迁移侵袭抑制蛋白MIIP的GST融合蛋白表达及生物学活性鉴定

目的构建人MIIP蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达及生物学活性鉴定。方法 RT-PCR扩增得到人MIIP基因全长编码序列,采用重组DNA技术将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得重组原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌BL21细胞中,用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经纯化获得目的蛋白,用Western blot鉴定所得融合蛋白。结果构建了pGEX-4T-1-MIIP原核表达载体,在大肠杆菌中表达获得了GST-MIIP融合蛋白,经Glutathione Agarose纯化和Western blot检测,证实所得GST-MIIP融合蛋白具有生物学活性。结论成功获得了有生物学活性的GST-MIIP融合蛋白。     

重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1的构建及表达

目的:构建人肿瘤相关抗原MAGE-1基因原核表达载体.方法:从人肝细胞性肝癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增出MAGE-1基因.酶切鉴定后,将其插入pGEM-T载体,再克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h,SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况.结果:RT-PCR扩增出长度为927 bp的MAGE-1基因.重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1转化大肠杆菌BL21(DE3)后经诱导表达,目的蛋白约57 000,占菌体总蛋白的23%.结论:成功构建出重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1,该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.     

剪接因子SRp55原核表达质粒的构建和表达

目的:本研究通过扩增剪接因子SR蛋白家族的SRp55基因,构建GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55,并在大肠杆菌中诱导表达并进行纯化。方法:用PCR法扩增SRp55基因,将扩增产物和载体pGEX-2T进行双酶切后回收,连接载体和目的片段,获得重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。在大肠杆菌BL21(DE3)中通过IPTG进行诱导表达,然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠,亲和纯化得到纯的GST-SRp55融合蛋白。结果:SRp55基因以正确的阅读框架插入pGEX-2T。IPTG诱导大肠杆菌BL21(DE3)表达,随诱导时间的增加蛋白表达量增高,4h以后接近最高表达量。通过亲和纯化得到分子量在60kD左右的蛋白,经蛋白印迹分析证实为GST-SRp55融合蛋白。结论:成功地构建了GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55,并获得GST-SRp55融合蛋白,为进一步研究tau蛋白可变剪接机制提供了必要的基础。     

pGEX-5X-1-hLMO4原核质粒构建及重组蛋白表达

目的:构建hLMO4的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达。方法:hLMO4全长编码基因经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)在BL21大肠杆菌中诱导GST-hLMO4融合蛋白表达,利用Glutathione Sepharose 4B纯化诱导的融合蛋白,并经Western blot鉴定结果。结果:hLMO4编码序列克隆至pGEX-5X-1载体中,双酶切鉴定片段大小为500 bp,在E.coli BL21中IPTG诱导融合蛋白的表达,分子质量约为49 000 Da,成功纯化出GST及GST-hLMO4蛋白,Western blot检测到蛋白表达。结论:构建了hLMO4基因原核表达载体,鉴定了GST-hLMO4融合蛋白表达。     

重组原核表达载体pGEX6P1-Osx的构建与表达

目的构建原核表达载体pGEX6P1-Osx,并在大肠杆菌中诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白。方法提取新生小鼠牙髓总RNA,RT-PCR扩增Osx目的基因片段,并将该片段克隆至PCR-TopoII载体中;经鉴定正确后目的基因定向连接至表达载体pGEX6P1;将重组质粒pGEX6P1-Osx转化至大肠杆菌BL21,以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE电泳鉴定;免疫印迹法检测纯化的GST融合蛋白。结果IPTG诱导宿主菌BL21有效表达融合蛋白;免疫印迹法鉴定该融合蛋白为GST-Osx。结论成功构建原核表达载体pGEX6P1-Osx,且GST-Osx融合蛋白可在大肠杆菌中诱导表达。     

多功能转录因子CTCF重组质粒构建及其表达鉴定

目的 构建人CTCF cDNA全长及N端、Zn指、C端3个片段的原核融合表达载体,纯化融合蛋白并进行鉴定.方法 以编码CTCF全长序列的质粒为PCR模板,分别构建GST融合表达重组质粒pGEX-4T-2-CTCF,pGEX-4T-2-CTCF-N,pGEX-4T-2-CTCF-Zn,pGEX-4T-2-CTCF-C,转化大肠杆菌BL21,酶切、测序鉴定;优化IPTG诱导表达条件,并对亲和层析纯化的GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF进行Far-West-ern blot鉴定.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实构建成功.GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C均在大肠杆菌中成功诱导表达,融合蛋白经亲和层析纯化获得纯化蛋白.各纯化蛋白经SDS-PAGE和Far-Western blot鉴定,均为诱导表达蛋白质.结论 成功构建了GST融合表达CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C的重组质粒,对融合蛋白表达条件进行了优化.获得了高效表达的GST融合蛋白.     

h-arrestin1重组蛋白不同亚型筛选及互作鉴定

 目的 构建GST/-arrestin1融合蛋白表达载体,筛选其不同亚型重组子,并诱导表达、纯化蛋白,初步进行蛋白亚型互作比较,为进一步功能研究提供实验基础。方法 提取人结肠癌细胞SW480的mRNA,反转录为cDNA。用PCR法扩增h?-arrestin1全长编码基因,通过SalI和NotI酶切位点将h?-arrestin1全长定向插入pGEX-5X-1中,构建原核表达载体pGEX-5X-1-?-arrestin1,并通过BglⅡ单酶切筛选A、B亚型,然后将重组质粒转入E.coli BL21 中,异丙基硫代β-D 半乳糖苷诱导表达,用谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化表达的GST/?-arrestin1A、B, SDS-PAGE鉴定,互作实验比较亚型的结合能力。结果 酶切及测序结果证明,成功构建了?-arrestin1A、B原核表达载体,并通过SDS-PAGE证实：经IPTG诱导表达及亲和纯化,从转化重组质粒的BL21菌株中获得了融合蛋白GST/?-arrestin1A、B亚型,通过GST Pulldown初步比较了重组?-arrestin1A、B蛋白亚型的结合能力结论 成功构建pGEX-5X-1-?-arrestin1A、B原核表达载体并确定了融合蛋白的诱导表达及纯化方法,且互作实验显示?-arrestin1A有较强的结合能力,为进一步研究?-arrestin1的生物学功能奠定了基础。     

果蝇神经特异性拼接因子Dxl6变体在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

目的:表达与纯化果蝇中SR蛋白家族新成员Dxl6 N端变体.方法:用PCR方法扩增得到Dxl6 N端基因片段,经酶切亚克隆至pGEX-4T-1原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中与GST融合表达,并用谷胱甘肽-sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白.结果:表达产物以可溶形式经亲和层析柱纯化后获得相对分子质量约为37 000的融合蛋白.结论:成功克隆、表达并纯化了果蝇神经特异性拼接因子Dxl6N端变体与GST的融合蛋白.     

谷胱甘肽-S-转移酶人趋化因子CCL3L1的表达

目的克隆人趋化因子CCL3L1基因,表达并初步纯化谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-CCL3L1融合蛋白。方法从乳腺癌细胞MCF7中提取总RNA,采用RT-PCR扩增CCL3L1cDNA基因,克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-1中,重组载体经酶切和测序鉴定后,在BL21大肠杆菌中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得GST-CCL3L1融合蛋白,采用SDS-PAGE和Westernblotting分析表达产物。结果经测序、酶切鉴定证明CCL3L1基因已正确插入到pGEX-4T-1中,经IPTG诱导后,表达出相对分子质量为34000的新生GST-CCL3L1融合蛋白。结论GST-CCL3L1融合蛋白可被成功表达。     

大鼠SM22α的原核表达与纯化

目的 构建大鼠平滑肌22α(smooth muscle 22α,SM22α)原核表达质粒,使其在原核细胞中高效表达并纯化.方法 将SM22α cDNA全长片段插入pGEX-3X载体构建重组子pGEX3X-SM22α,转化宿主菌.经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达SM22α蛋白,谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)亲和层析纯化.结果 重组子经酶切后,电泳分离出预期长度的插入片段.重组子转化的大肠杆菌JM109,经诱导剂诱导和GST亲和层析纯化后,得到纯化的GST-SM22α融合蛋白.结论 本实验重组的pGEX3X-SM22α可在大肠杆菌中高效表达GST-SM22α融合蛋白,为进一步研究SM22α的功能奠定了基础.