UVB对人皮肤成纤维细胞自噬影响的初步研究

目的:观察不同照射剂量及不同时间点的UVB照射对人皮肤成纤维细胞自噬功能的影响.方法:分别用不同照射剂量的UVB照射培养的人皮肤成纤维细胞后,用MDC法观察各照射组成纤维细胞的形态及自噬体阳性细胞的数量.同时将照射后的成纤维细胞用MDC法观察各时间点自噬体阳性细胞数量.结果:0、100、200、300、400 mJ/cm2各组自噬体阳性细胞百分数分别为5.975±1.889,21.400±4.286,89.550±4.282,45.500±9.423,36.250±9.996.各组之间除300 mJ/cm2与400 mJ/cm2组之间无显著性差异(P＞0.05)外,其余均存在显著性差异(P<0.05).12、24和48 h自噬体阳性细胞百分比分别为89.550±4.282、50.500±7.328和14.575±4.104.各组之间均存在显著性差异(P＜0.01).结论:UVB在中小照射剂量时可以上调人皮肤成纤维细胞自噬,而进一步加大照射剂量则呈下降趋势.UVB对人皮肤成纤维细胞自噬的影响随时间推移逐渐弱化.     

西罗莫司对人皮肤成纤维细胞自噬水平的影响

目的研究西罗莫司对人皮肤成纤维细胞自噬水平的影响。方法取健康青少年男子环切术后包皮进行人皮肤成纤维细胞的分离培养,西罗莫司浓度分别为0、0．1、1．0、10．0mg／L处理24h,并设立空白对照。吖啶橙染色检测细胞白噬,Western印迹检测白噬相关蛋白LC3-B及beclinl的表达水平。数据采用SPSSl6．0软件分析,多组问均数行单因素方差分析进行比较。结果0、0．1、1．0、10．0mg／L西罗莫司组吖啶橙染色荧光定量呈浓度依赖性升高,各组问差异均有统计学意义（P〈0．01）;LC3-B及beclin 1的表达水平明显升高,各组问差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论西罗莫司可以提高人皮肤成纤维细胞的自噬水平。     

α硫辛酸对人皮肤成纤维细胞自噬的影响

目的：评价α硫辛酸对人皮肤成纤维细胞自噬水平的影响。方法人皮肤成纤维细胞与终浓度分别为0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L 的α硫辛酸孵育4、12和24 h 后,采用噻唑蓝法检测细胞增殖活性,单丹酰戊二胺（MDC）染色法检测细胞自噬水平,Western 印迹法检测微管相关蛋白1轻链3-B（LC3-B）表达。结果孵育4 h 和12 h 时,0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间人皮肤成纤维细胞增殖活性（A490值）差异均无统计学意义（F 值分别为2.85、1.34,均 P >0.05）;孵育24 h 时,各组间差异有统计学意义（F =10.41,P <0.01）。MDC 法检测显示,孵育4 h 和12 h 时,0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间自噬体阳性细胞百分率差异均无统计学意义（F 值分别为0.11、0.10,均 P >0.05）;孵育24 h 时,各组间差异有统计学意义（F =8.03,P <0.05）。Western 印迹法检测显示,孵育4 h 和12 h 时,0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间细胞 LC3-Ⅰ向 LC3-Ⅱ转化（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）水平差异均无统计学意义（F 值分别为3.38、2.13,均 P >0.05）,但孵育24 h 时各组间差异有统计学意义（F =37.49,P <0.01）。结论α硫辛酸可能抑制人皮肤成纤维细胞基础自噬。     

circIGF2BP3调控光老化皮肤成纤维细胞自噬水平的研究

【摘要】 目的 初步探究circIGF2BP3对光老化皮肤成纤维细胞自噬水平的影响。方法 取中山大学附属第三医院泌尿外科6例儿童包皮环切术后包皮组织,分离培养成纤维细胞,以每日10 J/cm2长波紫外线（UVA）连续照射14 d,建立UVA诱导的光老化成纤维细胞模型（UVA处理组）,未经处理的正常成纤维细胞作为对照组,β半乳糖苷酶染色、Western印迹法检测P21蛋白表达,CCK8法检测细胞活力验证建模是否成功。Western印迹法检测光老化成纤维细胞中自噬相关蛋白P62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表达,qRT-PCR验证光老化与正常成纤维细胞间circIGF2BP3表达差异,并对其进行生物学注释。将原代成纤维细胞分为4组：空载组、UVA + 空载组,circIGF2BP3过表达组、UVA + circIGF2BP3过表达组,Western印迹法检测各组细胞中自噬相关蛋白表达水平。两独立样本均数的比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 UVA处理组β半乳糖苷酶染色阳性率（61.33% ± 5.78%）、P21蛋白表达（1.25 ± 0.03）均显著高于对照组（6.37% ± 0.32%、1.00 ± 0.05,t = 9.49、4.26,P < 0.01、< 0.05）,而细胞活力（74.33% ± 3.48%）显著低于对照组（100%,t = 7.38,P < 0.01）。UVA处理组P62蛋白表达及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值均显著高于对照组（均P < 0.05）。光老化成纤维细胞中circIGF2BP3的相对表达量为0.72 ± 0.04,显著低于对照组（1.00 ± 0.03）,t = 5.46,P < 0.01。circIGF2BP3过表达组P62蛋白表达（0.60 ± 0.01）及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值（0.71 ± 0.01）均显著低于空载组（1.00 ± 0.02、1.00 ± 0.01;t = 16.25、2.75,P < 0.01、P < 0.05）;UVA + circIGF2BP3过表达组P62蛋白表达（1.05 ± 0.02）及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值（2.04 ± 0.05）亦均显著低于UVA + 空载组（1.31 ± 0.02、2.72 ± 0.14;t = 10.49、6.47,均P < 0.01）。结论 circIGF2BP3可调控UVA诱导的光老化皮肤成纤维细胞自噬水平,为防治光老化提供了新的潜在治疗靶点。     

中波紫外线诱导人皮肤成纤维细胞自噬对凋亡影响的初步研究

[目的]探讨不同剂量中波紫外线(UVB)照射人皮肤成纤维细胞诱导的自噬对细胞凋亡活性的影响.[方法]人皮肤成纤维细胞来自于23岁健康男性环切术后包皮的原代培养,连续传代培养后取第3～ 10代的细胞进行实验.通过单丹酰戊二胺(MDC)染色和免疫荧光标记微管相关蛋白1轻链3(LC3)的方法,确定不同剂量3-甲基腺嘌呤(3-MA)对自噬的抑制作用.UVB照射后立即加入0.5 mmol/L 3-MA孵育细胞4h作为自噬的抑制方法.Hoechst和碘化丙啶(PI)染色结合Annexin V-异硫氰酸荧光索(FITC)和PI标记细胞后流式细胞仪检测作为细胞凋亡的定性和定量方法.[结果]0.5 mmol/L 3-MA能明显抑制人皮肤成纤维细胞自噬活性(饥饿诱导组自噬细胞阳性百分数为63.037％±5.876％,3-MA孵育后下降至34.425％±5.183％).空白对照组、30、50、100mJ/cm2UVB照射组标记LC3绿色荧光信号逐渐增强,照射后立即对上述4组加入3-MA孵育4h则LC3蛋白表达差异不明显.0.5 mmol/L 3-MA对细胞活性影响最小.50 mJ/cm2 UVB照射下加入3-MA孵育较未加3-MA孵育细胞强Hoechst和强PI双染细胞增多;100 mJ/cm2 UVB照射后加3-MA孵育较未加3-MA孵育细胞强Hoechst和强PI双染细胞减少.Annexin V -FITC和PI标记细胞后流式细胞仪分析显示,在50 mJ/cm2 UVB照射下,抑制自噬的细胞中晚期凋亡水平[( 10.933±0.839)％]较未抑制细胞[(7.267±0.473)％]上升,两者之间差异具有统计学意义(t=5.20,P＜ 0.05);而在100mJ/cm2UVB照射下,抑制自噬的细胞中晚期凋亡水平[(7.100±0.781)％]较未抑制细胞[( 10.133±0.681)％]下降,两者之间差异具有统计学意义(t=6.29,P＜ 0.05).[结论]50 mJ/cm2 UVB照射诱导人皮肤成纤维细胞自噬通过抑制凋亡对细胞起到保护作用,而在100 mJ/cm2 UVB照射下发生的较高水平自噬可能诱导了自噬性细胞死亡.     

过表达p53基因和中波紫外线照射对人皮肤成纤维细胞衰老的影响

目的建立稳定过表达野生型p53基因(wtp53)的人皮肤成纤维细胞系,探讨过表达p53基因及中波紫外线(UVB)照射对人皮肤成纤维细胞(HSF)衰老的影响。方法在脂质体lipofectamine TM 2000介导下,将含有wtp53的真核表达质粒pCMV-p53导入HSF中,经G418筛选抗性克隆,扩大培养,建立转染克隆细胞系。用RT-PCR,实时荧光定量PCR和蛋白印迹法分析目的基因及其蛋白表达。亚毒性剂量UVB照射细胞,以染色法检测SAβ-gal活性,MTT法检测细胞增殖能力。结果成功构建过表达p53的HSF细胞系,转染细胞中存在p53基因及蛋白的稳定过表达。过表达p53的细胞株不论UVB照射与否SAβ-gal活性均未见增高,过表达p53可使HSF的增殖能力减弱,但对UVB诱导的细胞生长停滞的影响并不显著。结论过表达p53不能促进HSF的复制衰老和UVB诱导的早期衰老,过表达p53引起的HSF增殖减弱可能与细胞凋亡有关而非衰老。     

中波紫外线诱导的提前衰老成纤维细胞上清液对人真皮成纤维细胞增殖、老化及自噬的影响

目的 观察中波紫外线诱导的提前衰老的成纤维细胞条件培养液对人真皮成纤维细胞增殖、老化及自噬的影响.方法 取健康青少年男子环切术后包皮进行人真皮成纤维细胞的分离培养.将中波紫外线诱导的提前衰老的成纤维细胞条件培养液培养成纤维细胞设为实验组,并设立对照组即正常成纤维细胞条件培养液培养成纤维细胞.处理20 d后,用CCK8法检测细胞增殖活性,EDU(5-乙炔基-2,脱氧尿嘧啶核苷)法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,β半乳糖苷酶染色计算衰老细胞百分比,吖啶橙染色检测细胞自噬,Western印迹法及间接免疫荧光检测自噬相关蛋白LC3-B的表达水平.数据采用Graphpad Prism 5软件分析,两组间比较采用成组t检验.结果 实验组成纤维细胞增殖活力(0.831±0.017)明显低于对照组(0.973±0.017),但EDU染色及流式细胞仪检测结果均显示,实验组S期细胞百分比明显高于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).β半乳糖苷酶染色显示,实验组成纤维细胞阳性率(25.710％±0.304％)高于对照组(5.257％±1.023％),差异有统计学意义(t=19.170,P＜0.05).吖啶橙染色结果显示,实验组成纤维细胞红色荧光量(14.287±2.269)低于对照组(29.614±2.650).Western印迹及间接免疫荧光结果均显示,实验组成纤维细胞LC3-B表达量明显高于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 中波紫外线诱导的提前衰老成纤维细胞的条件培养液可降低成纤维细胞的自噬及增殖,并加速其老化.     

尿紧张素Ⅱ诱导人皮肤成纤维细胞增殖和α平滑肌肌动蛋白表达的机制研究北大核心CSCD

目的 探讨尿紧张素Ⅱ（UⅡ）对体外培养人正常皮肤成纤维细胞（NF）增殖和α平滑肌肌动蛋白（α？SMA）表达的生物学功能影响及调控机制。方法 原代培养NF,采用反转录PCR和Western印迹法分别检测UⅡ及其受体mRNA和蛋白表达水平。采用CCK8法观察不同浓度（10？10、10？9、10？8、10？7、10？6 mol/L）UⅡ作用0、6、12、24、48 h对NF增殖的影响,筛选出UⅡ最佳作用浓度为10？8 mol/L,刺激时间为24 h。将NF分为5组：对照组（不含UII）、UⅡ组、UⅡ ＋ 尼卡地平（钙通道阻断剂,10？5 mol/L）组、UⅡ ＋ PD98059［丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）抑制剂,10？5 mol/L］组和UⅡ ＋ 环孢素［钙蛋白激酶（CaM PK）阻断剂,10？5 mol/L］组,UⅡ浓度均为10？8 mol/L,刺激NF 24 h后,采用CCK8法检测各组NF的增殖活性,以实时定量荧光PCR和Western印迹法分别检测各组α？SMA mRNA与蛋白的相对表达水平。结果 NF表达UⅡ受体,不表达UⅡ。对照组、UⅡ组、UⅡ＋ 尼卡地平组、UⅡ＋ PD98059组和UⅡ＋ 环孢素组NF细胞增殖活性（A450值）分别为1.036 ± 0.046、1.405 ± 0.158、1.121 ± 0.109 、1.192 ± 0.089和1.141 ± 0.056,组间差异有统计学意义（F = 9.587,P 〈 0.01）,UⅡ组高于对照组、UⅡ＋ 尼卡地平组、UⅡ＋ PD98059组、UⅡ＋ 环孢素组（q值分别为8.263、6.355、4.774、5.912,均P 〈 0.05）。5组间NF细胞α？SMA mRNA与蛋白的相对表达量差异亦均有统计学意义（F值分别为6.351、7.045,均P 〈 0.01）,且UⅡ组α？SMA mRNA及蛋白表达量均高于另4组（均P 〈 0.05）。结论 UⅡ可能通过钙通道、MAPK和CaM PK通路诱导NF增殖和α？SMA的表达。     

紫外线及全反式维A酸对人皮肤及成纤维细胞中Hrd1表达的影响

目的 探讨紫外线照射及全反式维A酸（ATRA）对人皮肤及成纤维细胞中Hrd1表达的影响及机制。方法 2017年12月至2018年6月于南京医科大学附属第一医院皮肤科收集12份人皮肤组织标本,30 ~ 40岁、60 ~ 70岁曝光及非曝光部位标本各3份,免疫组化检测各组Hrd1表达。将40只BALB/c小鼠分为对照组、紫外线组、ATRA组及紫外线 + ATRA组,其中紫外线组、紫外线 + ATRA组每日照射UVA 10 J/cm2和UVB 30 mJ/cm2,紫外线 + ATRA组（照光前给药）、ATRA组小鼠背部剃毛区域每日均匀涂抹1次0.1 ml 0.1% ATRA药膏,对照组既不涂药也不照射紫外线。14周后处死小鼠并取背部皮肤免疫组化观察Hrd1的表达。体外培养的人皮肤成纤维细胞分为对照组、紫外线组、ATRA组及紫外线 + ATRA组,紫外线组和ATRA + 紫外线组照光前用磷酸盐缓冲液覆盖细胞上层,照射10 J/cm2 UVA或30 mJ/cm2 UVB,ATRA + 紫外线组（照光后给药）和ATRA组用含ATRA 1 μmol/L的培养基继续培养24 h。Western印迹法检测各组成纤维细胞Hrd1表达,荧光显微镜观察各组细胞内活性氧水平。组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,P < 0.05认为差异有统计学意义。结果 30 ~ 40岁、60 ~ 70组曝光部位皮肤组织中Hrd1表达水平分别为0.307 ± 0.256、0.486 ± 0.579,均明显高于避光部位（0.196 ± 0.330、0.199 ± 0.375）,t值分别为5.486、10.579,P < 0.05。BALB/c小鼠体内实验中,对照组、紫外线组、ATRA组及紫外线 + ATRA组小鼠皮肤中Hrd1表达水平分别为0.189 ± 0.015、0.288 ± 0.017、0.187 ± 0.020、0.226 ± 0.021,差异有统计学意义（F = 19.553,P < 0.001）,紫外线组高于对照组（t = 5.337,P = 0.033）和ATRA + 紫外线组（t = 4.891,P = 0.039）。体外实验中,人皮肤成纤维细胞分别经UVA、UVB照射后,4组细胞Hrd1水平差异均有统计学意义（F值分别为120.704、102.119,均P < 0.001）,UVA或UVB照射对Hrd1表达水平的影响基本一致,紫外线组Hrd1水平均明显高于对照组和ATRA + 紫外线组（均P < 0.05）。紫外线照射后,紫外线组活性氧水平均明显高于对照组和ATRA + 紫外线组（均P < 0.05）。结论 ATRA可以抑制紫外线介导的皮肤成纤维细胞中Hrd1的表达,其机制可能与ATRA抑制细胞内活性氧生成有关。     

沉默单核细胞趋化蛋白3对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖、迁移及凋亡的影响北大核心CSCD

目的:探讨沉默单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖、迁移及凋亡等功能的影响。方法:取增生性瘢痕组织和正常皮肤组织,qRT-PCR检测正常皮肤组织和增生性瘢痕组织中MCP-3 mRNA表达水平;分离培养增生性瘢痕组织成纤维细胞(HSF)和正常皮肤组织成纤维细胞(NSF),qRT-PCR和Western blot检测两种成纤维细胞中MCP-3 mRNA和蛋白表达水平。采用MCP-3干扰慢病毒(shRNA-MCP-3)和其阴性对照病毒(shRNA-NC)感染HSF,MTT检测各组细胞增殖活性,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,Transwell实验检测细胞的迁移能力,qRT-PCR检测各组细胞中MCP-3、collagenⅠ和collagenⅢmRNA水平,Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白MCP-3、Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3及collagenⅠ和collagenⅢ蛋白表达水平。结果:MCP-3在增生性瘢痕组织及HSF中高表达。与blank组和shRNA-NC组比较,shRNA-MCP-3组细胞中MCP-3 mRNA和蛋白表达水平显著下降(P<0.01),细胞增殖活性、迁移能力及细胞中collagenⅠ、collagenⅢ和Bcl-2表达水平均显著降低(P<0.01),同时细胞凋亡率及凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase-3表达水平显著上升(P<0.01)。结论:干扰MCP-3表达可能通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,减少细胞合成胶原,从而发挥抑制瘢痕形成与发展的作用。     

miRNA-29c-3p对体外慢性光损伤皮肤成纤维细胞COL1A1和COL3A1基因表达及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白合成的影响北大核心CSCD

目的 研究miRNA？29（miR？29）家族对人慢性光损伤（光老化）皮肤Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的影响。方法 将人皮肤成纤维细胞分为未照射组和慢性光损伤组,后者给予长波紫外线（UVA）连续照射以构建慢性光损伤细胞模型,并用流式细胞仪及β半乳糖苷酶染色法验证模型。Western印迹检测两组Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达,实时荧光定量PCR（qRT？PCR）检测miR？29家族3个成员（miR？29a？3p、miR？29b？3p和miR？29c？3p）在两组细胞中的表达,选择表达具有显著差异的miR？29c？3p进行功能试验。将人皮肤成纤维细胞分为4组,分别采用荧光标记的miRNA？29c？3p模拟物（过表达组）、抑制物（抑制组）及二者各自的对照RNA寡核苷酸（阴性对照组和抑制对照组）转染各组细胞,观察各组荧光细胞比例,qRT？PCR法检测各组miR？29c？3p的相对表达量,判定干扰效率。采用qRT？PCR法检测转染后4组COL1A1和COL3A1 mRNA水平,Western印迹法检测转染后Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白表达水平。结果 与未照射组相比,慢性光损伤组衰老染色细胞阳性率显著升高（36.47% ± 3.20%比12.56% ± 1.46%,P 〈 0.01）,G1期细胞比例明显升高,S期细胞比例明显降低（均P 〈 0.01）,慢性光损伤模型成功建立。慢性光损伤组Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白表达（0.40 ± 0.19和0.52 ± 0.10）明显低于未照射组（1.00 ± 0.12和1.00 ± 0.10,均P 〈 0.01）,而miR？29c？3p（4.42 ± 2.05）明显高于未照射组（0.89 ± 0.10,P 〈 0.05）,两组间miR？29a？3p和miR？29b？3p表达水平差异无统计学意义（均P 〉 0.05）。转染后24 h,过表达组和抑制组的转染效率均大于90%,达到干预要求。过表达组miR？29c？3p的表达（224.17 ± 2.00）明显高于阴性对照组（2.45 ± 0.34）,而抑制组（0.20 ± 0.08）明显低于抑制对照组（2.24 ± 0.14）,干扰模型构建成功。评价转染效率显示,过表达组COL1A1和COL3A1 mRNA和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达水平均明显低于阴性对照组和抑制组（均P 〈 0.05）,而抑制组明显高于抑制对照组（均P 〈 0.01）。结论 miR？29c？3p在慢性光损伤皮肤成纤维细胞中表达上调,可能通过调控COL1A1、COL3A1的表达影响Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白合成。