藤黄酸逆转人结肠癌细胞株SW480奥沙利铂耐药性的作用及机制研究

目的探讨藤黄酸对多药耐药人结肠癌细胞株SW480/L—OHP的耐药逆转及其对多药耐药基因（MDR1）和P-糖蛋白（P—gP）表达的影响。方法采用逐步增加药物浓度的方法建立奥沙利铂耐药结肠癌细胞株SW480/L—OHP。噻唑蓝（MTT）法测定SW480/L-OHP细胞株的耐药指数和藤黄酸在无细胞毒浓度下对结肠癌细胞耐受奥沙利铂的逆转作用,流式细胞术检测细胞凋亡、周期变化,RT—PCR检测各组细胞MDRlmRNA表达水平,Westernblot检测各组细胞P—gP蛋白的表达水平。结果藤黄酸对结肠癌SW480及SW480/LOHP细胞增殖均具有抑制作用,且呈量效关系。奥沙利铂与低毒剂量藤黄酸共同作用SW480/L-OHP细胞,其Ic50显著降低（P〈0．05）,耐药逆转倍数为3．72。与奥沙利铂单药组相比,加入低毒剂量藤黄酸后,细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义（P〈0．05）。藤黄酸作用后MDRlmRNA转录水平降低,同时下调了P—gp蛋白表达。结论藤黄酸部分逆转SW480/L—OHP细胞对奥沙利铂的耐药性,其机制与增加细胞内奥沙利铂的蓄积,抑制MDRl基因的表达及降低P—gp的表达有关。     

奥沙利铂联合低分子柑橘果胶对结肠癌细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨奥沙利铂联合低分子柑橘果胶（LCP）对人结肠癌细胞的增殖及凋亡的影响。方法采用MTT法分别检测各浓度奥沙利铂单药和奥沙利铂联合低分子柑橘果胶对人结肠癌细胞（HT29）增殖的影响．计算两药物相互作用指数（CDI）。流式细胞仪检测IC50浓度奥沙利铂单药及联合用药处理HT29细胞的凋亡比例,采用Westernblot分析凋亡相关蛋白procaspase．3、8、9、PARP的变化。结果奥沙利铂单药与联合LCP用药对HT29细胞生长均有抑制作用,其效应呈时间和浓度依赖性：联合组对HT29细胞的生长抑制作用更为显著（P〈0．01）．两药物CDI小于1。单药与联合用药均能使HT29细胞凋亡比例增加,药物作用6、24、48h后单药组细胞凋亡率分别为（9．76±0．47）％、（20．45±0．74）％和（28．70±3．29）％,联合组细胞凋亡率为（20．63±0．69）％、（34．35±1．02）％和（49．47±3．04）％,联合用药组较单药组细胞凋亡更加显著（均P〈0．01）。单药组与联合组HT29细胞的凋亡相关蛋白procaspase-3、8、9、PARP蛋白的表达均下调,联合组较单药组procaspase-3、9、PARP蛋白表达下调更为显著．但两组细胞procaspase-8表达基本相同。结论LCP能增加奥沙利铂的细胞增殖抑制和诱导凋亡能力．该效应可能与活化线粒体凋亡途径有关。     

脆性组氨酸三联体基因转染对人结肠癌细胞株SW480奥沙利铂敏感性的影响

目的 观察脆性组氨酸三联体基因(FHIT)转染对人结肠癌细胞株SW480奥沙利铂敏感性的影响.方法 将重组真核表达质粒pRc/CMV2-FHIT通过脂质体转染技术导入人结肠癌细胞株SW480,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染了空质粒pRc/CMV2的SW480细胞(SW480-pRc/CMV2)和正常SW480细胞为对照.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测FHIT基因的mRNA转录水平.以奥沙利铂作用于3组细胞,用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞的生长抑制率,用流式细胞仪检测奥沙利铂处理前后各组结肠癌细胞的凋亡率及细胞周期的变化.结果 SW480-FHIT细胞的RT-PCR产物经凝胶电泳有明显的阳性条带,而对照组则无;经奥沙利铂处理后,转染FHIT基因的SW480细胞的凋亡水平与空质粒转染组及结肠癌细胞株组比较明显增高(第2、3、4天A值比较P<0.05),并且FHIT基因与奥沙利铂有轻度的协同促进凋亡作用;同时奥沙利铂处理前后实验组结肠癌细胞的生长周期较对照组均出现了明显的G_0/G_1期阻滞,且细胞的生长抑制率存在浓度和时间依赖性.结论 外源性FHIT基因表达与奥沙利铂协同促进SW480细胞凋亡及细胞周期阻滞,FHIT基因可增加结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性.     

沉默Lin28b基因表达促进人结肠癌细胞奥沙利铂化疗敏感性

目的 探讨人结肠癌细胞中Lin28b基因表达及其与奥沙利铂化疗敏感性之间的关系.方法 构建干扰Lin28b的shRNA质粒(sh-Lin28b),并转染至结肠癌细胞(Cac02、SW480和HCT116细胞);逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法分别检测结肠癌细胞中Lin28b在mRNA和蛋白水平的表达;用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测sh-Lin28b和奥沙利铂化疗协同作用,Transwell实验检测处理后的结肠癌细胞迁移能力.结果 RT-PCR和Western blot结果证实Cac02、HCT116及SW480结肠癌细胞中均有Lin28b基因表达,其中在SW480细胞中的蛋白表达量比在HCT116中高1.83倍.SW480和HCT116细胞中Lin28b的mRNA表达在50 nmol/L的sh-Lin28b作用下分别被下调36.4％和90.2％,在100 nmol/L的sh-Lin28b的条件下分别被下调61.8％和89.5％.CCK-8结果显示奥沙利铂处理48 h后,HCT116细胞的IC50值为(6.09±1.42) mg/L,SW480细胞升高34.3％,至(8.18 ±3.64) mg/L.sh-Lin28b联合奥沙利铂处理组比较于对照转染组(NC)抑制SW480和HCTll6细胞生存率分别为(55.10±0.78)％和(50.30±0.69)％.Transwell 实验结果显示SW480细胞的迁移能力在sh-Lin28b的作用下降低至(48.60±0.92)％.结论 沉默表达于结肠癌细胞的Lin28b,可显著抑制结肠癌细胞的迁移能力,并促进奥沙利铂的化疗敏感性.     

microRNA-34a增加奥沙利铂对结肠癌细胞敏感性的实验研究

目的:构建奥沙利铂耐药结肠癌细胞株(SW480/ADR),观察miRNA-34a对SW480/ADR细胞奥沙利铂敏感性的影响。方法:使用浓度梯度法构建奥沙利铂耐药细胞株(SW480/ADR)。miR-34a慢病毒转染SW480/ADR细胞,MTT法检测细胞增殖,Real-time PCR定量检测miR-34a表达,Western blot检测蛋白表达。结果:SW480、SW480/ADR和过表达miR-34a-SW480/ADR细胞miR-34a的2-△△Ct值为0.15±0.03、0.12±0.02和0.74±0.13,各组间差异有统计学意义(P<0.01)。奥沙利铂对SW480、SW480/ADR和过表达miR-34a-SW480/ADR细胞的IC50值分别为8.64±1.54、24.16±3.72和11.52±1.22μmol/L,各组间差异有统计学意义(P<0.01)。SW480、SW480/ADR和过表达miR-34a-SW480/ADR细胞OCT-4蛋白的相对灰度值为0.096±0.014、0.352±0.053和0.136±0.017,各组间差异有统计学意义(P<0.01)。结论:miR-34a可以显著降低结肠癌奥沙利铂耐药细胞OCT-4蛋白表达,逆转结肠癌细胞对奥沙利铂的耐药。     

结肠癌SW480细胞FAP-1表达与奥沙利铂化疗耐药关系的研究

目的探讨结肠癌FAP-1表达与其对奥沙利铂化疗耐药间的关系。方法用奥沙利铂处理结肠癌SW480细胞,用MTT法评价其细胞增殖能力,以RT-PCR法评价FAP-1 mRNA表达水平。结果奥沙利铂化疗仅能一定程度上抑制结肠癌SW480的增殖,但随作用时间的延长,SW480细胞仍能继续增殖。经过奥沙利铂化疗FAP-1的表达上调。结论奥沙利铂化疗可引起FAP-1表达的上调,增强肿瘤细胞对抗Fas诱导的细胞凋亡。这可能与结肠癌对奥沙利铂化疗的耐药相关。     

氟尿嘧啶对人结肠癌SW480细胞ABCG2表达的影响

目的观察氟尿嘧啶（5-FU）对人结肠癌SW480细胞ABCG2表达的影响。方法用不同药物浓度的5-FU处理SW480细胞,用CCK8法检测5-FU在SW480中的IC50,流式细胞仪检测SW480细胞ABCG2的阳性表达率．RT—PCR检测ABCG2的mRNA在SW480细胞中的表达差异。结果5-FU对SW480细胞的IC50随着药物浓度的增加而升高（P〈0．05）。流式细胞仪检测发现,正常SW480细胞（A组）中ABCG2阳性表达率为（6．26±0．86）％;在药物处理48h后即刻检测时（B组）的阳性表达率下降至（3．43±1．18）％（P〈0．05）;在药物处理48h后的第2代细胞检测时（c组）则升高至（12．91±3．42）％（P〈0.05）。3组ABCG2mRNA表达趋势与流式细胞仪检测结果的趋势一致。结论不同浓度的5-FU可以影响人结肠癌SW480细胞ABCG2的表达。     

脆性组氨酸三联体基因对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨脆性组氨酸三联体基因（FHIT）转染对结肠癌细胞株SW480增殖和凋亡的影响及其作用机制.方法 将重组真核表达质粒pRc/CMV2-FHIT通过脂质体转染技术导入人结肠癌细胞株SW480（实验组）,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染了空质粒pRc/CMV2的SW480细胞作为阴性对照,以正常SW480细胞作为空白对照.应用MTT法检测细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡率,Western blot分析caspase-8酶原的变化,半定量RT-PCR检测caspase-8 mRNA水平的改变,肽核酸标记底物的比色法检测caspase-8的相对活性.结果 转染96 h后,实验组和阴性对照组细胞生长抑制率分别为71.7%和16.9%,G0/G1细胞比例分别为（63.3±3.5）%和（50.6±2.1）%,细胞凋亡率分别为（40.5±3.1）%和（18.6±2.6）%,caspase-8 mRNA条带光密度积分值分别为107和41,caspase-8蛋白相对活性分别为0.43和0.25;上述差异均有统计学意义（P＜0.05）.当加入FHIT抑制剂后,caspase-8蛋白相对活性恢复至对照组水平（0.22）.结论 FHIT基因转染能够明显抑制人结肠癌细胞株SW480的增殖,诱导SW480细胞发生G0/G1期阻滞,其作用机制可能与caspase-8表达及活性上调有关.     

紫草素下调CXCR4表达及抑制结肠癌细胞株SW480在CXCL12诱导下的定向迁移

目的探讨紫草素对结肠癌细胞增殖、CXCR4表达及对CXCL12诱导的定向迁移能力的影响。方法采用MTT法观察紫草素对SW480细胞增殖的影响,流式细胞仪检测紫草素对SW480细胞表面CXCR4表达的影响．Transwell方法观察紫草素对SW480细胞定向迁移能力的影响。结果紫草素对SW480细胞生长有抑制作用．这种抑制作用随着药物浓度的升高和作用时间的延长而增强。SW480细胞CXCR4阳性表达率为（99．1±0．7）％,用紫草素0.01、0．1及1．0μmol／L作用24h后,CXCR4阳性表达率分别降至（76．0±2．4）％、（59．1±2．5）％和（35．5±1．9）％（F=1098．041．P〈0．001）。上述不同浓度紫草素对CXCL12诱导的SW480迁移抑制率分别为25．2％、38．5％和55．7％（F=48．970,P〈0．001）。结论紫草素除了抑制结肠癌细胞增殖外,还可能通过下调CXCR4表达从而抑制肿瘤细胞在CXCL12诱导下的定向迁移。     

RNA干扰靶向抑制磷脂酰肌醇3-激酶P85α蛋白表达对结直肠癌细胞周期和细胞凋亡的影响

目的探讨RNA干扰靶向抑制磷脂酰肌醇3-激酶（P13K）P85α蛋白表达对结直肠癌细胞周期与细胞凋亡的影响。方法设计4条shRNA干扰载体及1条阴性对照载体．分别稳定转染结直肠癌SW480细胞。采用Western blot筛选出对P13K P85α蛋白抑制效率最高的shRNA干扰片段．然后通过PI标记法和Annexin V—FITC标记法分别检测干扰后SW480细胞周期和细胞凋亡情况。结果转染shRNA／324后．SW480细胞P13K P85α蛋白降低最为显著．抑制率为90％。选择该干扰片段进行后续实验。干扰组与对照组SW480细胞的G1期细胞数量分别占（62．4±2．7）％和（51．2±3．5）％;S期细胞数量占（23．9±1．7）％和（34．1±3．4）％;氟尿嘧啶所诱导的细胞凋亡率为（11．1±3．7）％和（1．4±0．6）％;上述差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论P13K P85α蛋白表达下降可引起结直肠癌SW480细胞周期阻滞,细胞凋亡增加：PI3K P85α可能成为结直肠癌基因治疗的新靶点。     

Wnt通路激活的结直肠癌细胞抑制肿瘤浸润性树突细胞成熟的机制研究

［摘要］ 目的 大部分肠癌存在Wnt通路激活,基础研究发现Wnt通路可影响肿瘤免疫,但其在结肠癌中的作用不明。本研究主要探讨Wnt通路激活对结肠癌免疫微环境的影响以期发现结直肠癌免疫治疗新靶点。方法 免疫荧光技术验证SW480和NCM460 Wnt通路状态;qPCR和Western blot技术对比Wnt通路激活的结肠癌细胞系SW480和正常肠上皮细胞NCM460 IL?1β表达水平的不同;分离人外周血单核细胞,用集落刺激因子（GM?CSF）和IL?4联合诱导形成未成熟树突细胞（iDC）,再加入IL?1β刺激诱导成熟树突细胞（mDC）,用流式细胞技术检测mDC细胞表面成熟分子表达量。结果 SW480细胞核表达beta?catenin,提示Wnt通路激活。使用Wnt通路抑制剂（ICG?001）处理SW480后IL?1β mRNA和蛋白表达水平均升高,且随浓度升高而升高,使用wnt通路激活剂（Licl）处理NCM460后IL?1βmRNA和蛋白表达水平均低于对照组,且随浓度升高而降低,且IL?1β蛋白表达量均与非磷酸化β?连环蛋白（active β?catenin）表达量呈负相关关系。IL?1β可促进iDC成熟,IL?1β 50 ng/mL组HLA?DR、CD86表达率分别为（69±3.62）%、（84.3±4.7）%,与RPMI组及TNF?a 10 ng/mL组相比,表达显著上调（P<0.001）。结论 Wnt通路激活的结直肠癌可能通过减少IL?1β的表达来阻碍肿瘤微环境中DC的成熟。     

γ-synuclein基因真核表达载体的构建及其对结肠癌细胞SW1116体外侵袭转移潜能的影响

目的构建针对γ-synuclein基因的真核表达载体并观察其对结肠癌细胞sw1116体外侵袭及与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）黏附能力的影响。方法从结肠癌细胞系HT29提取总RNA,经RT．PCR获得γ-synucleincDNA全长片段,经过酶切连接等反应定向克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1上,以脂质体转染的方法将重组质粒转染至结肠癌细胞系SW1116,经G418筛选出稳定转染的细胞株。采用Transwell小室法检测细胞体外侵袭能力。将细胞接种于铺有HUVEC的96孔板中,酶标仪读取荧光强度来表示黏附细胞的相对数。结果成功构建pEGFP-γ-synuclein真核表达载体,经过筛选后可在SW1116细胞中稳定表达,且能在体外翻译出GFP-γ-synuclein融合蛋白质。转染γ-synuclein后,穿过Matrigel胶及Transwell小室膜的细胞数明显增加（198．4±20．7比98．8±13．2,P〈0．05）,与HUVEC黏附的细胞数（荧光强度）亦显著增加（3．08±0．36比1．22±0．21,P〈0．05）。结论γ-synuclein可显著增强结肠癌细胞SW1116体外侵袭转移潜能。     

原花青素对人结肠癌细胞SW620增殖和凋亡的影响

目的:观察葡萄籽提取物原花青素对人结肠癌细胞株SW620细胞增殖和凋亡的影响。方法:SW620细胞与20、40、60、80μg/mL的原花青素共同孵育24h～8d,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术分析细胞凋亡情况,分光光度法检测Caspase-3酶活性。结果:不同浓度(20～80μg/mL)的原花青素对SW620细胞的生长有明显的抑制作用,呈现出一定的剂量依赖性;含原花青素20、40、80μg/mL的观察组细胞凋亡发生率分别为6.9%、18.6%及22.9%,不含药的对照组细胞凋亡发生率为1.3%。SW620细胞与含药(40μg/mL)或不含药的培养基共同培养48h或72h,对照组细胞几乎无法检出Caspase-3酶活性,而给药组细胞活性显著增加。结论:原花青素在体外可呈浓度依赖性抑制人结肠癌细胞株SW620的增殖并通过Caspase-3通路促进其凋亡。     

miR-338-5p在结直肠癌组织中的表达及其对结肠癌细胞增殖的影响

目的探讨miR-338-5p在结直肠癌组织中的表达状况,以及miR-338-5p过表达对结肠癌细胞系HCT116和SW620增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法使用实时定量PCR方法检测miR-338-5p在40例临床诊断为结直肠癌患者配对癌组织及癌旁组织中的表达情况。随后使用miR-338-5p-mimics转染结肠癌细胞系HCT116和SW620,确认过表达成功后,分别使用CCK-8法、FITC-AnnexinV．PI法及Propidiumiodide法检测肿瘤细胞的增殖、凋亡和细胞周期的改变。结果①miR-338-5p在结直肠癌组织中的表达明显低于其在相应的癌旁组织中的表达（P〈0．01）。②与转染阴性对照比较,转染miR-338．5p．mimics后,HCT116和SW620细胞增殖能力明显减弱（P〈0．01）,凋亡率明显增加[HCT116细胞：（11．43±0．67）％比（7．98±0．36）％,P〈0．01;SW620细胞：（10．5±0．2）％比（7．93±0．5）％,P〈0．01],诱导HCT116和SW620细胞G1期阻滞[HCT116细胞：（80．41±1.34）％比（64．87±1．83）％,P〈0．01;SW620细胞：（68．76±0．41）％比（54．89±0．78）％,P〈0．01]。结论miR-338-5p可能作为抑癌基因在结直肠癌中发挥作用,并对细胞增殖、凋亡和周期有显著影响。     

IL-18基因转染大肠癌细胞及对其肿瘤原性改变的研究

目的：建立转染人白细胞介素-18（hIL-18）基因的大肠癌细胞株,并研究IL-18基因转染后SW480细胞肿瘤原性的改变。方法：将携带hIL-18的质粒pcDNA3.1-hIL-18转导入人大肠癌细胞系SW480细胞中,通过药物G-418进行筛选,利用RT-PCR和ELISA法对IL-18的表达进行检测;通过裸鼠致瘤实验观察肿瘤原性的改变。结果：IL-18基因成功转导入SW480细胞中并能顺利表达;RT-PCR电泳结果显示IL-18基因在mRNA水平有表达;ELISA结果显示,106个转染细胞在24 h内分泌IL-18的含量是（145.71±4.42）pg;空载体转染的细胞未检测到hIL-18;生长曲线显示转染hIL-18基因后的细胞生长明显减慢;黏附曲线显示SW480-hIL-18组的黏附率在各个时相点均明显升高,而空载体组和空白对照组之间差异无统计学意义（P〈0.05）。裸鼠致瘤实验表明,接种SW480-hIL-18细胞的裸鼠肿瘤体积明显小于SW480组和SW480-pcDNA3.1组;抗瘤实验结果显示,放射灭活的SW480-pcDNA3.1细胞和SW480-hIL-18细胞免疫接种裸鼠后,再接种SW480细胞于裸鼠左侧背部皮下,SW480-hIL-18细胞免疫接种组肿瘤长出的时间比SW480-pcDNA3.1细胞免疫接种组明显延长,并且肿瘤的生长速度明显低于SW480细胞免疫接种组。结论：hIL-18基因能成功整合到SW480细胞基因组中,并且能在转染的肿瘤细胞中持续表达。hIL-18基因转导后的SW480细胞生长受到抑制,黏附能力增强h,IL-18基因转染降低了SW480细胞的肿瘤原性;hIL-18基因修饰的SW480细胞具有明显的抗肿瘤作用,为大肠癌基因工程肿瘤疫苗的研制提供了实验基础。     

与放疗抵抗相关的长链非编码RNA在不同放疗敏感性结直肠癌细胞株中的表达

目的 筛选与结直肠癌细胞放疗敏感性相关的长链非编码RNA（lncRNA）.方法 将HT29、SW480、RKO、Lovo和HCT116等5株结直肠癌细胞梯度照光后行克隆形成实验,通过细胞存活率（SF2值）来检测5株细胞的放疗敏感性差异;利用高通量lncRNA芯片筛选在SW480、RKO和Lovo细胞株中两两比较表达差异均大于2倍的lncRNA,并通过实时定量PCR进一步检测所选lncRNA在5株结直肠癌细胞中的表达差异.结果 5株结直肠癌细胞放疗敏感性由低至高（即SF2值由高至低）依次为HT29 （0.83±0.03）、SW480 （0.69±0.02）、RKO （0.53±0.02）、Lovo （0.47±0.05）和HCT116（0.32±0.03）（P＜0.01）.lncRNA芯片筛选得到5种与结直肠癌细胞放疗敏感性相关的lncRNA基因,其中R05532、NR_015441和NR_033374基因表达水平与细胞放疗抵抗呈正相关（均P＜0.01）,而NR_073156和AA745020基因表达水平与细胞放疗抵抗无明显相关性（均P＞0.05）.结论 R05532、NR_015441和NR_033374三种lncRNA可能成为结直肠癌细胞放疗敏感性的预测分子,其高表达提示放疗抵抗。