碱性成纤维细胞生长因子基因转染兔骨髓间充质干细胞*☆

背景：碱性成纤维细胞生长因子对于创伤修复具有明显的促进作用,但局部应用难以持久地发挥作用。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞后的表达情况。 设计、时间及地点：细胞基因学体外观察,于2009-03/08在云南大学生命科学院完成。 材料：日本大耳白兔1只,购于昆明医学院动物科。pCDNA3.1质粒为美国Invitrogen产品。 方法：抽取兔髂前上棘骨髓,采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,待细胞融合至培养瓶底80%时消化传代。参考GeneBank碱性成纤维细胞生长因子cDNA序列设计合成基因,电泳纯化后xholⅠ、BamHⅠ双酶切回收凝胶,以限制性核酸内切酶对PcDNA Vector质粒进行酶切、电泳和凝胶回收,连接碱性成纤维细胞生长因子DNA与PcDNA Vector质粒,构建pCDNA-碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体,运用脂质体转染法将重组体转染至兔骨髓间充质干细胞中,并筛选稳定转染株。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞表面抗原的表达,Western blot法检测目的蛋白的表达。 结果：流式细胞仪检测结果示所培养细胞表面抗原呈CD90,CD44阳性,CD45呈阴性;免疫组化检测结果示骨髓间充质干细胞血管源性细胞表面抗原CD34呈阴性,而相对特异性标记物CD44呈阳性。转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞提取的细胞裂解液中,在Mr 23 000处有一条明显阳性杂交带;而转染pCDNA3.1(-)空载体的骨髓间充质干细胞提取蛋白未见阳性条带。 结论：实验成功地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞,该目的基因可稳定表达。     

重组碱性成纤维细胞生长因子基因转染对于骨髓源性成骨细胞的

背景：碱性成纤维细胞生长因子对来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有明显的促进增殖作用,对骨髓间充质干细胞具有间接的成骨作用。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染对骨髓源性成骨细胞生物学特性和血管生成的影响,与骨髓间充质干细胞作对比。 设计、时间及地点：对比分析基因转染效果实验,于2007-11-27/2008-12-01在南方医科大学珠江医院中心实验室和动物实验中心完成。 材料：2月龄新西兰大白兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨细胞诱导。5周龄Wistar大鼠用于移植实验。牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒由中山大学中山医学院免疫教研室徐霖博士惠赠。 方法：分离兔骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞,采用脂质体介导将牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒分别转染体外培养的兔骨髓间充质干细胞和诱导的骨髓源性成骨细胞,G418筛选。稳定转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓源性成骨细胞与磷酸钙胶原材料复合培养,植于Wistar大鼠后腿肌袋内,正常饲养2,4周后取出植入的复合材料,观察血管新生情况。 主要观察指标：碱性成纤维细胞生长因子转染前后骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性参数的比较以及骨髓源性成骨细胞转染碱性成纤维细胞生长因子前后新生血管数目的比较。 结果：利用RT-PCR、免疫细胞化学染色分析转染细胞的碱性成纤维细胞生长因子表达情况。从形态、增殖特性和细胞周期、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原等方面分析稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性。重组牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒成功转染目的细胞,经G418筛选稳定表达。转染的细胞有大量目的基因mRNA转录和目的蛋白表达。转染碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生长均加快,细胞周期中增殖期细胞比例明显增加,细胞形态无明显变化。转染与未转染的骨髓源性成骨细胞比较,碱性磷酸酶的分泌量无明显变化(P > 0.05),转染后骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶分泌量小于骨髓源性成骨细胞(P < 0.01)。骨髓源性成骨细胞转染与未转染碱性成纤维细胞生长因子基因组均有Ⅰ型胶原mRNA表达,但是,转染和未转染的骨髓间充质干细胞中均无Ⅰ型胶原基因mRNA转录。转染有外源性碱性成纤维细胞生长因子基因的复合材料部分被增生纤维结缔组织包绕,内有新生血管生成,随着时间的延长而增多。 结论：稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞增殖较快,但作为组织工程骨的种子细胞,骨髓源性成骨细胞较骨髓间充质干细胞更理想。外源碱性成纤维细胞生长因子基因转染后稳定表达,对新生血管的形成具有促进作用,可以作为组织工程化人工骨种子细胞转染的目的基因。     

骨髓间充质干细胞与小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜

背景：用骨膜修复骨缺损,已被大量实验所证实。但其来源有限,限制了临床大量应用。因此,应用组织工程学的原理和方法构建人工骨膜,值得进一步探索和研究。 目的：将经成骨诱导的兔骨髓来源的间充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜。 方法：取健康新西兰幼兔骨髓,密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞并进行体外扩增培养、成骨诱导分化及鉴定。将诱导分化的骨髓间充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜。观察细胞在生物材料上附着、生长、增殖及细胞分泌细胞外基质情况。 结果与结论：经成骨诱导的兔骨髓间充质干细胞在猪小肠黏膜下层上黏附、增殖速度加快,并能长入材料的孔隙内,分泌大量的细胞外基质成分,骨膜厚度随复合培养时间的延长而增加,类似生物骨膜。说明将经成骨诱导的骨髓间充质干细胞与小肠黏膜下层复合可以构建具有生理功能的组织工程骨膜。     

体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长、定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点。 目的：探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响。 方法：将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序。利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆。采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Western-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期。 结果与结论：脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位主要位于胞浆。转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P < 0.05)。提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖。     

骨髓间充质干细胞成骨方向诱导过程中的基因表达

背景：目前骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化演变中的基因表达模式尚不明确。 目的：观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,验证骨髓间充质干细胞是否向成骨细胞成熟分化。 方法：抽取2月龄新西兰大白兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞,用矿化诱导培养基(DMEM/F12、地塞米松1×10-8 mmol/L、β-磷酸甘油钠0.01 mol/L、维生素C 0.05 g/L)进行成骨诱导培养,用反转录-聚合酶链反应方法检测诱导培养后第一二代骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,并对该骨髓间充质干细胞表面抗原CD44进行鉴定。 结果与结论：经矿化诱导培养基诱导培养后,第一二代骨髓间充质干细胞阶段性表达碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因;第1代骨髓间充质干细胞抗原CD44阳性率达44.4%。提示兔骨髓间充质干细胞在体外矿化诱导培养中逐渐向成骨细胞分化,分别于诱导后第一二代细胞中阶段性顺序表达成骨细胞特异性基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素,该细胞已具备成骨细胞特征,为揭示骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中基因表达机制提供了实验依据。     

骨髓间充质干细胞在诱导液条件下向软骨细胞的定向诱导分化

背景：骨髓间充质干细胞易于从骨髓中分离，来源取材方便，对供体损伤小，具有强大的增殖能力及多向分化潜能，便于自体移植，如能成功诱导为软骨细胞将是软骨组织工程理想的种子细胞。 目的：观察体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化，并对分化后细胞进行鉴定。 设计、时间及地点：细胞形态学、蛋白质组学的比较观察于2005-05-03/2007-12-30在沈阳医学院临床中心实验室完成。 材料：骨髓间充质干细胞来源于二三个月龄新西兰健康大白兔，体质量2~2.5 kg。 方法：采用全骨髓法分离培养兔骨髓间充质干细胞。取生长良好的细胞第4代细胞消化传代，以1×105密度接种于24孔板中将生长状态良好的细胞在含有地塞米松、碱性成纤维细胞生长因子、维生素C及 转化生长因子β的培养液中诱导分化。 主要观察指标：采用免疫组化的方法进行细胞鉴定，RT-PCR法检测诱导分化细胞 II型胶原的表达。 结果：骨髓间充质干细胞经成骨诱导后,由长梭形变为椭圆形及肾形。免疫组织化学方法显示所培养间充质干细胞不表达CD34、CD45，但CD105显阳性。骨髓间充质干细胞在未经诱导时不表达Ⅱ型胶原蛋白，经诱导后在500~750 bp之间可见明显条带。 结论：骨髓间充质干细胞经含地塞米松、碱性成纤维细胞生长因子维生素C及 转化生长因子β等培养液诱导后，可以在体外向软骨细胞转化，高表达Ⅱ型胶原，并经细胞形态学及蛋白质组学RNA水平鉴定验证。     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景：骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。 目的：观察hVEGF165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。 方法：体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1∶3比例的混合液转染,并分为3组：转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。 结果与结论：转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义(P < 0.05),但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义(P > 0.05),转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义(P < 0.05),hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

壳聚糖-明胶-碱性成纤维细胞生长因子 三维大孔支架对骨髓间充质干细胞 增殖的影响**☆

背景：干细胞的分化潜能与培养条件有密切关系，改变支架材料的表面特性，三维结构，增加生长因子均可实现对干细胞增殖分化的控制。 目的：制备适合骨髓间充质干细胞附着生长的、具有最佳孔隙率和孔隙结构的药物缓释组织工程支架——三维大孔支架，提供能促进多能干细胞生长的微环境。 设计：重复测量设计。 单位：广州中医药大学基础医学院解剖教研室。 材料：实验所用健康成年SD大鼠由广州中医药大学实验动物中心提供。壳聚糖、碱性成纤维细胞生长因子购自Sigma公司。 方法：实验于2003-03/2006-12主要在广州中医药大学基础医学院解剖教研室完成。采用冷冻干燥的方法，用不同比例的壳聚糖-碱性成纤维细胞生长因子-明胶依次混匀，通过控制冷冻、复温和干燥时间处理使其具有最佳孔隙率和孔结构，制备具缓释碱性成纤维细胞生长因子功能的三维大孔支架。取SD大鼠股骨和胫骨骨髓，分离、培养骨髓间充质干细胞并移植于缓释碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架上进行三维培养，与无碱性成纤维细胞生长因子的支架对照。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。 主要观察指标：用ELISA和扫描电镜观察支架的三维结构和缓释性能，用苏木精-伊红染色、MTT、细胞计数及扫描电镜方法观察缓释碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架对骨髓间充质干细胞生长状态和细胞活力的影响。 结果：含有碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架有碱性成纤维细胞生长因子缓释性能，孔隙尺寸与不含碱性成纤维细胞生长因子的支架三维结构相比，差异无显著性意义（P > 0.05）。含有碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架能提高在支架上立体培养的骨髓间充质干细胞存活率，促进骨髓间充质干细胞黏附、增殖和活力，与不含碱性成纤维细胞生长因子的支架相比，差异有显著性意义（P < 0.05）。 结论：含有碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架能缓释碱性成纤维细胞生长因子，有利于在支架上立体培养的骨髓间充质干细胞存活，为其在组织工程中的应用打下基础。     

转基因骨髓间充质干细胞移植与组织工程皮肤的血管化

背景：组织工程化皮肤移植后常因缺乏足够的血管化而导致低灌注和缺血损伤。利用转基因技术,可将血管生成调控因子基因导入目的细胞,使其表达某些调控因子,进而利于血管生成。 目的：观察转基因骨髓间充质干细胞移植促进组织工程皮肤血管化基因治疗的可行性。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2008-03/11在江西省南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。 材料：人骨髓间充质干细胞由试验者取自临床骨髓穿刺检查骨髓正常的患者。pShuttle-CMV/VEGF165 质粒转化大肠杆菌菌种由武汉协和医院郜勇博士惠赠。16只新西兰大白兔用于皮肤缺损模型的制作,分为基因转染骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组、真皮支架材料组进行移植。 方法: 采用密度梯度离心结合贴壁法分离培养人骨髓间充质干细胞,以pShuttle-CMV/VEGF165质粒转染骨髓间充质干细胞。于兔背部两侧制备2 cm×2 cm 的正方形全层皮肤缺损3个,并分别以人血管内皮细胞生长因子165转染骨髓间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、不含细胞的真皮支架材料植入全层皮肤缺损创面。 主要观察指标：观察局部组织微血管密度变化及移植物成活率。 结果：术后7 d,3组创口周围皮肤均无明显红肿及炎症反应,移植物与创面接触紧密,基因转染骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组可见部分真皮泛红, 真皮支架材料组不明显,术后3周创面基本愈合,基因转染骨髓间充质干细胞组创面的毛细血管密度较骨髓间充质干细胞组、真皮支架材料组明显增高(P < 0.01),14 d时3组中基因转染骨髓间充质干细胞组血管密度仍最高,但3组数据无统计学差异。术后二三周基因转染骨髓间充质干细胞组移植物成活率最高(P < 0.01)。 结论：血管内皮细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞移植可改善和促进局部血管再生,促使新的毛细血管从创面长入移植的组织工程皮肤,从而促进组织工程皮肤的早期血管化及创面愈合。     

同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植：急性心肌梗死后血管新生及相关细胞因子的变化*☆

背景：骨髓间充质干细胞移植途径主要包括外周静脉注射移植、冠状动脉移植以及心肌内注射移植,但存在迁移缺少靶向性,价格高昂等局限性。 目的：观察同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植兔急性心肌梗死后梗死区血管新生及相关细胞因子的变化。 方法：提取兔骨髓进行骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化、扩增、鉴定,并标记。将55只兔随机分为正常组与手术组。手术组急性心肌梗死后1周,再随机分为3组：穴位注射干细胞组、模型对照组、穴位注射生理盐水组。5周后,取心肌组织进行免疫组织化学BrdU染色、心肌特异性肌钙蛋白T免疫组织化学染色检测;免疫组织化学法检测梗死心肌组织血小板内皮细胞黏附因子1水平;免疫组织化学法、夹心酶联免疫法、RT-PCR法、Western-Blot法检测血管内皮细胞生长因子及免疫组织化学法检测碱性成纤维细胞生长因子。 结果与结论：穴位注射的骨髓间充质干细胞可迁移至梗死区,并可以在梗死区分化为心肌样细胞。与模型对照组及穴位注射生理盐水组比较,穴位注射骨髓间充质干细胞可使梗死区及周围组织血小板内皮细胞黏附因子1表达上调,诱导梗死区及周围组织血管新生,其机制是刺激心肌组织中碱性成纤维细胞生长因子表达上调。穴位注射骨髓间充质干细胞组梗死心肌组织中和血清中血管内皮细胞生长因子表达均无上调趋势,因此推测,血管新生由碱性成纤维细胞生长因子及未知因素诱导。     

Wnt信号分子诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

间充质干细胞可向神经方向转化,但分子机制目前不清楚。 目的：观察Wnt3a和Wnt5a在骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中的作用。 方法：体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传代后通过形态学和流式细胞仪检测细胞表面标志物CD14,CD44,CD9,CD34,CD45表达。采用碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a和Wnt5a的诱导方案,免疫组织化学法和RT-PCR检测Wnt3a、Wnt5a在骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化过程中的作用。 结果与结论：骨髓间充质干细胞为长梭形,表面标志物CD9,CD44高表达,CD34,CD45低表达。诱导后细胞Wnt3a诱导组巢蛋白,神经元特异性烯醇化酶呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白无明显表达,细胞活力良好。Wnt5a诱导组巢蛋白呈弱阳性表达,而神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性。RT-PCR结果显示Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后5 d可见明显的扩增条带,10 d后更加明显。胶质纤维酸性蛋白在诱导10 d后出现较弱的扩增条带。提示Wnt3a分子能够促进体外培养的间充质干细胞向神经元样细胞分化。     

骨髓间充质干细胞-胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统的

背景：体内研究已经证实骨髓间充质干细胞能够像神经干细胞一样在脑内迁移和整合,如果骨髓间充质干细胞用于系统途径移植成为可能,将会显著简化移植的步骤。 目的：构建含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的重组表达质粒pEGFP-N3-CD,用脂质体Lipofectamine2000转染大鼠骨髓间充质干细胞,体外观察CD基因的表达及BMSCs-CD/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对C6胶质瘤细胞的杀伤作用。 方法：构建pEGFP-N3-CD质粒,酶切、DNA测序鉴定。全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,脂质体Lipofectamine2000介导重组表达质粒pEGFP-N3-CD转染大鼠骨髓间充质干细胞。G418筛选培养获取阳性克隆(BMSCs-CD细胞),免疫细胞化学染色检测BMSCs-CD细胞的CD基因蛋白表达。Transwell小室共培养BMSCs-CD细胞和C6胶质瘤细胞,24 h后加入前体药物5-氟胞嘧啶,72 h后TUNEL、MTT、流式细胞术检测C6胶质瘤细胞的凋亡情况。 结果与结论：构建的重组表达质粒pEGFP-N3-CD含完整的CD基因序列,CD基因转染至骨髓间充质干细胞并在基因及蛋白水平有完整表达。BMSCs-CD和C6胶质瘤细胞体外共培养条件下,C6胶质瘤的凋亡率呈剂量依赖性,与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.01)。结果提示体外共培养条件下,BMSCs-CD/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对C6胶质瘤细胞生长有显著的抑制作用。     

新型组织工程化骨材料植入动物体内的成血管效应

背景：以生长因子、种子细胞、载体支架为基础的骨组织工程研究取得的成功,向人们展示了再造骨组织器官的美好前景,然而在临床应用方面往往效果不理想。其中很重要一个原因是组织工程骨很大程度上受制于移植物血管网缺乏造成的细胞供养障碍而导致失效。 目的：新型组织工程骨修复材料植入新西兰兔桡骨缺损处观察其成血管作用。 方法：将聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物包裹碱性成纤维细胞生长因子制备成微球囊,然后与磷酸钙骨水泥混合,并与体外培养的同种异体骨髓间充质干细胞共培养制备新型组织工程骨修复材料。60只成年新西兰兔建立15 mm桡骨缺损模型后随机分成2组,实验组植入新型组织工程骨修复材料,对照组植入复合骨髓间充质干细胞的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物与磷酸钙骨水泥的混合材料。于术后4、8、12周,通过组织细胞形态学观察、核素骨扫描等手段,观察各个时期血管形成情况。 结果与结论：光镜下组织形态学观察结果及核素骨扫描结果示血管化程度是实验组优于对照组。 结果显示聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物-成纤维细胞生长因子/磷酸钙骨水泥材料复合骨髓间充质干细胞构建的新型组织工程骨修复材料在动物体内有较好的成血管效果。     

体外诱导获得雪旺细胞的可靠性研究

目的 研究骨髓基质细胞(BMSCs)在体外条件下向周围神经雪旰细胞(SCs)分化的可靠性. 方法 分离提取SD大鼠股骨和胫骨部位BMSCs.利用其贴壁生长的特性.培养纯化,传代扩增.用复合诱导因子(β.巯基乙醇+全反式维甲酸+血小板凝集抑制剂+m小板源性生长因子+碱性成纤维细胞生长因子)在体外诱导BMSCs分化.免疫细胞化学方法 检测P75、S-100及胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,荧光实时定量PCR检测P75、S100及CD104的表达. 结果诱导后的BMSCs形态类似SCs,免疫荧光染色鉴定其具有SCs性质,表达SCs的表面标志物(GFAP、S100和P75).荧光实时定量PCR结果显示诱导后BMSCs S-100、CD104的表达量达到了SCs的表达量水平,但P75的表达量与SCs的表达量水平还有较大差距. 结论 体外诱导BMSCs可部分获得SCs的特征,传代后恢复至未诱导状态,这种预诱导加复合因子诱导的方法 尚待完善.     

甲状腺激素对大鼠骨髓间充质干细胞分化为少突胶质细胞的影响

背景：如何为脱髓鞘疾病的细胞替代治疗提供丰富的少突胶质细胞来源是急需解决的问题。 目的：实验拟采用表皮生长因子及碱性成纤维细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞方向分化,撤退细胞因子后,用甲状腺激素诱导神经干细胞向少突胶质细胞分化。 设计、时间及地点：细胞观察实验,于2007-08/12在泸州医学院神经生物学研究室完成。 材料：普通级SD大鼠5只用于骨髓间充质干细胞的培养。 方法：采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞,传至第4代,用含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、N2辅助因子、甲状腺激素T3的DMEM/F12诱导液诱导向神经干细胞分化。诱导后4 d,更换成含胎牛血清、甲状腺激素T3的DMEM/F12分化液,诱导向少突胶质细胞分化。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞生长情况和形态变化,采用SABC法进行免疫细胞化学检测神经细胞特异性标志的表达。 结果：原代细胞接种3 d后多数贴壁,传代后细胞贴壁速度加快,增殖能力更强。诱导液处理第4天,圆形细胞聚集成簇。换成分化液后,细胞伸出树枝状细长突起,交织成网,形成少突胶质细胞样细胞。骨髓源性细胞簇表达巢蛋白阳性,示神经干细胞;从细胞簇分化的细胞,多数细胞表达半乳糖脑苷脂,部分细胞表达髓鞘碱性蛋白,示少突胶质细胞,少数细胞表达微管相关蛋白2阳性,示神经元。 结论：甲状腺激素在体外可诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化。     

人胎盘源与人骨髓源间充质干细胞的生物学性状比较

人骨髓源间充质干细胞具有很好的临床应用价值,但数量和取材都有限,而人胎盘源间充质干细胞则相反,目前已成为再生医学的重要细胞来源和最具临床应用前景的功能干细胞。 目的：比较人胎盘源间充质干细胞和人骨髓源间充质干细胞体外分离培养、扩增及生物学性状的差异。 方法：采用胶原酶消化法分离人胎盘组织,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,分别加入体积分数10%胎牛血清的LG-DMEM 培养液,待细胞汇合至90%后消化传代。分别取第3代的人胎盘和骨髓间充质干细胞,按1×106 浓度接种,当细胞达70%~80%融合时,换成成脂细胞诱导分化培养液,诱导16 d。 结果与结论：胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞均成贴壁生长、形态均一的成纤维样细胞梭形外观,但后者体积略小。两种细胞均高表达CD29、CD44,不表达CD34、CD106。二者均可分化为脂肪细胞。可见,从胎盘和骨髓中培养出的间充质干细胞在细胞形态、生长特性等方面基本相似,在体外均可有效扩增并成脂肪分化,均可作为组织工程的另一成体干细胞来源,而胎盘源间充质干细胞具有更好的应用前景。     

锌及碱性成纤维细胞生长因子单独或联合应用体外培养骨髓间充质干细胞生长及增殖

背景：如何简便有效的在体外大量扩增骨髓间充质干细胞,已成为神经科学研究热点。 目的：观察锌及碱性成纤维细胞生长因子单独或联合应用对骨髓间充质干细胞体外生长及增殖的影响,以寻求体外快速、大量增殖骨髓间充质干细胞的有效方法。 方法：体外培养大鼠骨髓间充质干细胞。实验分为对照组(不加任何影响因子)、锌组、碱性成纤维细胞生长因子组、锌+碱性成纤维细胞生长因子组,分别用特定浓度的锌及碱性成纤维细胞生长因子单独或联合应用。观察细胞生长曲线,用四唑盐比色法观察存活和增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期,进行细胞表面抗原的鉴定。 结果与结论：细胞生长曲线、四唑盐比色法、流式细胞仪结果均显示,第3~5天各组增殖能力达高峰,其中锌+碱性成纤维细胞生长因子组增殖能力最强(P < 0.05)。第7天,对照组及单独应用碱性成纤维细胞生长因子和锌组细胞增殖力均有所下降,仅锌+碱性成纤维细胞生长因子组细胞仍保持较强的增殖(P < 0.05)。锌+碱性成纤维细胞生长因子组细胞中处于S+G2+M期的百分率最大,与其他3组相比差异有显著性意义(P < 0.01)。结果证实,锌和碱性成纤维因子均有促进体外培养的骨髓间充质干细胞增殖的作用,联合应用锌和碱性成纤维细胞生长因子促增殖作用最强,可以作为体外扩增培养骨髓基质细胞的最佳培养条件。     

Wnt3a促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景：Wnt信号通路是细胞增殖分化的关键调控环节,但与骨髓间充质干细胞神经分化的联系并不十分明确。 目的：寻找促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的Wnt信号分子。 方法：首先体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞并传代,行形态学观察,并以流式细胞学方法检测细胞表型CD44,CD9,CD34和CD45。采用碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a或Wnt5a的方案诱导分化,应用免疫组化和反转录-聚合酶链反应方法比较Wnt3a和Wnt5a对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的影响。 结果与结论：骨髓间充质干细胞为长梭形,CD9,CD44高表达,CD34,CD45低表达。Wnt3a诱导组的巢蛋白和神经元特异烯醇化酶呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白无明显表达,诱导后细胞的活力良好。Wnt5a诱导组巢蛋白呈弱阳性表达,而神经元特异烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性。反转录-聚合酶链反应结果显示,Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异烯醇化酶在诱导后5 d可见明显的扩增条带,10 d后更加明显。胶质纤维酸性蛋白在诱导10 d后出现较弱的扩增条带。Wnt5a组、对照组骨髓间充质干细胞在诱导后10 d巢蛋白有微弱表达,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白几乎无表达。提示Wnt3a分子能够促进体外培养的骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化。