小鼠OX40原核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体并进行诱导表达。方法PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a（＋），重组pET32a—OX40经测序鉴定后转入表达菌株BL21（DE3）进行融合蛋白的小量诱导表达。结果出现新增蛋白条带，融合蛋白主要存在于包涵体中；Western Blotting分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合。结论构建了小鼠OX40基因的原核表达载体，获得OX40胞外段融合蛋白。     

血小板衍化内皮细胞生长因子原核表达载体的构建

目的 构建血小板衍化内皮细胞生长因子（ＰＤ－ＥＣＧＦ）的原核表达载体。方法 设计引物扩增ＰＤ－ＥＣＧＦ的ｃＤＮＡ,然后亚克隆入原核表达载体ｐＱＥ和ｐＱＥ－３２ａ,并转化入大肠杆菌ＪＭ１０９。结果 通过菌落原位杂交、ＰＣＲ和重组质粒酶切分析等方法,筛选出重组阳性克隆。结论 此重组质粒可用于原核表达等进一步研究。dir     

抑癌基因BCSC-1原核表达载体的构建及诱导表达

目的 构建BCSC-1基因原核表达载体并进行诱导表达、纯化.方法 PCR方法从腺病毒穿梭载体pDC316-BCSC-1扩增BCSC-1基因,构建原核表达载体ET30a-BCSC-1,转化感受态E.coli BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测目的 蛋白的表达,并用超声洗涤方法进行目的 蛋白洗涤纯化.结果 成功构建原核表达载体pET30a-BCSC-1;在IPTG诱导下在E.coli BL21(DE3)中高效表达相对分子质量(Mr)为86 000的重组BCSC-1蛋白,目的 蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中,经超声洗涤纯化后,重组蛋白纯度可达85%以上.结论 利用构建的原核表达载体成功表达出BCSC-1蛋白,为进一步制备抗BCSC-1的单克隆抗体及在临床中的应用打下良好基础.     

带有蛋白标签的原核表达载体构建

目的：构建带有Ｅ－ｔａｇ蛋白标签的ｐＴＣ０１Ｅ载体。方法：从噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ中ＰＣＲ扩增出于Ｅ－ｔａｇ基因片段，经Ｋｌｅｎｏｗ片段补平和ＳａｃＩ消化后，将含有Ｅ－ｔａｇ序列的３８１ｂｐ片段克隆至分泌型原核表达载体ｐＴＣ０１的ＳａｃＩ－ＳａｍＩ位点中。结果：构建成带有Ｅ－ｔａｇ蛋白标准签的ｐＴＣ０１Ｅ载体，限制性内切酶图谱和ＤＮＡ序列分析表明构建过程正确，结论：用ＰＣＲ－克隆策略获得了Ｄ     

小鼠IL-35基因的克隆及原核表达

目的 克隆小鼠mIL-35两亚基mEBI3,mIL-12p35 cDNA,并构建mIL-35基因的原核表达载体并进行诱导表达.方法 RT-PCR方法从RAW246.7细胞中扩增mEBI3基因及脂多糖体外刺激BALB/c小鼠的脾细胞中扩增mIL-12p35基因,通过重叠PCR方法扩增出mEBI3-Linker-mIL-12p35基因,并构建原核表达载体pET-30a-mIL-35,转化感受态E.coli BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测目的蛋白的表达.结果 成功克隆了mEBI3、mIL-12p35 cDNA,通过重叠PCR方法扩增出mEBI3-Linker-mIL-12p35片段,并构建出原核表达载体pET-30a-mIL-35;在IPTG诱导下在E.coli BL21(DE3)中高效表达相对分子质量(Mr)为50 000的重组mIL-35蛋白,目的蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中.结论 利用构建的原核表达载体pET-30a-mIL-35成功表达出mIL-35蛋白,为进一步探讨mIL-35的生物学功能奠定了基础.     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因原核表达载体的构建与鉴定

目的构建人心肌肌钙蛋白I（cTnI）基因的原核表达重组体并鉴定。方法利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人cTnI的cDNA片段，设计引物将其第二和第四个密码子突变后插入原核表达载体形成重组体，并导入宿主菌BL21（DE3）中，采用双酶切及PCR方法鉴定后测序。结果经PCR扩增成功获得699bp的cTnI基因，重组体酶切分析及PCR显示结果与预想一致，测序正确。结论成功克隆了cTnI基因并构建了原核表达重组体。     

人胃蛋白酶原A基因原核表达载体构建及鉴定

目的构建人胃蛋白酶原A(Pepsinogen A)原核表达载体,用于下一步人胃蛋白酶的表达。方法以Pepsinogen A CDNA为模板,利用PCR技术扩增Pepsinogen A基因,与pMD18-T载体相连构建载体pMD18-T/Pepsinogen A,提取质粒进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切并测序鉴定,插入原核表达载体pET30a的相应位点,构建原核表达载体pET30a-Pepsinogen A,经菌落PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切分析鉴定重组质粒。结果 PCR扩增出约1 000bp的Pepsinogen A基因片段,经酶切和测序验证Pepsinogen A基因正确;克隆至表达载体后,菌落PCR及双酶切证明pET30a-Pepsinogen A原核表达载体构建成功。结论成功构建了pET30a-Pepsinogen A原核表达载体,为进一步分析研究人胃蛋白酶提供了实验基础。     

TGF—β1原核表达载体的构建

目的：克隆人TGF—β1基因,为TGF—β1的研究提供平台。方法：应用RT—PCR技术扩增人TGF—β1基因序列,将TGF-β1基因插入载体PET-28a,构建pET28a—TGF—β1重组质粒。结果：经限制性内切酶鉴定及DNA序列测定,重组质粒PET-28a—TGF—β1序列及阅读框架正确。结论：获得了TGF—β1编码序列和表达载体,能满足进一步实验的需要。     

人SMRT基因真核和原核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人SMRT基因真核和原核表达载体。方法：体外人工合成SMRT-C645bp对应的基因片段,克隆至pUC57载体,酶切,测序正确后,PCR扩增目的基因片段,酶切后亚克隆至pCMV-myc载体和pGEX-6p-1载体,并酶切和测序鉴定。结果：成功构建了人pCMV-myc-SMRT真核表达载体和pGEX-6p-1-SMRT原核表达载体。结论：成功构建了人SMRT真核和原核表达载体,为下一步蛋白间相互作用的证实提供了基础。     

抑癌基因p16原核表达载体的构建及其表达的研究

为获取具有生物学活性的ｐ１６蛋白，采用定向克隆方法将双酶切克隆质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ｐ１６得到的ｐ１６ ｃＮＤＡ片段连接到双酶切的原核表达载体ｐＢＶ２２０上，转化大肠杆菌ＴＧ１得到含重组表达质粒ｐＢＶ２２０－ｐ１６的工程菌，温度诱导表达后，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测证实含有ｐ１６蛋白。     

胰岛素前体基因克隆及其原核表达载体的构建

目的：构建胰岛素前体基因的原核表达载体。方法：以重叠PCR方法扩增获得胰岛素前体基因片段,并将片段克隆入zero pCR4 Blunt-TOPO载体内,获得胰岛素前体中间载体;随后将胰岛素前体克隆到Pet23表达载体中。结果：双酶切鉴定结果显示,成功构建了胰岛素前体基因的原核表达载体。结论：本实验成功构建了胰岛素前体基因的原核表达载体,为后续实现大规模的实验室表达和胰岛素的工业化生产奠定了坚实的基础。     

改良型TAT-VP3融合基因原核表达载体的构建及表达

目的 构建改良型TAT-VP3融合基因原核表达载体,并表达目的 蛋白.方法 采用PCR法设计和扩增改良型TAT-VP3融合基因,克隆至表达载体pThioHisA中,构建非融合表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)plyS,经IPTG诱导表达,15%SDS-PAGE鉴定.结果 成功构建了改良型TAT-VP3融合基因的原核表达载体,经酶切、测序鉴定,证明构建正确.经SDS-PAGE鉴定可见相对分子质量16400的特异性目的 条带,37℃诱导8h的蛋白表达量最高,且多数以包涵体形式存在.结论 已成功构建改良型TAT-VP3融合基因原核表达载体,并表达目的 蛋白,为进一步的蛋白制备和应用研究奠定了基础.     

人resistin基因原核表达载体构建和表达

[目的]构建人resistin基因原核表达载体并观察其表达,为开展对resistin的研究打下实验基础.[方法]酚氯仿一步法从一位2型糖尿病合并胆管癌患者腹壁皮下脂肪组织抽取总RNA,RT-PCR法扩增出re-sistin基因cDNA,经测序后,PCR产物亚克隆入T载体,用EcoRI和KpnI分别酶切重组T质粒和原核表达载体pGENKS,然后resistin基因片段和表达载体通过T4DNA连接酶进行定向连接,用核酸内切酶EcoRI、KpnI酶切和测序方法鉴定出重组表达质粒.重组表达质粒转化大肠杆菌JM109,经1 mmol/LIPTG在32℃诱导表达2 h,裂解细菌,进行PAGE凝胶电泳鉴定融合蛋白的表达.[结果]RT-PCR扩增产物分子大小为327 bp,序列分析表明为人resistin基因完整编码区.PCR产物与T载体连接、转化大肠杆菌后,从细菌质粒中酶切回收了目的片段.重组表达质粒经EcoRI和KpnI双酶切后能产生出327 bp、4 980 bp大小的两个片段,序列分析表明重组表达质粒包含人resistin基因完整编码区,基因编码无移位,PAGE凝胶电泳表明在细菌裂解上清有分子质量为39.5 kD的融合蛋白.[结论]成功构建了人resistin基因原核表达载体,且构建的载体能表达出含目的蛋白的融合蛋白,为下一步研究打下了实验基础.     

LTB-NspA融合基因原核表达载体的构建及鉴定

目的:构建融合基因LTB-NspA的原核表达载体。方法:用PCR法从淋球菌和大肠杆菌标准株分别扩增出NspA和LTB基因,用重组PCR法通过接头将LTB与NspA融合,将其插入pET-30 a中,并进行PCR、酶切和测序鉴定。结果:经PCR、酶切和测序分析,证实成功构建了LTB-NspA的原核表达载体。结论:LTB-NspA原核表达载体的成功构建,为研制淋球菌高效粘膜免疫疫苗奠定了基础。     

基因重组构建MDR基因表达载体及其表达研究

利用基因重组技术，成功地构建了ＭＤＲ Ｉ基因片断的表达载体ｐＧＥ－Ｈｍｄｒ－１，用氯化钙方法转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１，挑选２０个克隆扩增培养，经提质粒，酶切，Ａｇａｒｏｓｅ电泳检测证实：其中４个克隆含有重组质粒，选用含重组质粒载体的菌株扩增培养，经ＩＰＴＧ诱导，超声波破碎，抽提蛋白，ＧＳＨ－ａｇａｒｏｓｅ亲和层析纯化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测证实：此重组载体已表达所需的目的蛋白（ＧＳＴ－ｍｄｒ     

Construction of Prokaryotic Expression Vector of PD-ECGF

ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｖｅｖｅｃｔｏｒｏｆＰＤ ＥＣＧＦ .Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＴｈｅｃＤＮＡｏｆＰＤ ＥＣＧＦｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲｔｏｉｎｔｒｏｄｕｃｅＫｐｎⅠｓｉｔｅｔｏ 5′ｅｎｄａｎｄＨｉｎｄⅢｓｉｔｅｔｏ 3′ｅｎｄ .Ｔｈｅｎｔｈｅｙｗｅｒｅｓｕｂｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｖｅｃｔｏｒ.Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｐｉｃｋｅｄｏｕｔｂｙｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ,ＰＣＲｔｅｓｔａｎｄｒｅｓｔｒｉｃ…     

人TAT—Survivin融合蛋白原核表达载体的构建

目的：构建人TAT—Survivin融合蛋白原核表达载体。方法：以人胸腺细胞瘤cDNA为模板,采用RT--PCR扩增survivin基因成熟蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a（＋）中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果：PCR扩增的特异性片段长度为462bp,以此构建的重组质粒pET28a—TAT—survivin,经HindIII和BamHI双酶切后显示5．9kb和462bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人survivin基因cDNA（Genbank序列号）序列一致。证明人survivin已成功克隆到了原核细胞表达载体pET28a（＋）中。结论：成功构建了pET28a—TAT—survivin重组原核表达载体。