人类α型叶酸受体基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的 探讨如何以人类α型叶酸受体(FOLR-1)基因为基础构建核酸疫苗。方法 应用RT-PCR技术，从人类卵巢癌细胞系-SKOV3细胞中扩增FOLR-1基因，插入克隆载体pGEM-T Easy，经DNA自动测序仪测序证实后，以亚克隆法构建于真核表达载体pcDNA3．1( )，并使用限制性内切酶酶切鉴定。结果 从卵巢癌细胞系SKOV3中成功扩增出FOLR-1基因，并克隆人pcDNA3．1( )载体。结论 成功构建FOLR-1的重组克隆及真核表达载体，为今后利用FOLR-1进行卵巢上皮性肿瘤的免疫及导向治疗研究打下了基础。     

人BDNF重组逆转录病毒载体的构建

目的 构建PLEGFP-BDNF真核表达重组逆转录病毒，为进一步在细胞中表达及移植治疗作准备。方法 按照hBDNF基因全长编码序列设计合成引物，从人基因组DNA中扩增出744bp的hBDNF基因片段，插入到PMD18-T载体上，转化DH5α大肠杆菌菌株，获得PMD18T-BDNF克隆，对该克隆进行限制性酶切分析和DNA序列测定；从阳性克隆中获取hBDNF全长编码片段，与真核表达载体PLEGFP质粒连接，构建PLEGFP-BDNF真核表达重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌JMl09，再经氨苄LB培养基筛选，酶切，PCR与测序鉴定。结果PLEGFP-BDNF重组逆转录病毒构建成功。结论hBDNF在大肠杆菌中的成功表达在转基因治疗CNS病变方面具有潜在应用价值。     

V型腺病毒纤维蛋白基因真核表达质粒的构建及表达

目的：构建腺病毒纤维蛋白基因的真核表达质粒,并检测其在真核细胞中的表达,为腺病毒靶向性载体构建创造条件。方法：采用限制性内切酶技术,酶切腺病毒骨架质粒pAdEasy-1,经多次亚克隆,最后完成克隆纤维蛋白基因并构建其真核表达质粒,用脂质体法将构建好的真核表达质粒瞬时转染COS-7细胞,于转染后72h,用Western blot法检测所表达的蛋白。结果：克隆成功纤维蛋白基因,并构建纤维蛋白基因真核表达质粒pcDNA/Fiber,经限制性内切酶酶切鉴定及测序证实了其正确性,Western blot结果显示,新表达蛋白在变性条件下大小为62kD,而在非变性条件下为186kD。结论：纤维蛋白基因真核表达质粒能在真核细胞中表达,产物具有三聚体结构。可用于腺病毒靶向性载体的构建。     

VEGFR-3胞外区基因真核表达载体的构建-与鉴定

目的构建VEGFR-3胞外区基因真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,并在体外进行表达和鉴定。方法采用 RT-PCR技术,扩增C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-3胞外区cDNA片段,通过基因重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pcDNA3.1-VR-3。经限制性酶切鉴定和DNA 序列测定结果证实后,将重组质粒经脂质体法转染COS-7细胞, Western blotting检测其蛋白表达。结果克隆了C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-3胞外区cDNA片段,并构建了真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,Western blot 证实目的基因可在COS-7细胞中表达。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,可在真核细胞内正确表达,这为进一步的动物实验奠定了基础。     

RUNX3基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌T47D细胞中的表达

目的:构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-RUNX3,并在乳腺癌T47D细胞株中表达。方法:应用基因重组技术和限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,构建并鉴定pcDNA3.1(+)-RUNX3真核表达载体,经脂质体Lipofectamine2000介导质粒转染T47D细胞后应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot实验,检测RUNX3在T47D细胞中的表达。结果:重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-RUNX3经限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,电泳后显示1.3kb的RUNX3目的片段和5.4kb的pcDNA3.1(+)载体片段。测序证实酶切片段与gene bank中登记的RUNX3序列相同,证实pcDNA3.1(+)-RUNX3真核表达载体构建成功。经RT-PCR和Western blot检测,表明转染pcDNA3.1(+)-RUNX3的T47D细胞RUNX3阳性表达。结论:重组真核表达载体构建正确,并建立稳定表达RUNX3的T47D细胞系,从而为后续研究提供有用的细胞研究模型。     

重组人 ZNF278 促进胃癌细胞系 SGC7901 增殖的研究

目的：构建pcDNA3．1-ZNF278重组人真核表达质粒,研究ZNF278对胃癌细胞增殖和周期的影响。方法：PCR扩增正常人胃黏膜组织中的ZNF278基因,并用EcoRI和HindIlI双酶切,与酶切后的pcDNA3．1-myc—his载体连接,转化DH50t大肠杆菌,克隆筛选,提取重组质粒,酶切鉴定并测序。重组人ZNF278真核表达质粒转染胃癌细胞系SGC7901,定量PCR和Westernblot技术检测ZNF278表达状况,利用MTr和细胞记数法检测细胞增殖,同时分析细胞周期变化。结果：测序证实pcDNA3．1-ZNF278真核表达质粒构建成功,并成功转染SGC7901细胞,检测确认ZNF278表达上调,转染重组pcDNA3．1-ZNF278质粒的SGC7901细胞较对照组生长加快,促进细胞周期进入s期。结论：pcDNA3．1-ZNF278重组质粒构建成功,并可促进胃癌细胞系SGC7901细胞增殖和细胞进入分裂期。     

Survivin特异性siRNA真核表达载体的构建

目的构建Survivin特异性siRNA真核表达载体，为以Survivin基因为靶点、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）为手段的白血病和其它恶性肿瘤基因治疗的基础和临床应用提供良好的技术手段。方法根据GeneBank数据库提供的Survivin基因所有变异体的共同核苷酸序列，按照Tuschl设计原则，选择设计双链siRNA，再转化为能表达其小发卡结构RNA（small hairpin RNA，shRNA）的DNA序列，并与载体pSINsi-hU6定向连接，构建受控于启动子u6的真核表达载体pSIN／shRNA1、pSIN／shR-NA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。结果构建Survivin特异性siRNA真核表达载体pSIN／shRNA1、pSIN／shRNA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。结论Survivin特异性siRNA真核表达载体构建成功。     

RUNX3基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌T47D细胞中的表达

目的：构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）-RUNX3,并在乳腺癌T47D细胞株中表达。方法：应用基因重组技术和限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,构建并鉴定pcDNA3.1（＋）-RUNX3真核表达载体,经脂质体Lipofectamine2000介导质粒转染T47D细胞后应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot实验,检测RUNX3在T47D细胞中的表达。结果：重组真核表达载体pcDNA3.1（＋）-RUNX3经限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,电泳后显示1.3kb的RUNX3目的片段和5.4kb的pcDNA3.1（＋）载体片段。测序证实酶切片段与gene bank中登记的RUNX3序列相同,证实pcDNA3.1（＋）-RUNX3真核表达载体构建成功。经RT-PCR和Western blot检测,表明转染pcDNA3.1（＋）-RUNX3的T47D细胞RUNX3阳性表达。结论：重组真核表达载体构建正确,并建立稳定表达RUNX3的T47D细胞系,从而为后续研究提供有用的细胞研究模型。     

人RASSF2基因的真核表达载体的构建及其表达

 目的　构建人RASSF2基因的真核表达载体 ,为研究RASSF2在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞等方面的作用奠定基础。方法　采用RT PCR自正常人外周血单个核细胞RNA中扩增出人RASSF2基因的全长cDNA ,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体 pcDNA3.1/HisC中获得重组质粒。用脂质体将重组质粒转染人胰腺癌细胞株PANC 1,RT PCR检测其表达。结果　酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF2表达片段已被完整、正确的插入到 pcDNA3.1/HisC中 ,RT PCR结果显示转染细胞RASSF2表达水平上调。结论　成功构建了RASSF2基因的真核表达载体 pcDNA3.1RASSF2     

大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因真核表达载体的构建及其在MKN-45细胞中的表达

目的克隆大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(EPNP)基因并构建真核表达载体pcDNA3.1-EPNP,将重组质粒转染MKN-45细胞获得高表达大肠杆菌PNP基因的MKN-45细胞克隆。方法根据Gen-bank中大肠杆菌PNP基因的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,以大肠杆菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增,并将扩增产物定向插入pMD-18T克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pcDNA3.1,利用脂质体将重组质粒转染MKN-45细胞。结果PCR扩增出716bp大小的片段,测序结果与已报道的EPNP基因序列一致;亚克隆经酶切鉴定正确;RT-PCR证明经G418筛选得到的转基因MKN-45细胞克隆中存在大量EPNPmRNA,前体药MePdR对转染EPNP的MKN-45细胞有较强的细胞毒作用。结论成功构建了大肠杆菌PNP基因的真核表达载体,获得了稳定表达大肠杆菌PNP基因的MKN-45细胞克隆,为PNP/MepdR自杀基因系统在胃癌基因治疗中的应用奠定了良好的基础。     

膜联蛋白A1基因合成及其真核表达载体的构建

目的 探讨人膜联蛋白A1（ANXA1）基因的合成并构建其克隆载体。方法 根据ANXA1基因序列设计一对寡聚核苷酸引物,通过PCR反应合成一段长度为870bp的ANXA1基因。真核表达载体pEGFP-N3经Kpn Ⅰ ＆ BamH Ⅰ限制性内切酶双酶切处理后与合成的ANXA1基因进行连接,连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞进行扩增,并提取质粒进行鉴定。结果 PCR扩增获得ANXA1基因,对PCR产物及重组质粒酶切后的凝胶电泳鉴定证实为与理论设计目的片段大小（870bp）相符的DNA基因片段,并成功地转入克隆载体pEGFP-N3中。测序分析显示合成的目的基因与GenBank中ANXA1基因序列同源性为99％,整个表达载体阅读框正确无误。结论 成功构建了ANXA1基因pEGFP-N3表达载体,为下一步高效表达ANXA1蛋白和进一步研究其作用机理及应用价值打下基础。     

人抑癌基因FHIT真核表达质粒的构建与鉴定

[目的]构建人抑癌基因FHIT真核细胞表达载体。[方法]采用PCR方法，从人胎脑组织的总cDNA中扩增出444bp的人FHIT cDNA片段，然后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）B中，用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒；用该表达质粒转染COS-7细胞，Western blot法检测FHIT蛋白的表达情况。[结果]人FHIT基因cDNA以正确方向插入到真核细胞表达载体DcDNA3．1／myc-His（-）B中；转染COS-7细胞后，可见转染细胞有Fhit蛋白的表达。[结论]本实验成功地构建了人抑癌基因FHIT的真核表达质粒pcDNA3．1／myc-His（-）B-FHIT，为研究FHIT基因在肿瘤的发生中的作用提供了有效的工具。     

人骨髓、脐血CD34~ 干细胞体外扩增的树突状细胞的表型及其T细胞刺激活性分析

目的:扩增出单纯疱疹病毒I型(HSV-I)Stocker株胸苷激酶(tk)基因,并将其克隆到真核表达质粒中,构建一个含有tk基因片段的高效真核表达载体.方法:根据已发表的HSV-I CL101株tk基因的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,以HSV-I Stocker株核酸为模板,进行PCR扩增,并将扩增产物连接到pUCll9中,进行序列分析,将此基因进一步克隆到含巨细胞病毒极早期启动子的真核表达质粒pCR3-Uni中,并对重组子进行酶切鉴定.结果:PGR扩增出1.427Kb大小的片段,通过酶切和序列分析证明含完整的tk基因序列,此序列与CL101株tk基因的同源性为98.5%.酶切证实了构建的真核表达载体株的同源性很高,重组子pCR3-tk含tk基因并获得了正向重组子.结论:克隆的HSV-I Stocker株tk基因与CL101株的同源性很高,重组于pCR3-tk是一种高效真核表达载体,这为今后应用非病毒载体特别是脂质体进行基因转导来研究HSV-tk/CCV系统在肿瘤基因治疗中的应用打下了基础.     

人TIMP-2基因真核表达质粒的构建及其表达研究

目的构建人T IM P-2基因真核表达质粒,使其在真核细胞中稳定表达。方法利用RT-PCR方法获得人T IM P-2基因cDNA,以pcDNA 3为载体构建真核表达质粒pcDNA 3/T IM P-2,采用脂质体介导基因转染技术将重组质粒DNA导入CHO细胞中,加入G 418对转染细胞进行筛选获得稳定转染细胞,采用W estern b lot对重组质粒的表达进行检测。结果酶切及测序结果显示重组质粒pcDNA 3/T IM P-2构建正确,在转化细胞中检测到人T IM P-2的表达。结论成功构建人T IM P-2真核表达质粒并获得稳定表达人T IM P-2的CHO细胞株。     

Construction of double suicide genes system controlled by MDR1 promoter with targeted expression in drug-resistant glioma cells

The multiple drug resistance protein (MDR1) is frequently overexpressed in human glioma. The aim of this study is to clone the MDR1 promoter from C6/ADR, construct the double suicide genes expressive vector controlled by MDR1 promoter, and explore its targeted expression in C6/ADR cells. MDR1 promoter from C6/ADR genomic DNA, which was linked with T vector, was amplified by using Polymerase chain reaction (PCR). After cut by NdeI and HindIII, MDR1 promoter was cloned into pcDNA3-TK (thymidine kinase) plasmid. The cytosine deaminase (CD) gene from pcDNA3-CD-TK plasmid was directly cloned into the above vector to construct pcDNA3-MDR1-promoter-CD-TK vector. Then this vector was transfected into C6 and C6/ADR cells respectively by liposome. After selection by G418, the tumor cell lines were stably established. Then these cell lines were examined through PCR and RT-PCR to respectively detect the integration and expression of TK and CD genes. The results showed the length and sequence of MDR1 promoter amplified by PCR were confirmed by DNA sequencing. The pcDNA3-MDR1-promoter-CD-TK expression vectors were constructed successfully. PCR indicated the double suicide genes were integrated into C6 and C6/ADR cells. RT-PCR reveled that CD and TK genes expressed in C6/ADR/CD-TK cells, whereas not in C6/CD-TK cells. In conclusions, construction of expressive vector containing double suicide genes controlled by MDR1 promoter with targeted expression in C6/ADR will provide a sound basis for targeted gene therapy for multidrug resistance (MDR) glioma.     

pcDNA3.1/DLC-1 重组质粒的构建及其在HT-29细胞中的表达

 目的 构建和表达DLC-1(deleted in liver cancer)基因重组质粒。 方法 用PCR法得到DLC-1基因片段,此基因片段带有Xba Ⅰ和BamH Ⅰ两个酶切位点,然后将此片段 和真核表达载体pcDNA3.1连接,转化大肠杆菌DH5a,利用脂质体介导将pcDNA3.1/DLC-1重组质 粒转染到结肠癌HT-29细胞中,再用RT-PCR法检测重组质粒的表达。 结果 重组质粒经Xba Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切和测序与DLC-1基因序列一致;利用脂质体介导将 pcDNA3.1/DLC-1重组质粒导入HT-29细胞,获得了DLC-1基因的表达。 结论 成功构建pcDNA3.1/DLC-1重组质粒并在HT-29细胞内表达。     

pcDNA3.1-CD74-ROS1重组质粒构建与表达对肺癌细胞增殖及迁移的影响

目的 构建C-ros致癌基因1（ROS1）融合基因CD74-ROS1重组质粒,并转染A549细胞株,检测其对肺癌细胞迁移能力的影响。方法 通过PCR技术获得CD74和ROS1基因片段,利用融合PCR法构建CD74-ROS1融合基因,构建pcDNA3.1-CD74-ROS1重组质粒,通过脂质体转染技术转入A549细胞中,利用Real-time PCR和Western blot技术检测CD74-ROS1的表达。MTT法观察细胞增殖情况,结晶紫染色法观察细胞形态变化,划痕实验检测CD74-ROS1对肺癌细胞迁移能力的影响。结果 酶切及测序结果表明CD74-ROS1融合基因构建成功,阳性克隆的CD74-ROS1蛋白表达显著增加。CD74-ROS1过表达导致细胞增殖能力增强,细胞形态上发生上皮-间质样转变且细胞迁移能力增强。结论 pcDNA3.1-CD74-ROS1重组质粒构建成功,并在A549细胞中稳定表达,CD74-ROS1过表达能够促进肺癌细胞增殖、形态转变且增强其迁移能力。