X射线诱导人肺腺癌A549细胞凋亡及线粒体DNA基因表达下调

目的 研究不同剂量X线对人肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的影响，并检测其线粒体DNA（mtDNA）基因的差异表达。方法 以同步培养的未受照细胞为对照，8MVX线分别以2、4、6和8Gy的吸收剂量照射A549细胞，MTT比色法分析细胞增殖曲线；并于照射后24h，流式细胞仪测定细胞周期分布和凋亡率，电镜观察细胞超微结构，人mtDNA基因表达谱芯片检测靶基因的表达变化。结果X射线抑制A549细胞增殖，以4Gv为显著；随着照射剂量的增加，细胞凋亡率增加，G2／M期细胞比率增加，6和8Gy组表现出G2／M期阻滞，透射电镜下4Gy组可见凋亡的形态改变，8Gy组细胞近碎裂；X射线照射后mtDNA编码基因呈普遍下调表达，包括2Gy组的3种tRNA基因、4Gy组的2种tRNA基因和4种mRNA基因、6Gy组的6种tRNA基因和1种rRNA基因，8Gy组的2种tRNA基因。结论X射线可抑制A549细胞增殖，诱导细胞凋亡及mtDNA编码基因的普遍下调表达。随着辐射剂量的增加，剂量依赖性效应逐步减弱而解除。4Gy为体外研究的相对高效、安全剂量。     

应用基因芯片技术筛选曲古菌素A诱导肺腺癌耐药细胞株A549/CDDP差异表达的凋亡基因

目的 应用基因芯片技术筛选曲古菌素A(TSA)处理顺铂耐药肺癌细胞株A549/CDDP后的凋亡相关基因的表达变化,筛选TSA治疗顺铂耐药肺癌的靶分子.方法 TSA处理A549/CDDP细胞24h,以未经TSA处理的A549/CDDP细胞作为对照组,提取两组细胞总RNA并反转录为cDNA,采用NimbleGen全基因组表达芯片检测基因表达情况,以NimbleScan 2.5软件结合GO分析比较TSA处理组与对照组基因表达谱的变化,从差异表达基因中筛选出与凋亡和增殖相关的基因.结果 与对照组相比,共筛选到TSA上调的凋亡相关基因85个以及下调的细胞增殖和生长相关基因43个.GO分析发现,这些基因的分子功能主要是调节细胞凋亡和细胞对化学刺激的抵抗作用,以及参与细胞生长、增殖、细胞生物质量维持等生物过程.TSA不仅激活了线粒体凋亡通路,而且激活了死亡受体相关凋亡通路,下调了与细胞耐药相关的基因BAG3和ABCC2.结论 TSA改变了A549/CDDP细胞中凋亡和增殖基因的表达,这些基因可能在TSA治疗顺铂耐药肺癌中发挥了重要作用.     

衣霉素对顺铂诱导人宫颈癌细胞凋亡的影响

目的 探讨内质网应激在顺铂诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡中的作用.方法 取人宫颈癌HeLa细胞作为研究对象,实验分为衣霉素(5mg/L)组、顺铂(6mg/L)组、衣霉素(5mg/L)与顺铂(6mg/L)联合给药组、阴性对照组,处理12h后采用MTT法观察细胞生长情况,Hoechst荧光染色检测细胞核形态的变化,免疫印迹法检测凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-4活化情况,间接免疫荧光法检测蛋白质二硫键异构酶(PDI)、磷酸化H2AX组蛋白(γ-H2AX)的表达变化.结果 MTT法检测显示衣霉素组、顺铂组、联合给药组和阴性对照组的细胞增殖抑制率分别为2.65％±2.71％、19.60％±4.34％、44.69％±7.07％、0,除衣霉素组与对照组外其余各组间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).Hoechst染色显示,阴性对照组荧光较弱且均匀,顺铂组和联合给药组部分HeLa细胞核明显变小并呈现致密强荧光,部分细胞核呈碎块状,联合给药组核碎裂细胞比例(44.5％±5.1％)显著高于顺铂组(22.7％±3.9％,P＜0.05).免疫印迹法检测显示,顺铂组裂解Caspase-3、Caspase-4蛋白表达明显高于对照组和衣霉素组,但显著低于联合给药组(P＜0.05).间接免疫荧光法检测显示:顺铂组胞质内无PDI表达,荧光较弱;衣霉素组、顺铂组PDI蛋白均呈颗粒状,分布于核周,荧光较强;联合给药组大部分细胞内PDI呈现明显强荧光,荧光强度明显高于衣霉素组和顺铂组.阴性对照组和衣霉素组细胞核内未见γ-H2AX表达,而顺铂组与联合给药组均可见部分细胞核内出现明显绿色荧光,但两组无明显差异.结论 衣霉素可增加内质网应激水平,促进顺铂诱导HeLa细胞发生凋亡.     

X射线对人肺腺癌A549细胞增殖及线粒体DNA基因表达的影响

目的 研究X射线辐射对人肺腺癌A549细胞增殖及线粒体DNA(mtDNA)基因表达的影响。方法 8 MV X射线以4 Gy的吸收剂量照射A549细胞,照射后不同时间检测细胞周期分布和凋亡率,电镜下观察细胞超微结构,人mtDNA基因表达谱芯片检测靶基因的表达变化。结果 照射后12 h即出现G₂/M期的阻滞,凋亡率在照射后48 h达到峰值,透射电镜下可见凋亡的形态改变。X射线照射后mtDNA编码基因表达呈普遍下调,包括12 h组的1种tRNA和4种mRNA基因、24 h组的2种tRNA和4种mRNA基因、48 h组的13种mRNA和2种rRNA及4种tRNA基因、72 h组的11种mRNA和2种rRNA基因。结论 X射线辐射可导致A549细胞G₂/M期阻滞,mtDNA编码基因的普遍低表达可能和辐射诱导凋亡相关。     

电离辐射对肺腺癌细胞A549线粒体的影响

目的 研究电离辐射对肺腺癌细胞A549线粒体的影响。方法 0、0.5、3和8 Gy ⁶⁰Co γ射线照射A549细胞后,利用JC-1探针检测照射后肺腺癌细胞A549线粒体膜电位的变化;使用ATP试剂盒检测辐射对A549细胞ATP生成的影响;利用实时定量PCR方法检测线粒体拷贝数。结果 在照射后24 h,各剂量组A549细胞膜电位出现明显改变（F=243.44,P<0.05）,与0 Gy照射组相比,0.5和3 Gy照射的A549细胞线粒体膜电位显著升高（t=-10.12、-5.59,P<0.05）,而8 Gy照射的线粒体膜电位显著降低（t=15.22,P<0.05）,照后48 h各照射组线粒体膜电位基本恢复正常（F=10.36,P<0.05）;照射后24 h ATP水平与膜电位变化趋势一致（F=97.08,P<0.05）,其中0.5和3 Gy A549细胞中ATP水平升高（t=1.66、7.27,P<0.05）,8 Gy照射组降低（t=-8.24,P<0.05）;照射后48 h,ATP水平也发生变化（F=39.49,P<0.05）,0.5和3 Gy照射后A549细胞中ATP水平显著高于0 Gy组（t=4.60、8.53,P<0.05）。照射后24 h线粒体拷贝数显著增加,其中0.5 Gy mtDNA拷贝数增加至对照组的12倍（t=0.02,P<0.05）,3和8 Gy组mtDNA拷贝数分别增加至对照组的7和10倍（t=9.68、15.10,P<0.05）。结论 大剂量电离辐射会导致A549细胞线粒体膜电位降低,从而影响ATP的生成,中等剂量以下的照射会导致A549细胞线粒体膜电位代偿性增高,从而使ATP的生成增多,8 Gy以内的电离辐射可使mtDNA拷贝数代偿性升高。     

顺铂和放疗联合应用诱导人喉鳞癌细胞凋亡及其相互作用

本文作者研究了射线和顺铂(DDP)以不同的方式联合应用于早期头颈部癌(HNSCC)细胞株的效应，以探讨它们之间的相互作用和最佳作用顺序。     

HRAD17过表达促进辐射损伤诱导的A549细胞凋亡

目的 探讨HRAD17对辐射损伤诱导细胞凋亡的影响及其机制。方法 将HRAD17转染人肺癌细胞A549经⁶⁰Co γ射线照射后观察细胞凋亡变化。用Western blot 检测凋亡相关基因表达水平,RT-PCR检测凋亡相关基因转录水平。结果 HRAD17转染可促进γ射线诱导的细胞凋亡。与对照组相比,HRAD17转染组p53蛋白Ser 46磷酸化和p53 AIP1基因转录明显增强。结论 HRAD17可促进辐射损伤诱导的细胞凋亡, 其部分机制可能是通过提高p53 AIP1的表达来实现的。     

胰岛素对人肺腺癌细胞A549的化疗增敏作用

目的探讨用胰岛素提高人肺腺癌细胞A549生长代谢水平后对其化疗敏感性的影响。方法采用MTT法检测顺铂对A549细胞抑制率达30%时的药物浓度(IC30),检测胰岛素促进细胞增殖的最佳作用浓度和最佳作用时间,并检测不同浓度及不同时间胰岛素作用后对A549细胞化疗敏感性的影响。用流式细胞仪测定胰岛素对A549细胞周期的影响。结果顺铂的IC30约为36.87μg/ml;胰岛素促进细胞增殖的最佳作用浓度为4.0～16mU/ml,取8mU/ml为终浓度时,胰岛素促进细胞增殖的最佳作用时间为8～16h;胰岛素(2.0～16.0mU/ml,8～16h)可增强顺铂(36.87μg/ml)的细胞毒作用(P<0.01)。流式细胞仪分析显示,胰岛素(8mU/ml)作用4～12h,S期细胞随作用时间延长而逐渐增多,但作用16h后S期细胞数目又逐渐接近于对照组水平。结论胰岛素可通过提高人肺腺癌细胞A549的生长代谢水平而提高顺铂对该细胞的抑制率,且该作用呈时间和浓度依赖性。     

mRNA差异显示技术对硫芥诱导细胞凋亡基因表达的研究

ｍＲＮＡ差异显示技术对硫芥诱导细胞凋亡基因表达的研究孙俊孙曼霁军事医学科学院毒物药物研究所北京１００８５０１９９２年美国哈佛大学医学院的Ｌｉａｎｇ和Ｐａｒｄｅｅ首次应用ｍＲＮＡ差异显示（ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙｍＲＮＡｂｙＰＣＲ，ＤＤ－Ｐ...     

红芪多糖诱导肺腺癌细胞凋亡与Bax/Bcl-2表达的研究

目的:探讨红芪多糖对A549细胞凋亡及Bax/Bcl-2 mRNA表达的影响。方法:MTT法检测红芪多糖对A549细胞生长的抑制作用,流式细胞仪检测红芪多糖对A549细胞凋亡的影响,RT-PCR法检测红芪多糖对A549细胞Bcl-2、Bax mRNA表达的影响。结果:不同浓度的红芪多糖对肺腺癌细胞生长均有抑制作用,抑制率与浓度呈正相关;不同浓度红芪多糖均可诱导A549细胞凋亡,并呈现浓度依赖性;不同浓度红芪多糖均可降低Bcl-2蛋白的表达,相应提高Bax蛋白的表达,呈浓度依赖性。结论:红芪多糖可抑制A549细胞生长,并诱导其凋亡,且可能通过调节细胞内Bax和Bcl-2的表达从而诱导A549细胞凋亡。     

顺铂诱导人小细胞肺癌多药耐药细胞系NCI-H446/CDDP的建立及其生物学特征分析

目的　建立人小细胞肺癌多药耐药细胞系 ,鉴定其细胞生物学特性。方法　以顺铂为诱导药物 ,人小细胞肺癌细胞系NCI H4 4 6为诱导对象 ,采用首次大剂量冲击和逐步增加剂量结合的方式 ,建立人小细胞肺癌多药耐药细胞系NCI H4 4 6 /CDDP。细胞计数法绘制生长曲线 ,计算其倍增时间 ;MTT法测定细胞IC50 ,计算其耐药指数 ;光学显微镜、扫描电镜和透射电镜观察其形态。结果　经过 8个月的诱导 ,成功建立了人小细胞肺癌多药耐药细胞系NCI H4 4 6 /CDDP ;生长曲线测定结果表明 ,亲代和耐药细胞增殖速度接近 ,其倍增时间分别为 4 0 72h和 4 1 80h;流式细胞仪检测细胞周期发现 ,耐药细胞系中S期细胞所占比例为 2 0 2 4 % ,亲代细胞系中S期细胞所占比例为18 4 2 % ,二者比较差异有统计学意义 (P <0 0 5 ) ,而G0 /G1和G2 /M期细胞无显著性变化 ;MTT结果表明 ,耐药细胞系对顺铂、羟基喜树碱、长春新碱、5 氟尿嘧啶和拓扑替康等 5种化疗药物有不同程度的耐受性 ,其耐药指数分别为 85 0 0、4 2 75、6 0 2 8、2 4 31、12 4 7;细胞超微结构显示 ,耐药细胞较其亲代体积增大 ,核浆比例降低 ,线粒体、高尔基体、粗面内质网和游离核糖体增多 ,细胞表面指状突起增多。结论　NCI H4 4 6 /CDDP细胞生物学性状稳定 ,是一     

bcl—2高表达细胞株的构建及其抗凋亡特性的观察

目的：建立ｂｃｌ－２高表达的肿瘤细胞株，观察其抗凋亡特性。方法：利用基因转染技术，将人的ｂｃｌ－２基因ｃＤＮＡ克隆于逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ，通过ＰＡ３１７细胞包装成病毒后感染宫颈癌ＨｅＬａ细胞。结果和结论：经ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证明转染成功，得到ｂｃｌ－２稳定高表达株Ｈｂｃ１７。用顺铂诱导凋亡，Ｈｂｃ１７比对照细胞株Ｈ１具有更明显的抗凋亡能力。为进一步研究细胞凋亡的机理奠定了基础。     

三氧化二砷诱导NB4细胞凋亡相关基因表达改变的基因芯片研究

目的 利用基因芯片技术研究NB4细胞经三氧化二砷(As2O3)诱导凋亡后的凋亡相关基因表达变化.方法 检索NCBI的Entrez以及Human IPI数据库,通过染色体定位来排除冗余基因,共获得1 384个凋亡相关基因.探针使用软件OligoArray 2.0设计,并作Blast比对.设计基因特异寡核苷酸探针,合成后点样,制备寡核苷酸芯片.用2μmol/L的As2O3处理NB4细胞48h后,提取细胞总RNA,分别以Cy3,Cy5标记对照组及实验组,随后与含1 384个凋亡相关基因的寡核苷酸芯片杂交,使用基因芯片扫描仪对杂交信号扫描,软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值,找出经As2O3处理后出现差异表达的基因,并挑选其中差异表达最明显的4条基因,设计引物后与CNDA产物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳进行验证.结果 NB4细胞经2μmol/L As2O3作用48h后共有4个基因表达上调,12个基因表达下调,且RT-PCR验证结果与基因芯片结果完全相符.结论 As2O3可以诱导NB4细胞一系列基因表达的改变,这些涉及信号转导、转录调节、细胞周期、氧化应激、蛋白质的翻译合成及细胞分化等方面基因的差异表达,可能在NB4细胞凋亡中起着重要作用.     

PCGF1过表达慢病毒载体的构建及稳定过表达A549细胞系的建立

目的 构建人多梳家族环指蛋白1(PCGF1)基因的慢病毒载体,建立稳定表达PCGF1基因的细胞系.方法 根据人PCGF1序列设计并合成引物,以A549细胞cDNA为模板,PCR扩增目的基因.双酶切目的基因并插入pLVX-IRES-puro质粒,对重组质粒进行慢病毒包装,用包装好的病毒感染A549细胞系,通过嘌呤霉素筛选阳性表达细胞,Western blotting验证PCGF1表达情况.结果 重组质粒经测序分析正确,瞬时转染293T细胞后,Western blotting验证PCGF1表达明显升高.包装慢病毒颗粒后感染A549细胞,经嘌呤霉素筛选后,Western blotting验证得到PCGF1稳定过表达的A549细胞系.结论 成功构建了pLVX-IRES-PCGF1-puro慢病毒过表达载体和PCGF1稳定过表达的A549细胞系,为进一步研究PCGF1的功能奠定了基础.     

顺铂体外诱导的人肝癌耐药细胞株(QGY/DDP)的建立

目的 建立顺铂(DDP)诱导的人肝癌耐药细胞株(QGY/DDP),研究其生物学特性和耐药机制.方法 采用间歇诱导法,逐步递增DDP浓度,获得耐药细胞株QGY/DDP;MTT法测定药物敏感性;细胞计数法计算倍增时间,流式细胞术检测细胞周期;原子吸收光谱法测定细胞内铂离子蓄积量,流式细胞仪测定P-糖蛋白(P-gp)和谷胱甘肽S-转移酶-π(GST-π)的表达水平.结果 成功建立了顺铂诱导的人肝癌耐药细胞株QGY/DDP,耐药指数为10.81,与5-氟尿嘧啶、长春新碱等抗癌药有明显的交叉耐药;与QGY细胞相比,QGY/DDP细胞增殖减慢、倍增时间延长,G0/G1期细胞增多、S期与G2/M期细胞减少,细胞内Pt含量降低,GST-π的表达升高,而P-gp无明显变化.结论 QGY/DDP细胞具有耐药表型及耐药细胞的生物学特性;其耐药机制与细胞内Pt含量降低和GST-π过表达有关,而与P-gp无关.     

失血性休克大鼠小肠上皮细胞线粒体DNA、COX基因损伤的研究

目的探讨失血性休克对大鼠肠上皮细胞线粒体DNA编码细胞色素氧化酶基因的损伤作用。方法采用失血性休克模型,提取肠上皮细胞线粒体DNA,对细胞色素氧化酶(COXI、COXII、COXm)基因进行PCR扩增,并对PCR产物进行直接测序。结果细胞色素氧化酶COX工、COXII基因序列产生散在性点突变,其中1只休克鼠细胞色素氧化酶COX工基因从5545～6838出现了35个散在性点突变;1只休克鼠COXII序列在7191～7542有5个点突变(t7191c、t7212c、a7386g、a7483g、c7542g);COXm未出现突变。结论失血性休克缺血缺氧可造成线粒体DNA编码的细胞色素氧化酶基因损伤。     

人类解旋酶样转录因子过表达促进辐射诱导的A549细胞凋亡

目的 探讨人类解旋酶样转录因子(HLTF)对辐射诱导细胞凋亡的影响及其机制。方法 将空质粒和带FLAG标签的HLTF表达质粒分别转染人肺癌细胞A549,⁶⁰Co γ射线照射观察细胞凋亡变化。用Western blot 检测HLTF在细胞核和胞质内水平的变化及线粒体细胞色素C的释放。结果 HLTF转染可促进γ射线诱导的细胞凋亡,凋亡率为(32.2±2.1)%,高于空载体转染组(11.4±2.3)%和Mock转染组(11.1±1.8)%(F=101.85,P<0.01)。辐射后HLTF在胞质内的表达水平显著提高。HLTF转染组胞质内细胞色素C的水平亦显著提高。结论 HLTF可促进辐射损伤诱导的细胞凋亡, 其部分机制可能是通过提高核质转位以及影响线粒体细胞色素C的释放来实现的。