肿瘤细胞并不经常产生

由于有丝分裂之后瘤细胞仍然是瘤细胞,故细胞的致癌特性存在于细胞核 DNA,这意味着瘤细胞经由突变产生。显然只有特殊的突变才引起肿瘤。致癌突变的准确频率不明。在人体,自发性突变率约为每基因每代有10~(-4)～10~(-6)突变型,平均2×10~(-5)突变型,亦即平均5×10~4细胞有一突变型。没有理由认为这个数字在癌发生上会有很大的出入。由于成人每天大约产生10~(11)新细胞,即使仅突变一次,结果就是每天将产生10~(11)/5×10~4=2×10~6新的     

HBV感染诱发AID高表达与肝细胞癌变相关性研究

目的通过研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)长期感染与诱导性脱氨酶(activation induced deaminase,AID)表达水平的关系探讨肝癌发病机制。方法采用实时定量PCR法,测定乙肝病毒感染及转化生长因子β1(TGF-β1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对Apobec蛋白家族AID和Apobec3G表达量的影响;采用3D-PCR法检测AID、Apobec3G表达组对乙肝病毒基因突变的影响;克隆测序PCR扩增乙肝病毒X基因产物,对比AID和Apobec3G对乙肝病毒基因组突变的影响,计算突变率;并用逆转录病毒携带AID组和对照组在肝脏细胞转染表达后,克隆测序PCR细胞部分基因扩增,对比测定对细胞基因组突变的影响,计算突变率。结果乙肝病毒感染或生长因子TGF-β1刺激使肝细胞中AID表达上调>10倍,TGFβ1刺激组较非刺激组引起乙肝病毒基因组高突变,分别为55个克隆中的16和4个。AID高表达使乙肝病毒基因组高度突变,突变率为55个克隆中的16个,显著高于对照组的1个,多为G到A突变;而且AID高表达使部分细胞基因组如p53和c-myc基因高度突变,突变率分别为8.2×10-5和7.3×10-5,高于对照组的突变率0。结论慢性肝炎病毒感染协同细胞因子诱导AID高表达,高表达的AID使肝炎病毒基因及细胞基因组突变,为肝细胞癌变的相关因素。     

洗涤剂LAS及AEO的抗诱变效应的研究

对洗涤剂的主要成份LAS(直链型烷基苯磺酯)及AEO(脂肪醇乙氧基缩合物)的短期遗传毒性测试,未发现具有诱突变作用,却有抗诱变效应。在大肠杆菌的35株SOS显色试验中,甲基磺酸甲酯(8.00×10~(-5)V/V)的诱变能被AEO所抑制,LAS也能抑制0.2～4％(V/V)甲基磺酸甲酯的诱变作用。在人外周血淋巴细胞培养中LAS及AEO均能抑制羟基脲诱发的非程序DNA合成(UDS),     

β-Catenin基因突变与非小细胞肺癌临床病理特征的关系

目的了解β-catenin基因外显子3在非小细胞肺癌组织中的突变及其与肿瘤病理分型、分化程度和淋巴结转移的关系.方法采用PCR-SSCP和DNA测序等方法对36例非小细胞肺癌术后标本,进行了β-catenin基因外显子3突变研究分析.结果在36例非小细胞肺癌组织标本中,19.44%(7/36)发生了β-catenin基因外显子3突变,其中4例突变位于密码子53.β-catenin基因外显子3的突变率与病理类型无关(P＞O.05);而与肿瘤的分化程度有相关性(P＜O.05);在有淋巴结转移的病例标本中,β-catenin基因外显子3的突变率明显高于无转移病例(P＜0.05).结论研究显示在非小细胞肺癌组织中的β-catenin基因外显子3有突变,并且在我国的突变率较国外的报道要高;β-catenin基因外显子3的突变与非小细胞肺癌淋巴结转移和肿瘤分化程度相关,提示β-catenin基因外显子3的突变是非小细胞肺癌患者的不良预后因素之一.     

全反式维甲酸对人膀胱癌细胞株T24生长 抑制和凋亡诱导作用的实验研究

 目的　探讨全反式维甲酸(ATRA)对人膀胱癌细胞T24的生长抑制和凋亡诱导作用。方法　应用细胞和分子生物学技术检测不同浓度ATRA对T24细胞生长和凋亡的影响。结果　3×10-5M～3×10-7M ATRA可显著抑制T24细胞增殖。用3×10-5M和3×10-6M ATRA作用细胞6天出现典型凋亡特征;3×10-5M、3×10-6M组及对照组的细胞凋亡率分别为20.16%、15.31%和1.49%;DNA琼脂糖凝胶电泳呈现凋亡特征性的DNA梯形带。结论　ATRA对人膀胱癌细胞T24有剂量生长抑制作用,且可成功地诱导人膀胱癌细胞T24发生凋亡。     

哺乳类细胞参与MNNG诱导的非定标性突变发生基因的分离和功能研究

目的:遗传不稳定是存在于人类遗传性疾病及肿瘤中的一种重要现象,也可由环境致癌性理化因子诱发,但其发生的具体机制尚不清楚。本实验室已证实了烷化剂N - 甲基- N’- 硝基- N - 亚硝基胍(MNNG) 可以诱发出vero 细胞的遗传不稳定状态,表现为延迟发生的非损伤部位DNA 突变率增加(非定标突变) ,且突变谱明显不同于由MNNG直接攻击引起的定标性突变。转录抑制剂放线菌素D 可抑制这种突变的形成,提示它的发生依存于基因表达的改变。本研究目的是分离筛选参与以非定标性突变为特征的遗传不稳定发生的相关基因。方法:利用反义核酸技术,对本实验室用差异显示方法分离得到的EST 片段进行功能分析。首先改建了两个真核表达载体的抗性,利用抗性选择使之进入细胞后不会干乱利用穿梭质粒Z189 进行非定标性突变率检测的实验系统。利用此载体构建含反向插入片段的真核细胞表达重组体并转染细胞,以获得反义RNA 阻断其相应基因的表达,再检测非定标性突变率的变化。结果:筛选得到两个EST 片段(片段9 ,片段10) ,它们相关基因的表达被阻断后,非定标突变率均发生了显著的改变。9 号片段相关基因的表达阻断后,非定标性突变率显著增高,vero 细胞组、含空载体的vero2pM2amp2细胞组及含正反向插入片段的表达质粒的细胞vero2pM2amp29 ,自发突变率均较接近,分别为1. 6 ×10 - 4 ;4. 9 ×10 - 4 ;4. 7 ×10 - 4及4. 0 ×10 - 4 ,而MNNG处理后突变率均显著增高,分别为23. 6 ×10 - 4 ;36. 1 ×10 - 4 ;25. 0 ×10 - 4及67. 0 ×10 - 4 ,与自发突变率相比P < 0. 01 ,而其中vero2pM2amp29 - 细胞系在MNNG处理后pZ189 复制的突变率较其它各组的非定标性突变率进一步增高, P < 0. 05 ,在含反向插入片段的表达质粒的细胞vero2pM2amp210 - 中,10 号片段的相关基因表达阻断后,非定标性突变率下降至自发突变水平。vero 细胞组、含空载体的vero2pM2amp - 细胞组及vero2pM2amp210 - 细胞组,自发突变率较接近,分别为17. 2 ×10 - 4 ;4. 6 ×10 - 4及5. 2 ×10 - 4 ,在MNNG处理后,突变率分别为17. 2 ×10 - 4 ;16. 1 ×10 - 4及2. 5 ×10 - 4 ,vero2pM2amp - 10 细胞组的非定标突变率与其它组比较P < 0. 01。结论:反义核酸技术筛选到两个分离片段的相关基因与哺乳类细胞非定标性突变发生有关,其中9 号片段的相关基因可能参与维持细胞遗传稳定性,抑制非定标性突变的发生,而10 号片段的相关基因则可参与引起烷化剂处理后细胞非定标性突变的产生。     

砷对人二倍体细胞的遗传毒性作用

本研究首次用一系列细胞遗传毒理学指标如SCE、DNA含成抑制、UDS、DNA单链断裂和DNA蛋白质交联来检测砷对人二倍体细胞DNA损伤和修复作用。结果表明:①As_2O_3(As1×10~(-8)-10~(-6)M)明显诱导人外周血淋巴细胞SCE频率,且呈剂量效应关系;②一定剂量砷能抑制2BS细胞DNA合成、诱导UDS和DNA蛋白质交联和单链断裂,表明砷对DNA有一定程度损伤作用;③3μM砷可能细胞毒性较小,而与蛋白质结合量较大,故诱导的DNA蛋白质交联作用最大,我们认为砷对DNA损伤作用较弱,可能不是其致癌作用的主要原因。与DNA损伤效应不同,砷是断裂剂,引起染色体断裂,可能因易位到另外染色体的某些基因区域上,形成基因重排、激活癌基因而致癌。     

穿梭质粒与细胞诱变研究

肿瘤的分子遗传学研究把癌变与DNA结构的改变直接联系起来,使细胞突变机理获得了理论上的推动力。最近十年来分子生物学技术的发展为在分子水平上对细胞突变机理的研究提供了实验基础。利用可以自主复制的DNA分子作为载体将一个靶基因引入哺乳动物细胞来研究细胞的自发和诱发突变,克服了过去在细胞诱变研究中所存     

人非小细胞肺癌组织p16基因缺失及突变的研究

目的　探讨人类非小细胞肺癌组织中p1 6基因缺失及突变情况及其与临床病理的关系。方法　应用控制模板DNA量的银染PCR SSCP技术检测 40例非小细胞肺癌手术切除标本中p1 6基因第 2外显子。结果　 40例中有 1 3例发生纯合缺失 ,3例发生突变 ,缺失及突变率为 40 %。其缺失及突变率与肺癌的临床分期有密切关系 (P <0 .0 5)。结论　p1 6基因的缺失及突变可能在非小细胞肺癌的发生、发展及转移中起重要作用。如     

甲基磺酸甲酯诱发WTK1细胞tk位点突变试验方法的建立

目的 :建立WTK1细胞tk基因突变试验方法 ,为毒理学评价和机制的研究提供实验依据。 方法 :用标准诱变剂甲基磺酸甲酯(MMS)处理WTK1细胞 ,检测tk位点突变率和细胞 p53基因蛋白表达水平的改变。 结果 :MMS可诱导WTK1细胞tk位点突变率增加 ,MMS的处理剂量达到10mg·L-1 时 ,tk位点突变率为985.2/106 个细胞 ,并有剂量反应关系。诱发突变率约是自发突变率3～10倍。在tk位点诱发了两种不同表型的突变集落 ,即正常生长突变体(tk_NGmutant)和慢生长突变体(tk_SGmutant) ,但以慢生长突变体为主。MMS处理后 ,WTK1细胞P53蛋白的表达水平增高。 结论 :MMS可以诱发WTK1细胞tk位点的突变率增加 ,MMS处理细胞后 ,P53蛋白的表达水平增高 ,说明WTK1细胞的P53蛋白的功能尚未丧失。该方法的建立 ,为进一步开展tk基因突变试验 ,评价环境化学物的诱变性奠定了基础     

鼻咽癌细胞系中LTF基因的表达及遗传学与表观遗传学改变

目的 检测鼻咽癌(NPC)细胞系中LTF基因的表达水平,并分析遗传学和表观遗传学改变与其表达的关系.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),检测NPC细胞系HNE1、HNE2、HNE3、CNE1、CNE2、5-8F、6-10B和15例慢性鼻咽炎组织中LTF mRNA表达水平,同时通过Western blot法分析6-10B细胞中LTF蛋白水平.运用微卫星分析技术、聚合酶链式反应-单链构象多态(PCR-SSCP)方法和甲基化特异性PCR(MSP)以及亚硫酸盐克隆测序方法,分别检测LTF的杂合性丢失、突变和启动子区甲基化情况.结果 在15例慢性鼻咽炎组织中,LTF基因稳定表达.在NPC细胞系中,除6-10B细胞有LTF基因弱表达外,其余均表达缺失,显著低于慢性鼻咽炎组织中的表达(Z=-3.738,P=0.000),且6-10B细胞中无LTF蛋白的表达.杂合性丢失分析显示,NPC细胞系中不存在LTF微卫星位点的缺失.突变检测显示,LTF在NPC细胞系中的突变率为14.3%(1/7),且突变存在于HNE1细胞系中,即启动子序列-305至-50 bp发生了缺失突变(-218delT).甲基化分析显示,LTF基因在慢性鼻咽炎组织中无甲基化,而在所有NPC细胞系中均有甲基化.用5-杂氮-2-脱氧包苷处理5-8F和6-10B细胞后,LTF mRNA表达上调.结论 LTF基因在NPC细胞系中表达失活,其分子机制与启动子高甲基化和缺失突变有关.     

NADH对DENA所致L02细胞H-ras基因突变及c-erbB-2表达的影响

目的:研究还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)对二乙基亚硝胺(N-nitrosodiethylamine,DENA)诱变L02细胞过程中H-ras基因突变及c-erbB-2表达的影响.方法:聚合酶链式反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)法检测NADH对DENA所诱发的L02细胞H-ras基因突变的影响;Southern印迹法分析其对c-erbB-2基因表达的影响;RT-PCR法检测NADH对rasp21、c-erbB-2 mRNA表达水平的调控.结果:经NADH防护的DL02-Ⅲ细胞和DL02-B 细胞的H-ras exon1突变率分别降至25.0%(3/12)和41.7%(5/12),与DENA致突变组相比,差异有统计学意义(P<0.05);Southern 检测结果显示,NADH可下调由DENA所诱变的L02细胞中c-erbB-2基因的表达提高;RT-PCR检测结果提示,DENA诱变组细胞的rasp21、c-erbB-2 mRNA表达水平上调,而经NADH处理后,与DENA诱变组相比,可明显降低rasp21和c-erbB-2 mRNA表达水平上调的程度.结论:NADH抗突变作用的可能机制,与其在基因突变以及在转录水平对H-ras、c-erbB-2等相关癌基因的调控有关.     

THE ESTABLISHMENT OF pS189/FLCⅢ 2 SYSTEM FOR MUTAGENESIS STUDY

本文报道优选基于ＳＶ４０的短暂复制型穿梭质粒ｐＳ１８９和新生儿羊膜上皮细胞ＦＬＣⅢ—２亚克隆，组成穿梭质粒／哺乳动物细胞诱变检测系统。该系统中ＳｕｐＦ的自发突变型频率仅为１．７×１０－５，低于已报道的其它短暂复制型质粒和该质粒在其它细胞中复制时ＳｕｐＦ基因的自发突变率。各种剂量的ＭＮＮＧ的诱发突变频率随诱变剂剂量的增加而升高。ＭＮＮＧ对ＦＬ细胞毒性较大，仅０．３２μｇ／ｍｌ就可使ＦＬ几乎完全失去生长分裂形成克隆的能力，但在短时期内对依赖于病毒复制起点的ＤＮＡ复制效率影响不大，突变频率却显著升高。突变质粒的限制性内切酶分析和靶基因的ＰＣＲ分析等表明，检出突变大多数为点突变或微小缺失，该系统具有方便快速检出点突变的能力，可成为检测诱变剂、抗诱变剂作用强度和特性的分子检测系统。     

IL-6基因转染的白血病细胞不同条件下体内外分泌IL-6水平的研究

我们将IL-6基因转染至FBL-3红白血病细胞,建立了高分泌IL-6的FBL-3-IL-6~ 细胞克隆株,并观察了不同照射剂量下其体外生长情况,IL-6分泌水平及不同途径接种人体内后血清和注射局部细胞培养上清中IL-6含量。将IL-6基因转染的FBL-3-IL-6~ 细胞调成1×10~5/ml浓度,分放于瓶中,置钴~(60)下分别照射不同剂量后,置5％CO_2中培养,观察其生长情况和半数死亡时间和全部死亡时间,并每日收集上清冻存待测IL-6。另外将高分泌IL-6的FBL-3-IL-6~ 细胞以2×10~5浓度分别通过腹腔和左股部皮下注入小鼠体内,并于不同时间取小鼠血清测IL-6含量(同时没对照组)。结果表明,当体外照射剂量<500Rad时,不能有效地控制白血病细胞的增殖能力,且于半个月中能保持较高水平的IL-6分泌量。所以当制备灭活的瘤苗时,以选用800Rad的钴~(60)照     

携带XylE基因的穿梭质粒诱变分析系统在诱变剂检测中的应用

以邻苯二酚氧化酶基因－ｘｙｌＥ为靶基因，以新霉素抗性基因ｎｅｏ为选择基因构建的ｐＥＳｎｘ穿梭质粒转染人羊膜细胞ＦＬ，得到一株携带有完整的自主复制型ｐＥＳｎｘ质粒的Ｇ４１８抗性细胞株ＦＥＳｌ．７。经测定该细胞株平均每细胞含有质粒２６个拷贝，且在８个月的传代培养中保持稳定，ｐＥＳｎｘ质粒在ＦＥＳ１．７细胞内ｘｙｌＥ基因的自发突变率仅４．３×１０－５。因此由ＦＥＳ１．７细胞构成的系统可在人体细胞中进行诱变检测。该系统灵敏度高，可对低效诱变剂在人体中引起的基因突变进行检测，而且特别适合于研究人体细胞中基因突变的分子机制。利用此ＥＢＶ－ｘｙｌＥ穿梭质粒诱变分析系统我们已对ＥＭＳ进行了诱变分析，对于ＦＥｓ１．７细胞，１８９ｕＭＥＭＳ诱发的ｘｙｌＥ基因突变超过自发突变频率达２２倍。ＥＭＳ处理细胞２４小时能引起细胞内的质粒在ｘｙｌＥ基因座位上发生缺失突变。     

人白细胞介素2重组逆转录病毒载体的构建与表达

通过RT-PCR克隆到含有全部编码序列的人IL-2 cDNA,并经核苷酸测序加以证实。将其克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建成人IL-2的重组逆转录病毒表达载体pLXSN-hIL2,体外经CRIP细胞包装后病毒滴度达7.6×10~5CFU/ml。NIH3T3小鼠成纤维细胞感染hIL-2重组逆转录病毒后,分泌IL-2水平达118.2U/ml;PCR从其基因组DNA中扩增到NeoR基因片段,提示重组逆转录病毒载体己整合至宿主细胞的基因组DNA中。本研究为开展人IL-2基因治疗奠定了基础。     

肝硬化及肝癌p53基因突变的实验研究

目的 :研究肝硬化及肝癌p53基因的突变情况。方法 :选择 80例肝硬化、肝癌标本 ,分别以PCR SSCP法 ,双链DNA序列测定法研究其p53基因外显子的突变情况及突变位点。结果 :62例肝癌标本p53总突变率为 19 4 % ,其中 ,早、中、晚期突变率分别为 10 5%、15 0 %、35 0 % ;18例肝硬化标本p53总突变率为 5 6% ;第 7外显子的突变发生在 2 4 9位密码子第 3号碱基上 ,为G :C→T :A的颠换突变 ;第 8外显子的突变发生在 2 73位密码子第 1号碱基上 ,为C :G→T :A的转换突变。结论 :p53基因突变发生在肝细胞发生形态学改变之初 ,随着肝癌的进展逐渐积累 ,突变率呈上升趋势 ,故p53基因突变很可能是启动癌变过程的重要因素之一。     

树突状细胞融合及体外致敏的瘤苗诱导抗肿瘤免疫应答

观察骨髓来源的树突状细胞在保护小鼠免受骨髓瘤攻击及对荷瘤小鼠的治疗作用.本文用mGM-CSF和L929细胞上清从BALB/c小鼠的骨髓中培养树突状细胞,将树突状细胞与小鼠NS-1骨髓瘤细胞融合(FD),并用瘤细胞制备的抗原体外冲击致敏树突状细胞(DC~ ).FD每鼠1×10~5,DC~ 每鼠2×10~5分别在第0,7天经尾静脉注射,第14天每只小鼠皮下接种NS-1骨髓瘤5×10~6,观察两种瘤苗保护小鼠免受肿瘤攻击的预防作用.FD(每鼠1×10~5)和DC~ (每鼠2×10~5)分别间隔1周治疗荷瘤7d和14d的小鼠2次,观察小     

肺癌患者吸烟量与痰液细胞p53和Ki—ras基因突变的关系

目的　了解痰液细胞癌基因突变是否与肺癌患者的吸烟量有相关性。方法　将痰液 0 .5毫升加入痰处理液制备细胞沉淀液 ,酚氯仿提取DNA ;应用SSCP PCR银染和RFLP PCR方法对痰液中p5 3、K ras突变情况进行检测。统计肺癌患者的香烟消耗量 ,分析p5 3、K ras突变与吸烟量的关系。结果　在确诊的 110例肺癌中 ,存在p5 3或K ras基因突变者有 76例 ,突变率达 69.1% ,其中 16例为p5 3和K ras基因均有突变。全组中有 71例重度吸烟者吸烟指数 (≥ 40 0支·年 ) ,71例中 5 5例有p5 3或K ras基因突变 ,突变率达 77.5 % ,显著高于非吸烟组 (P <0 .0 0 1) ;p5 3和K ras突变患者的平均吸烟指数分别达到 861和 63 0支·年 ;而未突变的平均吸烟指数为 2 84和 5 5 4支·年 ,二者之间有显著性差异 ( χ2 =3 6.5 6,P =0 .0 0 2 ,双尾检验 )。结论　痰液细胞癌基因突变检测具有简便、实用、可行的特点 ,吸烟的肺癌患者中癌基因突变率显著高于非吸烟的肺癌患者 ,提示吸烟尤其是重度吸烟可能是支气管癌基因突变的主要原因之一 ,值得临床进一步开展深入的研究。     

肝硬化及肝癌p53基因突变的实验研究

目的：研究肝硬化及肝癌p53基因的突变情况。方法：选择80例肝硬化、肝癌标本,分别以PCR－SSCP法,双链DNA序列测定法研究其p53基因外显子的突变情况及突变位点。结果：62例肝癌标本p53总突变率为19．4％,其中,早、中、晚期突变率分别为10．5％、15．0％、35．0％;18例肝硬化标本p53总突变率为5．6％;第7外显子的突变发生在249位密码子第3号碱基上,为G：C→T：A的转换突变。结论：p53基因突变发生在肝细胞发生形态学改变之初,随着肝癌的进展逐渐积累,突变率呈上升趋势,故p53基因突变很可能是启动癌变过程的重要因素之一。