质粒构建为C基因G87变异株表达载体(EBO-G87)和野生株表达载体(EBO-WT)，以脂质体技术分别转染HepG2细胞，转染细胞经FITC标记的鼠抗HLA-ABC mAb染色，流式细胞术测定细胞表面HLA-I的表达。结果 构建的EBO-G87和EBO-WT重组载体经内切酶双酶切鉴定及核苷酸序列测定证实。HepG2细胞表面HLA-I表达的平均荧光强度，EBO空载体转染的细胞为2．3，EBO-WT转染的细胞明显增强至18．8，EBO-G87转染的细胞增至10.5。结论 2株HBV上调HLA-I表达强度不同，C基因G87变异可使宿主细胞表面的HLA-I表达水平发生改变。     

福氏2a痢疾杆菌侵袭相关基因的克隆与表达

以福氏2a 痢疾杆菌大质粒为材料,粘粒(cosmid)为载体构建大质粒基因库。用探针菌落原位杂交,质粒分析及酶切、Southern blot、Western blot 等方法进行鉴定。获得了四株表达侵袭相关蛋白的克隆株,而且它们表达出与侵袭活性密切相关的接触性溶血活性。     

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

目的 构建人中性粒细胞多肽1(HNPl)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础。方法 从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNPl基因cDNA片段,将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中．用脂质体转染CA3S-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达。结果 从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础。     

氧浓度非敏感性低氧诱导因子-1α表达载体的构建及其在PC12细胞系中的表达

目的 构建大鼠非氧浓度敏感性低氧诱导因子1α(HIF-1α)真核表达载体并观察其在PC12细胞系中的表达. 方法 应用RT-PCR从脊髓损伤区域的细胞总RNA中扩增HIF-1αcDNA,采用重叠延伸PCR的方法克隆获得缺失氧敏感性降解结构域(ODD)的HIF-1α突变体基因克隆,采用质粒_pEGFP-C1构建重组真核融合表达载体,将其转入培养的PC12神经细胞系中,应用所融合的绿色荧光蛋白的表达和Western blot鉴定其在细胞内的表达. 结果 通过重叠延伸PCR的方法成功扩增得到非氧浓度敏感性的HIF-1α突变体基因(HIF-1α△ODD)序列,并构建了过量表达缺失ODD的转录调控因子HIF-1α突变体的重组表达质粒()pEGFPC1-HIF-1α△ODD).将其转染PCI2细胞系后,Western blot和绿色荧光蛋白结果均表明HIF-1α△AODD蛋白能在PC12神经细胞系中正确表达. 结论 成功构建了_pEGFPC1-HIF-1α△ODD真核表达载体并在PC12细胞系中观察到融合蛋白表达.     

IS605在中国人感染幽门螺杆菌中的检出特征

为探讨一新的座子插入元件IS605在中国人群感染幽门杆蓖(Hp)现的相关性,作者采用PCR方法,在107例临床分离培养的Hp菌株中,扩增IS6 05中的1167bp片段。发现：IS605在中国人群感染Hp中的阳性检出率为43.9%,在十二指肠溃疡中的检出率13.6%,明显低于慢性胃炎（52.2%)等其它Hp相关疾病组中的检出率（P＜0.05)。说明：作为转卒子插入元件的IS605,在中国人慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等不同疾病来源的Hp中均有分布,其中十二指肠溃疡中的检出率明显低于慢性胃炎等其它Hp相关疾病中的检出率。提示IS605的出现,与Hp致十二指肠溃疡的毒力改变有关。     

人角化细胞生长因子-1的克隆及其在骨髓基质细胞中的表达

目的 从人胚肺成纤维细胞中克隆人角化细胞生长因子-1（KGF-1）编码区序列,构建真核荧光表达载体.方法 从人胚肺成纤维细胞中提取总RNA,通过反转录 PCR获取KGF-1 cDNA编码区序列,将其与pIRES2-EGFP质粒载体连接,构建重组表达载体pIRES2-EGFP/KGF-1,测序鉴定.将pIRES2-EGFP/KGF-1瞬时转染骨髓基质细胞（marrow stroma cells,MSCs）48 h后,免疫荧光法检测骨髓基质细胞是否存在KGF-1蛋白的表达.结果 构建的重组质粒pIRES2-EGFP/KGF-1经序列分析示与国外文献报道一致.KGF-1免疫荧光法激光共聚焦检测结果证实,pIRES2-EGFP/KGF-1转染骨髓基质细胞后,存在KGF-1蛋白的表达,定位于细胞浆内.结论 成功构建重组真核荧光表达载体pIRES2-EGFP/KGF-1,初步探讨了该基因在骨髓基质细胞中的表达,为其在皮肤组织工程的运用奠定了基础.     

利用RNAi技术抑制ARPC2基因表达的研究

目的 构建pSUPER-ARPC2表达载体,并在真核细胞中进行表达,验证ARPC2基因表达是否受到抑制。方法 设计特异性针对ARPC2基因的寡核苷酸序列,退火后利用常规酶切、连接方法将其重组至pSUPER basic载体中。对阳性克隆进行酶切和测序鉴定后,转染HEK293细胞,利用RT-PCR和Western blot检测ARPC2基因的表达情况。结果 构建的pSUPER-ARPC2载体导入HEK293细胞时,ARPC2基因的表达受到抑制,蛋白合成减少。结论 成功构建了ARPC2的RNAi表达载体,并证实其能对ARPC2基因的表达产生抑制作用,为进一步研究ARPC2的生理功能提供了重要的实验材料。     

重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP的构建与鉴定

目的人血管内皮生长因子（的hVEGF165）为靶基因,增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因构建体的复制缺陷型腺病毒载体,为基因治疗牙周进一步再生奠定了基础。方法质粒的pDC316-的VEGF165为模板,PCR扩增基因片段进行消化,获得的hVEGF165用于连接到含有绿色荧光蛋白标记基因重组质粒的消化方法的pDC316-MCMV-EGFP质粒载体,PCR鉴定和双酶切证实成功构建重组质粒;使用ADMAX包装系统,改造的质粒共转染用质粒骨架293包装细胞系和重组病毒的扩增;扩增病毒的离子交换纯化;TCID50测定病毒粒子和效价的数目;的荧光的荧光显微镜重组腺病毒表达。结果 PCR鉴定,酶切分析和测序证实成功构建人VEGF基因的携带绿色荧光蛋白标记（的hVEGF165）重组质粒的pDC316-的hVEGF165-MCMV-EGFP和同源重组腺病毒Ad5的-的hVEGF165-EGFP的成功。扩增和纯化后,腺病毒颗粒的数量测量5.4×1011VP/mL,约2.0,为1.8×1010CCID50/mL的滴度OD260/OD280值。结论成功构建携带hVEGF165基因重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP并获得高滴度病毒颗粒,为hVEGF165基因功能研究以及细胞移植、基因治疗提供有效的工具。     

人源抗HBsAg dsFv抗体靶向干扰素重组质粒的构建与表达

目的构建抗体靶向干扰素的重组表达质粒pEE14.1-dsFvαpr+,并在真核细胞中验证重组质粒的表达情况。方法通过重叠延伸PCR将dsFv抗体重链基因与带正电荷的DNA负载区基因融合,并在抗体轻链α干扰素融合基因3′端连入6×His标签。先在过渡载体pCI-GPI中实现轻、重链复合基因的连接,然后连入pEE14.1中,最终构建重组表达质粒pEE14.1-dsFvαpr+。将重组质粒LipofectamineTM2000瞬时转染到CHO-K1细胞,采用RT-PCR、ELISA和Western blotting方法验证目的基因的表达。结果重组质粒经酶切鉴定和测序验证与设计完全一致。RT-PCR结果显示只有重组质粒转染后的细胞能够扩增出1700bp的目的条带,ELISA检测瞬时转染细胞上清α干扰素的浓度约为1.1ng/ml,Western blotting检测显示重组质粒在转染细胞上清中获得表达。结论实现了抗体靶向干扰素在单一质粒中的高效表达,通过对表达蛋白的电性改造有利于后期治疗慢性乙肝的抗体靶向纳米粒药物的研制。