高浓度葡萄糖损伤人腹膜间皮细胞分子机制的研究

目的：探讨高浓度葡萄糖损伤人腹膜间皮细胞的机制。方法：（1）人腹膜间皮细胞分别经含1．5％、2．5％、4．25％葡萄糖的M199培养基培养48小时后，检测间皮细胞线粒体膜电位（Ψ）、凋亡率、caspase-3活性、bax和bcl-2基因mRNA表达；（2）分别用0．1μmol／L和0．01μmol／L环孢素A（CsA）与4．25％葡萄糖共同作用人腹膜间皮细胞，检测细胞凋亡率和caspase-3活性。结果：（1）随着葡萄糖浓度增加，Ψ丧失的细胞百分率、bax mRNA表达量、caspase-3活性、凋亡率增加（P〈0．05），而bcl-2 mRNA表达量减少；（2）随着葡萄糖浓度增加，bax mRNA的表达量与皿丧失的间皮细胞百分率呈显著正相关（P〈0．01）；bcl-2 mRNA的表达量与Ψ丧失的间皮细胞百分率呈显著负相关（P〈0．01），Ψ丧失的间皮细胞百分率与间皮细胞凋亡率、caspase-3活性呈显著正相关（P〈0．01）：（3）0．1μmol／L CsA组间皮细胞凋亡率和caspase-3活性显著低于高糖对照组（P〈0．05）。结论：（1）高糖可能通过上调bax基因表达和下调bcl-2基因表达，诱导人腹膜间皮细胞线粒体活化、caspase-3活化和凋亡。（2）高糖诱导人腹膜间皮细胞caspase-3活化和凋亡可能依赖于线粒体活化。     

一氧化氮对腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性的影响

目的通过观察一氧化氮对腹膜间皮细胞醛糖还原酶（AR）活性的影响，探讨一氧化氮对腹膜间皮细胞醛糖还原酶的调节作用。方法采用人的网膜作为细胞来源，胰蛋白酶-EDTA消化法进行人腹膜间皮细胞（HPMC）的分离、培养，间接免疫荧光法对第二代细胞进行鉴定。第2-3代细胞用于实验。以硝普纳为一氧化氮供体，硝普纳（0．5mmol／L、1mmol／L、2mmol／L）＋1．5％葡萄糖培养液为实验组，以无一氧化氮1．5％葡萄糖培养液为对照组，观察剂量及时间对腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性的影响。应用紫外分光光度计记录NADPH在340nm处吸光值的下降表示醛糖还原酶活性。结果高糖状态下各浓度一氧化氮组醛糖还原酶活性均高于对照组，且醛糖还原酶活性随一氧化氮浓度的增加而增加；一氧化氮＋葡萄糖组醛糖还原酶活性随着时间的延长而逐渐增加。各时点一氧化氮＋葡萄糖组醛糖还原酶活性均高于葡萄糖组。结论一氧化氮以时间及剂量依赖的方式使腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性增加。     

黄芪注射液对腹膜透析大鼠腹膜间皮细胞水孔蛋白1表达的影响

【目的】观察黄芪注射液对腹膜透析大鼠腹膜间皮细胞水孔蛋白1（AQP—1）表达的影响。【方法】选用雄性SD大鼠25只,分正常对照组（N=7）、模型组（N=9）和黄芪组（N=9）。除正常对照组外,其他两组分别腹腔注射含42．5马／L葡萄糖的腹透液和含42．5g／L葡萄糖的愎透液＋黄芪注射液（20mg／mL）,剂量为25mL／d,连续10d。于第11天观察大鼠透析超滤量（UF）与净超滤量（Net UF）、腹膜钠转运（D／P Na）、腹膜组织光镜病理形态及AQP-1免疫组化的表达．【结果】透析液留腹60min时黄芪组UF、Net UF与模型组比较显著增加（P〈0．05）。透析液留腹30min、60min时黄芪组D／P Na较模型组显著减低（P〈0．05）。黄芪组大鼠腹膜层增厚、间皮细胞脱落情况较模型组减轻,AQP—1在腹膜间皮细胞的表达较模型组显著增多（P〈0．05）【结论】黄芪注射液可减轻高浓度葡萄糖腹透液对间皮细胞的损伤,升高AQP—1在腹膜间皮细胞的表达,改善透析液留腹早期跨细胞水转运功能．从而提高腹膜对水的清除．增加透析超滤量。     

阿托伐他汀对大鼠腹膜间皮细胞在高糖作用下表达单核细胞趋化蛋白1的影响

目的研究阿托伐他汀（ATOR）对大鼠腹膜间皮细胞（PMC）在高糖作用下表达单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）的影响及机制。方法胰蛋白酶消化法分离培养PMC,经鉴定分组：（1）0．1％、1．5％、2．5％、4．25％葡萄糖组;（2）1．5％葡萄糖作用0、0．5、1、3、12、24、48h;（3）二硫氨基甲酸吡咯烷（PDTC）（5、10、25、50μmol／L）预孵育2h,加入1．5％葡萄糖再作用3h;（4）ATOR（0．1、1、10mmol／L）预孵育24h,加1．5％葡萄糖再作用3h。Western印迹检测MCP-1、IKBct和065表达情况;RT-PCR检测MCP-1mRNA的表达。结果正常PMC表达MCP-1;1．5％葡萄糖使PMC内IKBct减少（P〈0．05）、核内065增多（P〈0．01）、MCP．1mRNA和蛋白表达增多（均P〈0．05）,4．25％葡萄糖作用最大（P〈0．01）;1．5％葡萄糖作用0．5h,PMC内IκBα减少（P〈0．05）、核内065增多（P〈0．01）,3h达高峰（P〈0．01）;葡萄糖作用1hMCP-1mRNA明显增多（P〈0．01）,3hMCP-1蛋白表达增多（P〈0．01）,48h表达最多（P〈0．01）。5μmol／LPDTC抑制高糖诱导MCP-1mRNA和蛋白的表达（P〈0．05）,50μmol／LPDTC作用最大（P〈0．01）。0．1mmol／LATOR可抑制高糖作用下IκBα的减少（P〈0．05）、核内065的增多（P〈0．01）和MCP-1mRNA和蛋白的表达（P〈0．05）,10mmol／LATOR作用最强（P〈0．01）。结论高糖经NF-κB信号通路以时间和浓度依赖的方式诱导PMC表达MCP-1;阿托伐他汀可通过抑制NF-KB信号通路抑制PMC表达MCP-1。     

d-α-生育酚对高糖诱导的人腹膜间皮细胞己糖激酶表达的调节作用

目的探讨d-α-生育酚对高糖诱导的人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelium cell,HPMC)己糖激酶(hexokinase,HK)及其同工酶表达的调节作用。方法胰蛋白酶消化法分离培养HPMC,免疫细胞化学染色及扫描电镜对培养细胞进行鉴定。第3代HPMC分为正常对照组(0．1％葡萄糖,相当于5．5 mmol／L)、高糖组(0．5％、1．0％、1．5％、2．5％、4．25％的葡萄糖)及d-α-生育酚干预组。培养24 h后,利用6-磷酸葡萄糖脱氢酶耦联比色法和温度敏感实验检测HK及其同工酶的活性;免疫细胞化学染色检测HK蛋白的细胞内定位;Western印迹及逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)法分别检测HK蛋白及mRNA的表达。己糖激酶法检测培养液内葡萄糖的消耗量作为细胞对葡萄糖净利用指标。结果角蛋白和波形蛋白在HPMC的胞质呈阳性表达,扫描电镜可见细胞表面有丰富的微绒毛。1．5％、2．5％及4．25％葡萄糖组,HK总活性上调,与正常对照组(20．6±2．5)U／g蛋白比较,相对活性分别为115．4％、129．1％及155．2％,并以HKⅡ增加为主(P<0．05)。50 mmol／L d-α-生育酚干预组,HK总活性下调,是2．5％葡萄糖组的82．1％(P=0．001),其中HKⅡ受抑为主;d-α-生育酚干预后HPMC对葡萄糖的净利用由(25．3±3．9)mmol／L降至(17．3±2．1)mmol／L(P= 0．018)。正常状态下,HKⅡ蛋白在胞质呈棕色淡染;随葡萄糖浓度的增加(葡萄糖≥1．5％),HKⅡ在核周积聚、浓染,呈珠链样;d-α-生育酚预处理后,HKⅡ在核周的积聚变淡。HKⅡ蛋白及mRNA的表达与HKⅡ活性同步。结论d-α-生育酚抑制了高糖对HKⅡ活性、蛋白及mRNA表达上调的作用,并减少HPMC对葡萄糖的净利用;可能成为增加腹膜透析超滤的手段之一。     

牛磺酸降低高糖诱导的视网膜谷氨酸兴奋性及其机制

目的观察牛磺酸对高糖诱导的视网膜谷氨酸兴奋性的影响并探讨其作用的机制。方法体外培养并采用免疫细胞荧光双标鉴定视网膜Muller细胞。实验分10组,分别是：5mmol／L葡萄糖培养组（正常对照组）,5mmol／L葡萄糖＋0．1mmol／L牛磺酸培养组,5mmol／L葡萄糖＋1mmol／L牛磺酸培养组,5mmol／L葡萄糖＋10mmol／L牛磺酸培养组,25mmol／L葡萄糖培养组（高葡萄糖组）,25mmol／L葡萄糖＋0．1mmol／L牛磺酸培养组,25mmol／L葡萄糖＋1mmol／L牛磺酸培养组,25mmol／L葡萄糖＋10mmol／L牛磺酸培养组,5mmol／L葡萄糖＋20mmol／L甘露醇组（甘露醇对照组）。RT—PCR检测谷氨酸转运蛋白（GLAST）和谷氨酰胺合成酶（Gs）表达,p液闪技术检测谷氨酸摄取活性,谷氨酰胺合成酶检测试剂盒检测GS活性。结果25mmol／L高葡萄糖培养后Muller细胞中GLAST、GSmRNA表达量较正常对照组明显降低（P〈0．05）,L-[2,3-3H]-谷氨酸摄取活性由正常对照组的（726±12）cpro／（rain·mgprotein）降为（352±10）cpm／（min·mgprotein）,GS活性由（41．1±2．3）μmol／L γ-谷氨酰羟肟酸（GHA）／（h·nagprotein）降为（20．3±2．1）μmol／LGHA／（h·mgprotein）（P〈0．05）。加入1、10mmol／L牛磺酸干预可明显上调高葡萄糖组Miller细胞中GLAST、GSmRNA表达量,增加L-[2,3-3H]-谷氨酸摄取活性和GS活性（P〈O．05）。加入0．1mmoI／L牛磺酸干预可上调高葡萄糖组Mallet细胞中GLAST、GSmRNA表达量,增加L-[2,3-3H]-谷氨酸摄取活性和GS活性,与高葡萄糖组相比差异无统计学意义（P〉0．05）。甘露醇对照组Muller细胞中GLAST、GSmRNA表达量、L-[2,3-3H]-谷氨酸摄取活性和GS活性与正常对照组相比差异无统计学意义（P〉O．05）。结论牛磺酸能降低高糖引起的视网膜谷氨酸兴奋性,其作用机制可能通过上调Muller细胞谷氨酸转运和降解能力,从而维持细胞外空间正常的谷氨酸浓度。     

高糖联合低氧对体外培养的人视网膜色素上皮细胞HIF-1α及VEGF表达的影响

目的探讨高糖及高糖联合低氧对体外培养的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞低氧诱导因子1α（hypoxia—inducible factor-1α，HIF-1α）及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达的影响。方法通过使用化学低氧诱导剂CoCl2模拟RPE细胞低氧环境，研究RPE细胞分别在5．56mmol／L葡萄糖（对照组）、5．56mmol／L葡萄糖＋150μmol／L CoCl2（低氧组）、25mmol／L葡萄糖（高糖组）以及25mmol／L葡萄糖＋150μmol／L CoCl2（联合组）的培养条件下，通过反转录PCR检测HIF-1α及VEGF mRNA的表达，Western blot分析检测HIF-1α及VEGF蛋白水平。结果与对照组比较，高糖组RPE细胞HIF-1α mRNA表达无显著性差异，而高糖组可检测出微量的HIF-1α蛋白，对照组未能检测出HIF-1α蛋白；且高糖组VEGF mRNA表达和蛋白合成均增加（均P〈0．05）。与低氧组比较，联合组RPE细胞HIF-1α mRNA表达无显著性差异，但HIF-1α蛋白水平明显高于低氧组（P〈0．05）；同时VEGF mRNA表达和蛋白合成也均明显增加（均P〈0．05）。结论高糖对体外培养的人RPE细胞HIF-1α的影响是促进蛋白的合成，且对HIF-1α蛋白有一定的稳定作用，在联合低氧条件下高糖促进合成的HIF-1α蛋白更加稳定，同时也促进VEGF的表达增加。     

腹透液相关浓度葡萄糖对体外腹膜间皮细胞的影响

目的 研究腹透液相关的三种浓度葡萄糖（1．5％、2．5％、4．25％）对体外培养的腹膜间皮细胞凋亡及其形态的影响。方法 胰蛋白酶消化法从腹膜组织中分离间皮细胞，建立体外培养模型。采用Hoechst 33258荧光染色法及流式细胞仪技术测定体外培养的腹膜间皮细胞在腹膜透析液相关浓度葡萄糖作用下的凋亡率；采用透射电子显微镜技术观察高浓度葡萄糖对体外培养的腹膜间皮细胞形态学的影响。结果Hoechst 33258荧光染色法和流式细胞仪结果显示：与对照组比较，1．5％、2．5％、4．25％葡萄糖均能引起明显的腹膜间皮细胞的凋亡（P〈0．05），三种浓度葡萄糖组间也有显著的差异（P〈0．05），4．25％甘露醇能引起明显的凋亡（P〈0．01），4．25％葡萄糖与4．25％甘露醇比较，前者能引起明显的凋亡（P〈0．05）；与正常对照组比较，1．5％葡萄糖分别作用于腹膜间皮细胞24h、72h、120h，各时间组均出现明显的凋亡（P〈0．05）。腹膜间皮细胞的凋亡率与葡萄糖浓度和作用时间呈正相关（r〉0．7．P〈0.05）。透射电子显微镜观察4．25％葡萄糖作用72h后大鼠腹膜间皮细胞的形态变化：细胞表面的微绒毛倒伏、脱失；细胞质内出现线粒体空泡样变；细胞核内的染色质浓缩、边集；出现凋亡小体。结论 腹膜透析液相关的三种浓度葡萄糖和4．25％的甘露醇均能引起腹膜间皮细胞的凋亡；葡萄糖诱导的腹膜间皮细胞凋亡具有浓度和时间依赖性；葡萄糖引起的细胞凋亡不仅与其渗透压有关，还与葡萄糖代谢有关；葡萄糖引起的细胞形态改变有：腹膜间皮细胞表面的微绒毛倒伏、缺失；细胞质内的线粒体出现空泡样变：细胞核内出现染色质浓缩、边集的改变。     

Ang-1对高糖环境中猴脉络膜-视网膜内皮细胞单层通透性的影响

目的：利用猴脉络膜-视网膜内皮细胞建立内皮细胞（EC）单层模型,观察高浓度葡萄糖及血管生成素-1（Ang-1）对该模型通透性的影响．方法：待EC于孔径0．8μm的聚碳酸酯微孔滤膜上形成致密单层后分3组进行培养：对照组（DMEM培养基含25mmol／L葡萄糖）、高糖组（DMEM培养基含30mmol／L葡萄糖）、Ang-高糖组（DMEM培养基含30mmol／L葡萄糖＋0．25mg／L Ang-1）．于1,3,5,7d4个时间点,以含白蛋白1g／L的D—Hanks液灌注滤膜,检测蛋白质渗透压反射系数（8）及滤过系数（K1）;并于5d和7d利用琼脂糖凝胶电泳检测DNAladder．结果：3,5,7d时,高糖组EC单层的通透性高于对照组（P〈0．01）;Ang-高糖组与对照组之间EC单层的通透性无差异（P〉0．05）．高糖组EC的琼脂糖凝胶电泳在5d及7d均出现DNA ladder,对照组及Ang-高糖组未见DNA ladder．结论：高糖能够促进细胞凋亡,增加EC单层通透性;Ang-1能抑制EC的凋亡,对抗高糖所致的EC单层通透性增高．     

硫氢化钠对高浓度葡萄糖环境下原代人脐静脉内皮细胞的影响

目的 观察硫氢化钠(NaHS,外源性的H2S供体)对高浓度葡萄糖环境下原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的作用。方法 以0.125%胰酶和0.01%EDTA灌注法获得HUVECs,分别用5.5mmol/L葡萄糖、25mmol/L葡萄糖、25mmol/L葡萄糖+50μmol/L NaHS及50μmol/L NaHS处理72h,采用MTT法检测各组细胞的存活率,Western blot法检测H2S生成酶胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-Iyase,CSE)的变化。结果 MTT检测表明,25mmol/L葡萄糖组的HUVECs存活率比5.5mmol/L葡萄糖组下降28.37%(P<0.05),而50μmol/L NaHS和25mmol/L葡萄糖共同处理组的细胞存活率比25mmol/L葡萄糖组上升30.3%(P<0.05),50μmol/L NaHS组与5.5mmol/L葡萄糖组无明显差异(P>0.05)。与5.5mmol/L葡萄糖组相比,以25mmol/L葡萄糖处理72h后能使CSE蛋白的表达下降(P<0.05),而25mmol/L葡萄糖+50μmol/L NaHS 则能改善这种损害作用(P<0.05),CSE蛋白的表达比25mmol/L葡萄糖组增强。结论 高浓度葡萄糖降低人原代脐静脉内皮细胞的生长和存活率,减少CSE蛋白的表达,而NaHS能够减轻高浓度葡萄糖对CSE的作用。     

高糖诱导人肾小球系膜细胞SGK的表达

目的　研究高糖环境中人肾小球系膜细胞(human mesangial cells, HMC) 中血清和糖皮质激素诱导的激酶(serum and glucocorticoid inducible kinase, SGK) 3种亚型SGK1、SGK2和SGK3的表达及意义。方法　将培养的HMC分为正常组(5 5 mmol/L D 葡萄糖)、高糖组(25 mmol/L D -葡萄糖) 和甘露醇对照组(19. 5 mmol/L甘露醇和5. 5 mmol/L D 葡萄糖)。采用RT PCR 方法检测SGK1、SGK2 和SGK3 mRNA 的表达, Western blot 方法检测SGK1蛋白的表达。结果　在高糖及甘露醇刺激下, HMC中SGK1、SGK2和SGK3 mRNA及SGK1 蛋白的表达明显上调(P<0. 05); 其中高糖上调SGK的表达明显高于甘露醇(P<0 .05)。结论　高糖能促进HMC的SGK1、SGK2 和SGK3mRNA及SGK1蛋白的表达, SGK1可能是高糖作用于HMC的细胞内信号通路中靶分子之一, 由它介导的高糖信号转导途径在糖尿病肾病的发生中可能起了重要作用。     

波动性高糖对人脐静脉内皮细胞中NO 合成的影响及作用机制

目的：探索波动性与持续性高糖对人脐静脉内皮细胞合成血管舒张因子一氧化氮（NO）的影响及其作用机制。方法：以体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为研究对象,分别测定波动性高浓度葡萄糖(5.5 或20 mmol/L) 与持续性高浓度葡萄糖(20 mmol/L)环境下NO浓度,RT-PCR及Western印迹方法检测磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B（PKB/AKT）、内皮型一氧化氮合酶(eNOS）mRNA及蛋白表达水平。结果：波动性高糖组NO均明显低于持续高糖组和正常组（P<0.05）;波动组,持续高血糖组的PI3K,PKB,eNOS mRNA及蛋白表达水平均较正常组下调（P<0.01）,而波动组又低于持续组（P<0.05）。结论：波动性高血糖较持续性高血糖可能对血管内皮细胞具有更强的损伤效应,并可能通过影响信号通路PI3K/PKB/eNOS导致NO合成减少。     

高浓度葡萄糖对膀胱癌T24细胞增殖及β-catenin表达的影响

目的 探讨高浓度葡萄糖对膀胱癌T24细胞增殖的影响,并探讨其可能的作用机制.方法 用含10% FBS的DMEM培养液体外培养膀胱癌T24细胞,将细胞分为5组:空白组(5.5 mmol/L葡萄糖)、对照组(5.5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇)、高糖组(10、20、30 mmol/L葡萄糖).采用MTT法及克隆形成实验检测高浓度葡萄糖对膀胱癌T24细胞增殖的影响;通过实时定量PCR检测膀胱癌T24细胞β-catenin mRNA的表达水平;通过Western blot法检测高浓度葡萄糖对膀胱癌T24细胞β-catenin蛋白表达的影响.结果 MTT法及克隆形成实验结果显示,高浓度葡萄糖显著促进膀胱癌T24细胞的增殖(P<0.01);Western blot检测结果显示,高浓度葡萄糖促进T24细胞β-catenin蛋白的表达.实时定量PCR检测结果显示,高浓度葡萄糖促进T24细胞β-catenin mRNA的表达.结论 高浓度葡萄糖明显促进膀胱癌T24细胞的增殖,并促进T24细胞β-catenin蛋白和其mRNA的表达,该作用机制可能与β-catenin表达上调有关.     

脂联素对高糖环境下肾小球系膜细胞增殖及粘附分子1表达的影响

目的探讨脂联素（ADPN）对高糖环境下肾小球系膜细胞（MCs）增殖及细胞间粘附分子1（ICAM-1）表达的影响。方法将MCs分为三组：①正常组（5．5mmol／L葡萄糖）,②高糖组（25mmol／L葡萄糖）,③ADPN组（25mmol／L葡萄糖,2．5ug／mlADPN）运用MTT测定（24h,48h,96h）后MCs的增殖情况;再将MCs分为三组：①正常组（5．5mmol／L葡萄糖）,②高糖组（25mmol／L葡萄糖）,⑤ADPN组（25mmol／L葡萄糖2．5,5,7．5,10,15,20ug／mlADPN）,作用48小时后运用ELISA法测定各组MCs上清液中ICAM--1的含量。结果高糖组抑制细胞增殖,加A．ADPN后促进细胞增殖。ICAM--1在高糖组表达较高,加入低浓度ADPN对于ICAM--1表达影响不大,10--20mg／LADPN组和高糖组相比,ICAM--1的表达下降,差异有统计学差异（P〈O．05）,且呈剂量依赖性。姑论低浓度ADPN可以促进MCs增殖;中等以上浓度ADPN可以抑制ICAM--1在Mcs的表达。提示ADPN可能通过阻抑ICAM-1表达发挥对DN的保护作用。     

脂联素对高糖中hRPE细胞活性及T—cad表达的影响

目的观察脂联素对高糖环境下人视网膜色素上皮（hRPE）细胞活性及T-钙黏蛋白（T—cad）表达的影响,以阐明脂联素和T—cad对糖尿病视网膜病变（DR）的影响。方法①将hRPE细胞随机分为正常对照组（5．5mmo~L葡萄糖）、高糖组（33mmol／L葡萄糖）、脂联素组（33mmol/L＋2．5μg／m1脂联素）,运用MTT法测定不同情况下48h后对细胞活性的影响;②再将上述各组细胞分别培养24h、48h、72h后,运用荧光定量PCR测定T—cad的表达水平。结果①高糖组细胞活性降低,加入脂联素后细胞活力比高糖组升高;②随时间的延长,高糖组T—cad表达下降,脂联素组T—cad表达增加。结论脂联素可通过Tcad保护hRPE细胞的功能。     

解偶联蛋白2在高糖致大鼠胰岛β细胞功能障碍中的作用

目的:探讨高糖对体外培养的大鼠胰岛β细胞解偶联蛋白2(UCP-2)表达的影响及其可逆性。方法:体外分离Wistar大鼠胰岛细胞进行培养,根据培养液中葡萄糖浓度和培养时间分组:A组5.5mmol/L葡萄糖培养3d;B组11mmol/L葡萄糖培养3d;C组22mmol/L葡萄糖培养3d;D组5.5mmol/L葡萄糖培养6d;E组11mmol/L葡萄糖培养3d续5.5mmol/L葡萄糖培养3d;F组22mmol/L葡萄糖培养3d续5.5mmol/L葡萄糖培养3d。采用RT-PCR方法检测胰岛β细胞的UCP-2基因表达情况。结果:B组UCP-2基因表达水平较A组明显增高(P<0.05);C组UCP-2基因表达水平较A组降低,但二者之间无统计学差异。D组与A组比较UCP-2基因表达水平没有明显变化。与B组相比,E组UCP-2基因表达则显著减少(P<0.05);与C组相比,F组的UCP-2基因表达水平略升高,但无统计学差异。结论:在一定葡萄糖浓度和暴露时间范围内,葡萄糖可诱导大鼠胰岛细胞UCP-2基因表达增加,高糖对UCP-2基因表达的诱导可以逆转。     

高糖诱导人脐静脉内皮细胞fractalkine表达及其凋亡的研究

目的探讨高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVECs)fractalkine(FKN)表达与细胞凋亡的可能机制。方法对数生长期的HUVECs,分为正常组(N)、高糖组(HG)、氯化锂(lithium chloride,LiCl)组(LiCl)、高糖+LiCl组(HG+LiCl)。5.5 mmol/L的低糖DMEM培养的HUVECs种板10 h后按以上分组加入10 mmol/L的LiCl预处理2 h,再用33.3 mmol/L的高糖干预48 h后,用TUNEL法检测细胞凋亡,免疫组化SABC法检测β-catenin及p-GSK-3β(Ser9),免疫荧光FITC法检测FKN蛋白水平变化,RT-PCR检测GSK-3β和FKN mRNA水平变化。结果①与正常组比较,高糖诱导的HUVECs凋亡率明显增加(P<0.05)。与高糖组比较,LiCl可明显降低高糖环境下HUVECs的凋亡率(P<0.05),但仍高于正常组(P<0.05)。②与正常组比较,高糖组HUVECsβ-catenin及p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达降低(P<0.05);GSK-3βmRNA水平及FKN蛋白和mRNA水平升高(P<0.05)。③与高糖组比较,LiCl+高糖组HUVECsβ-catenin及p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达升高(P<0.05),GSK-3βmRNA水平(P<0.05)及FKN蛋白和mRNA(P<0.05)水平降低。结论高糖诱导的HUVECs凋亡可能与Wnt信号通路抑制和抑制FKN表达上调有关。     

高剂量葡萄糖对小鼠肌管细胞自噬表达的影响

目的：探讨高剂量葡萄糖对肌管细胞自噬表达的影响。方法：使用分化培养基诱导小鼠成肌细胞分化成肌管细胞,分正常剂量（5.5 mmol/L）和高剂量（17 mmol/L和30 mmol/L）葡萄糖浓度的3组培养基培养肌管细胞,于6、12、24、36、48、60、72 h后分别收集细胞,检测自噬相关蛋白和mRNA表达量,并用串联荧光标记LC3（mRFP-GFP-LC3）慢病毒转染小鼠成肌细胞,动态监测自噬流。结果：高剂量葡萄糖条件下肌管细胞自噬表达存在2个阶段,30 mmol/L组培养24 h自噬表达下降,LC3和Beclin-1蛋白表达水平比5.5 mmol/L组低（P＜0.05）;而在30 mmol/L葡萄糖条件下培养48、60和72 h后自噬水平增强,LC3和Beclin-1的基因表达均明显升高（P＜0.05）。肌管细胞GFP和RFP荧光斑点的定位与数量分析也证明30 mmol/L葡萄糖浓度的培养基培养48、60和72 h后可显著增加自噬体和自噬溶酶体的合成。结论：高剂量葡萄糖对肌管细胞自噬表达有重要影响,不同时间自噬表达存在差异,长期高血糖状态可诱导自噬过度活化。     

RNA干扰下调Gremlin表达对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞分泌FN、ColⅣ的影响

目的探讨在高糖培养条件下,应用慢病毒介导的RNA干扰下调Gremlin表达对大鼠肾小球系膜细胞(RMCs)分泌纤维连接蛋白(FN)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)的影响及机制。方法构建Gremlin基因特异性的短发夹双链RNA(shRNA)慢病毒GREM1-RNAi-LV,感染RMCs后,分为5.5 mmol/L葡萄糖组、30 mmol/L葡萄糖组、30 mmol/L葡萄糖+GREM1-RNAi-LV组及30 mmol/L葡萄糖+NC-GFP-LV(感染携带绿色荧光蛋白的阴性对照慢病毒)组,分别处理48 h,RT-PCR检测Gremlin mRNA表达,Western Blot检测Gremlin蛋白表达,ELISA法检测细胞上清FN、ColⅣ蛋白表达变化。结果与5.5 mmol/L葡萄糖组相比,30 mmol/L葡萄糖组Gremlin mRNA和蛋白水平显著升高(P均<0.05),细胞外基质分泌FN、ColⅣ蛋白增加(P均<0.05),而RNA干扰能下调高糖诱导的Gremlin mRNA与蛋白高表达(P<0.05),降低细胞外基质FN、ColⅣ蛋白分泌(P<0.05)。结论慢病毒介导的RNA干扰可明显抑制高糖诱导的Gremlin高表达,降低细胞外基质分泌,改善肾脏纤维化,可能是一个预防和治疗糖尿病肾病新型的潜在靶点。