刚地弓形虫DNA疫苗的研究进展

疫苗是防治弓形虫病的有效手段之一。弓形虫疫苗研制经历了全虫疫苗、虫体特异组分疫苗、基因工程疫苗、DNA疫苗等4个发展阶段。弓形虫DNA疫苗较传统疫苗虽有诸多优势,但尚处于研究起步阶段,单价DNA疫苗和佐剂增强型DNA疫苗可诱导机体对弓形虫感染产生细胞免疫和体液免疫,但免疫效果并不理想,复合多重DNA疫苗将是弓形虫疫苗今后的发展趋势。此外,弓形虫DNA疫苗的免疫保护机制和安全性还不十分清楚,进一步探讨疫苗免疫机制和弓形虫免疫逃避机制,将有助于研制高效、安全、实用的弓形虫DNA疫苗。     

刚地弓形虫529 bp重复序列环介导等温扩增检测方法的建立

目的建立高效检测刚地弓形虫(Toxoplama gondii)的环介导等温扩增(LAMP)方法,为弓形虫病诊断提供新的技术手段。方法采用在线引物设计软件Primer Explorer 4.0设计弓形虫529 bp基因LAMP扩增引物,用已构建的pMD-19T-529 bp重组质粒为模板,建立LAMP扩增反应,通过添加环引物、设置不同浓度的甜菜碱和Mg SO_4以及不同反应温度对扩增反应体系和反应条件进行优化。以猪、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、猪等孢球虫(Isospora suis)的基因组DNA和超纯水为对照,pMD-19T-529 bp重组质粒为模板,分别进行优化后的LAMP和PCR扩增,评价LAMP方法的特异性。将pMD-19T-529 bp重组质粒梯度稀释为109~100copies/ml,分别进行优化后的LAMP和PCR扩增,评价LAMP方法的灵敏性。结果设计的LAMP扩增引物可扩增出弓形虫529 bp序列保守区域的目的片段。优化结果显示,最佳反应总体系为25μl,其中,甜菜碱最佳浓度为0.4 mol/L,Mg SO_4最佳浓度为6 mmol/L;添加环引物反应30 min的扩增效率与未添加环引物反应60 min的扩增效率相当,可使反应时间缩短30 min;最佳反应条件为63℃30 min,80℃3 min。特异性检测结果显示,所建立的LAMP方法可特异扩增弓形虫529 bp基因片段,对照均未扩增出目的片段。灵敏性检测结果显示,LAMP方法的最低检出值达10~3 copies/ml,效率为PCR扩增(10~4 copies/ml)的10倍。结论建立了弓形虫529 bp重复序列的LAMP检测方法,该法具有较好的特异性和灵敏性。     

刚地弓形虫感染致小鼠生殖细胞DNA损伤的作用

目的 探讨刚地弓形虫感染对小鼠睾丸细胞DNA的损伤作用.方法 选用9～10周龄雄性BALB/c小鼠20只,随机分为4组,每组5只,分为正常对照组(CG)和3个染虫组(G1,G2,G3).采用腹腔注射法建立小鼠刚地弓形虫感染的动物模型,CG组每只注射PBS 0.2 ml;染虫G1,G2,G3组注射纯化的刚地弓形虫速殖子悬液,每只注射刚地弓形虫速殖子的量依次为2.5×10 3、5×10 3、1×10 4,注射体积均为0.2 ml,应用单细胞凝胶电泳检测睾丸细胞DNA的损伤. 结果 正常对照组和染虫组的尾距分别为10.94±7.57、40.37±6.25、69.76±3.97、79.16±6.36,olive尾距分别为10.57±6.72、31.39±4.59、48.66±4.60、53.87±6.55,G1-G3组与CG组比较,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论 弓形虫感染可导致小鼠睾丸生殖细胞DNA不同程度的损伤.     

刚地弓形虫LDH-Like MDH cDNA的克隆和序列分析

目的获取弓形虫RH株速殖子苹果酸脱氢酶(MDH)的cDNA全长序列，并对推导翻译出的氨基酸(aa)序列进行分析。方法将NCBI GenBank中登录的弓形虫MDH EST序列进行比对、拼接和电子延伸，发现近5’末端的部分核酸序列缺失。基于分析，设计的上游、下游引物分别包含起始密码子ATG和终止密码子TGA(TGA→UGA)，使经RT-PCR扩增出的片段对应完整的CDS或者ORF。之后对MDHCDS推导翻译出的aa序列进行了保守功能域和同源性分析。结果本研究克隆的MDH的cDNA全长951bp，推导翻译出的蛋白质有316个aa组成，约35kDa，与预期大小接近。保守功能域分析表明，弓形虫MDH最接近类-乳酸脱氢酶型(lactate dehydrogenase-like)MDH，其准确定名缩写为LDH-like MDH，同时弓形虫MDH还具有其它脱氢酶类的特征。弓形虫MDH除与隐孢子虫和恶性疟原虫高度同源外，还与很多细菌等物种同源，但与人的同源性最低(22％)。弓形虫MDH cDNA序列在NGBI GenBank中登录号为AY650028，对应aa序列的登录号为AAT67462。结论本研究首次获得了弓形虫MDH基因的全长cDNA序列和对应的aa序列。MDH是三羧酸循环中的重要酶类，该酶活性的改变。将直接影响弓形虫的存活。弓形虫MDHaa序列与人MDH蛋白间的同源性很低，提示基于MDH蛋白作为药靶，经高通量技术筛选抗弓形虫药具有可行性。     

在宫颈涂片上的刚地弓形虫

本文报告一例在Papanicolao氏染色的宫颈涂片上发现刚地弓形虫的女性病例。患者2(?)岁,在激光治疗后,为了做人乳头状瘤病毒(HPV)感染常规检查,到妇科门诊就医。患者有突眼性甲状腺肿及非活动性全身性红斑狼疮史,用了强的松(2.0mg/d)。在宫颈常规涂片上查到形态学上与弓形虫酷似的虫体,并经电镜证实为弓形虫。患者无弓形虫病的症状,无食生肉或未煮熟肉、养猫、接受输血及器官移植史。但几年前,曾作过流产手术。于宫颈查见弓形虫后两个月,染料试验测得的血清抗体滴度为1:4,与患者     

欧洲的刚地弓形虫研究

西方介绍了欧洲刚地弓形虫的研究计划，流行病学、免疫学、分子生物学研究的现状。     

刚地弓形虫感染致小鼠睾丸细胞DNA的损伤作用

目的探讨刚地弓形虫感染对小鼠睾丸细胞DNA的损伤作用。方法选用9～10周龄雄性BALB/c小鼠20只,随机分为对照组(CG)和3个染虫组(G1、G2和G3)。采用腹腔注射法建立小鼠刚地弓形虫感染的动物模型,CG组注射PBS 0.2 ml/只,染虫G1、G2和G3组各注射纯化刚地弓形虫速殖子悬液0.2 ml,剂量分别为2.5×10~3个、5×10~3个和1×10~4个。应用单细胞凝胶电泳(彗星实验)检测睾丸细胞DNA的损伤。结果对照组和3个染虫组的彗星实验尾矩分别为10.94±7.57、40.37±6.25、69.76±3.97和79.16±6.36;Olive尾矩分别为10.57±6.72、31.39±4.59、48.66±4.60和53.87±6.55,对照组和实验组彗星尾矩和Olive尾矩差异有统计学意义(P<0.01)。结论弓形虫感染可致小鼠睾丸细胞DNA不同程度的损伤。对小鼠有生殖遗传毒性。     

血吸虫DNA重复序列的研究进展

DNA重复序列在真核生物基因组中占有很大的比例 ,是真核生物基因组的重要特征和重要组成部分。根据它们在基因组中的分布 ,DNA重复序列主要被分为两类 :1成簇排列的重复序列 ,即串联重复序列 ,也称卫星 DNA,主要分 3类 ;第 1类 :微卫星 DNA序列 ,在基因组的间隔顺序和内含子等非编码区广泛存在 ,由 2 - 5 bp作核心单位 ,在多串联拷贝上重复而成。它存在于染色体任何部位 ,重复次数达 10- 60次 ,总序列长度从几十到几百 bp,一般不超过 3 0 0 bp;第 2类 :小卫星 DNA序列 ,由较长的重复片段 (约 15 bp)排列而成 ,序列大小高度可变 ,介于 …     

刚地弓形虫在终末宿主阶段的研究进展

弓形虫病在我国人群及动物间广泛流行,感染率逐年上升,危害严重。其原因之一是我国饲养猫及流浪猫的数量不断增加。猫在弓形虫病的传播流行过程中承担重要的角色,它是弓形虫最为常见的终末宿主,在其体内进行有性生殖,产生大量卵囊;饲养猫、接触猫以及接触卵囊感染的水、土壤和食物是人类及动物感染弓形虫病的重要危险因素。但目前缺少有效的治疗药物及预防措施,为探寻有效降低或阻断弓形虫病在我国广泛流行的预防措施,本文分析了弓形虫病在我国猫体内的流行状况及特点,对弓形虫在终末宿主内的发育及卵囊、裂殖子的研究进展进行综述。     

刚地弓形虫RH株GRA6分子基因克隆与序列分析

目的　克隆刚地弓形虫 RH株致密颗粒抗原 (Dense granule antigen,GRA6 )分子基因 ,为研究使用重组的GRA6分子作为抗原进行弓形虫病诊断奠定基础。　方法　根据己知的 GRA6序列合成一对引物 ,抽提弓形虫速殖子m RNA,以速殖子 m RNA为模板 ,通过反转录 PCR(RT- PCR)扩增出 GRA6的 c DNA条带。目的基因 DNA条带被克隆到质粒 p UC19中形成重组质粒。对重组质粒 DNA进行纯化 ,并对目的基因片段进行核苷酸序列分析。　结果　通过RT- PCR从 m RNA中扩增出一条分子量约 70 0 bp的 DNA条带。核苷酸序列分析表明 ,GRA6分子基因的开放的阅读框全长为 6 93bp,编码 2 30个氨基酸分子 ,与已报道的 RH株 GRA6分子具有 10 0 %的同源性。　结论　本研究获得了刚地弓形虫 RH株的 GRA6分子基因 ,为今后应用此分子作为抗原诊断弓形虫病奠定了基础     

刚地弓形虫RH株GRA6分子基因克隆与序列分析

目的 克隆刚地弓形虫RH株致密颗粒抗原（Dense granule antigen,GRA6)分子基因，为研究使用重组的GRA6分子作为抗原进行弓形虫病诊断奠定基础。方法 根据已知的GRA6序列合成一对引物，抽提弓形虫速殖子mRNA，以速殖子mRNA为模板，通过反转录PCR（RT-PCR）扩增出GRA6的cDNA条带，目的基因DNA条带被克隆到质粒pUC19中形成重组质粒，对重组质粒DNA进行纯化，并对目的基因片段进行核苷酸序列分析，结果 通过RT-PCR从mRNA中扩增出一条分子量约700bp的DNA条带，核苷酸序列分析表明，GRA6分子基因的开放的阅读框全长为693bp，编码230个氨基酸分子，与已报道的RH株GRA6分子具有100%的同源性。结论 本研究获得了刚地弓形虫RH株的GRA6分子基因，为今后应用此分子作为抗原诊断弓形虫病奠定了基础。     

刚地弓形虫分子诊断的研究进展

刚地弓形虫感染是一种在世界范围内流行的寄生虫病,严重危害人体健康,给全世界的畜牧业带来巨大的经济损失.传统的弓形虫病原学诊断方法较为费时且不稳定,以核酸扩增为基础的分子生物学技术省时省力,为弓形虫病的诊断提供了重要依据.     

刚地弓形虫toxofilin蛋白的研究进展

Toxofilin是刚地弓形虫棒状体蛋白家族成员,但该蛋白有一定的特殊性,其结构中不存在棒状体蛋白典型丝氨酸、苏氨酸激酶区。Toxofilin分泌到宿主细胞质中,能与磷酸脂酶2C(PP2C)、肌动蛋白(actin)相互作用,形成toxofilin-actin-PP2C三聚体复合物,被酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)和PP2C激活发生磷酸化,在弓形虫入侵细胞过程中发挥重要作用。本文综述了弓形虫toxofilin的发现及其功能和免疫保护性等方面的研究进展。     

刚地弓形虫菱形体蛋白的研究进展

菱形体蛋白（rhomboid）为一类跨膜丝氨酸蛋白酶，在胞膜的脂质双分子层内发挥酶解作用。刚地弓形虫的菱形体蛋白可识别微线体蛋白的跨膜区，并对其进行蛋白水解，使微线体蛋白的N端片段释放人介质中。微线体蛋白的蛋白水解过程对于刚地弓形虫入侵宿主细胞非常重要。深入研究刚地弓形虫菱形体蛋白，将有助于理解生物体菱形体蛋白的功能及研制新的药物以防治弓形虫感染。     

刚地弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列SRS47D的生物信息学分析

目的预测刚地弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列(Toxoplasma gondii surface antigen glycoprotein 1-related sequences)SRS47D的结构、修饰位点和免疫原性。方法利用在线软件ProtParam、ProtScale、SignalP分别预测SRS47D的理化参数、亲/疏水性、信号肽;利用SOPMA、ESPriit 3.0、Bcepred预测SRS47D蛋白的二级结构及表面可极性,利用COLIS、TMHMM预测其卷曲螺旋和跨膜结构域;利用KinasePhos、NetOGlyc、NetNGlyc、NetCGlyc、和NetPhos分析其修饰位点;利用SWISS-MODEL、VAST预测其三级结构及其与SAG1三级结构的差异,利用ABCpred和Syfpeithi预测其B、T细胞表位。结果 SRS47D蛋白含有376个氨基酸残基,分子式为C_(1745)H_(2797)N_(469)O_(587)S_(17),相对分子质量约为40×10~3,理论等电点为4.96;疏水值为71.60,总平均亲水性为-0.405。在SRS47D蛋白的二级结构中,α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为23.14%、19.68%、2.39%和54.79%。SRS47D蛋白具有信号肽序列,无跨膜结构区,具有18个亲水区域(临界值为1.9)、8个柔性区域(临界值为2)和17个表面可及性区域(临界值为1.9)。SRS47D蛋白翻译后修饰位点中包含两个糖原合成酶激酶位点和两个O-GlcNAc糖基化位点,无N-GlcNAc和C-GlcNAc糖基化位点。与弓形虫表面抗原糖蛋白1(SAG1)蛋白三级结构比对,SRS47D在β折叠处存在重叠。ABCpred和Syfpeith预测SRS47D蛋白有24个限制性CTL细胞表位、13个限制性Th细胞表位和10个B细胞抗原表位。结论 SRS47D蛋白含丰富的B、T细胞表位,免疫原性好,可能成为弓形虫病疫苗候选分子。     

微卫星位点在刚地弓形虫分类中的应用

微卫星 (microsatellite)是控制核形成的基因片段 ,由短的DNA重复序列 (一般长为1 - 6个碱基 )组成 ,具有高度的多态性 ,贯穿整个基因组 ;其变异是由DNA复制时聚合酶的滑动产生的。M6 ,M 33,M4 8,M 1 0 2 ,M1 6 3等 5个微卫星和 1个小卫星 (minisat ellite)—M 95均是在刚地弓形虫基因组中新发现的 6个突变位点。已建立了RH88虫株的基因组DNA文库 ,确定了这些位点间的关系 :6个位点都具有多态性 (等位基因多于1个就认为有多态性 ) ,其中的 4个位点具有单态性 (monomorphic)。通过对这些位点的测序 ,发现了这些变异的分子基础 ,M33,M…     

应用rRNA基因克隆探针比较刚地弓形虫和H.hammordi的DNA

本文报告了应用重组DNA技术,在噬菌体入gt11建立了刚地弓形虫RH株的绿豆核酸酶基因库,从中克隆了大、小rRNA亚单位基因片段,用以鉴别3株刚地弓形虫和相近的球虫Hammondia hammondi种株。     

刚地弓形虫的嘧啶补救途径

作者以~(14)C或~3H-嘧啶碱基、核苷、核苷酸与刚地弓形虫RH株无细胞抽提液以及其它组分形成反应体系,保温后用薄层层析与同位素液闪法观察嘧啶补救途径中有关酶的活性。     

刚地弓形虫微孔的内噬作用

近年来,已开始对刚地弓形虫特别是速殖子和缓殖子中微孔结构和功能作研究,以发现虫体易受攻击的部位,作为改进该病疗法的目标。作者在研究中观察到弓形虫微孔基部有时覆盖一层海绵状的被膜,提示其内噬作用为受体所介导。本文对此进行超微结构的探讨。