双表达B7-1、B7-2基因肿瘤疫苗治疗小鼠肝癌优于单表达疫苗的研究

目的:研究B7-1、B7-2基因对肿瘤的免疫治疗作用。方法:应用转染有B7-1、B7-2基因的肝癌细胞株H22/B7-1、H22/B7-2,建立小鼠肝癌模型,观察小鼠成瘤期、荷瘤小鼠存活期及肿瘤结节大小。结果:各实验组动物都发生肿瘤,接种H22/B7-1 H22/B7-2组成瘤率低,对照组动物肿瘤呈进行性生长;组间成瘤潜伏期不同,与对照组相比,凡接种有H22/B7-2的小鼠肿瘤形成有迟发性;接种转B7基因细胞的小鼠肿瘤生长都较对照组慢;同时接种H22/B7-1和H22/B7-的小鼠能负载大于107的肿瘤细胞。转基因细胞在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导CTLs的能力明显增强。结论:B7-1、B7-2都能增强肝癌细胞的免疫原性。B7-2在抗肿瘤早期发挥作用,B7-1随后起放大和调节作用。B7-1与B7-2联用效果优于单一应用。     

人B7-1转基因肝癌瘤苗的制备

目的:制备人B7-1(hB7-1)转基因肝癌瘤苗.方法:用逆转录病毒转移系统将hB7-1基因导入人肝癌细胞株HepG2,并用RT-PCR、PCR-Southern杂交法检测转染空载体 pLXSN的HepG2/neo细胞和转染重组质粒pLXSN/hB7-1的HepG2/hB7-l细胞中hB7-1 mRNA表达;间接免疫荧光法检测HepG2细胞、HepG2/neo细胞、HepG2/hB7-1细胞形态,计算当日细胞绝对数,绘制生长曲线.结果:所建立的肝癌瘤苗(HepG2/hB7-1)细胞可高效表达hB7-1分子.基因转染对HepG2细胞的生长形态及生长曲线无明显影响.结论:逆转录病毒基因转移系统是使肝癌细胞高效表达hB7-1分子的有效途径.     

B7-1基因修饰的肿瘤细胞瘤苗抗小鼠胃癌效应的实验研究

探讨Ｂ７－１基因修饰的肿瘤细胞作为瘤苗对小鼠胃癌的治疗效果。方法：在已建立高表达Ｂ７－１分子的小鼠前胃癌细胞系ＭＦＣ－Ｂ７的基础上,观察ＭＦＣ－Ｂ７细胞体外激活脾淋巴细胞的能力,体内成瘤性变化及作为瘤苗对荷瘤鼠胃癌的治疗效果。结论：Ｂ７－１基因修饰的肿瘤细胞免疫原性明显增强,有希望作为瘤苗用于此类肿瘤的治疗。     

重组B7-1/B7-2逆转录病毒载体的构建及其在小鼠肝癌基因治疗中的应用

目的构建表达Ｂ７－１／Ｂ７－２的重组逆转录病毒载体，并观察Ｂ７－１／Ｂ７－２的表达对体内外抗小鼠肝癌免疫反应的影响。方法粘端定向克隆构建重组逆转录病毒载体ＬＸＳＮ－ｍＢ７－１和ＬＸＳＮ－ｍＢ７－２，依次转导包装细胞系ＰＥ５０１和ＰＡ３１７，并用重组病毒上清感染小鼠肝癌细胞系Ｈｅｐａｌ－６，流式细胞术检测Ｂ７－１／Ｂ７－２的表达，并用Ｂ７－１／Ｂ７－２表达阳性的Ｈｅｐａｌ－６在体内外诱导抗肿瘤免疫反应。结果１．表达Ｂ７－１／Ｂ７－２阳性的Ｈｅｐａｌ－６致瘤性明显降低；２．单独Ｂ７－１／Ｂ７－２基因转染仅能诱导部分细胞毒性和部分保护性免疫反应；３．Ｂ７－１／Ｂ７－２基因转染与细胞因子处理联合应用则能诱导强烈的细胞毒性和完全的抗Ｈｅｐａｌ－６保护性免疫反应。结论Ｂ７－１／Ｂ７－２共刺激分子在小鼠肝癌的表达是激活抗肿瘤免疫所必需的但不是充分的条件，而Ｂ７基因转染联合ＩＦＮ－γ等细胞因子处理能诱导彻底的抗肿瘤免疫反应     

X射线对小鼠腹腔巨噬细胞表达B7-1和B7-2的影响

目的 :观察 X射线全身照射对小鼠腹腔巨噬细胞表达 B7- 1和 B7- 2的影响。方法 :采用免疫组织化学法 ( ABC法 )。结果 :小鼠腹腔巨噬细胞表达 B7- 2达到高峰的时间早于 B7- 1,而且 B7- 2表达幅度也高于 B7- 1。剂量 -效应关系的研究表明 ,B7- 1和 B7- 2的表达均在 0 .0 75Gy剂量点出现峰值 ,而在较大剂量照射时也出现一个峰值。但在不同分度分析结果中发现 ,低剂量 X射线照射组的高密度细胞百分数比较大剂量组多。结论 :B7分子的表达上调可能是参与低剂量电离辐射免疫增强效应的重要因素。     

γ射线诱导人肝癌细胞表达B7-1共刺激分子的研究

目的　研究电离辐射与肿瘤细胞B7- 1分子表达之间的关系 ,探讨肿瘤细胞辐照后免疫原性增强的机制。方法　采用间接免疫荧光 -流式细胞仪分析技术 ,研究在用不同剂量γ射线照射SMMC - 772肝癌细胞后、培养不同时间内SMMC - 772细胞B7- 1共刺激分子的表达水平。并用3H -TdR释放法测定照射和未照射肿瘤细胞与淋巴细胞共反应后的细胞毒活性。结果　未照射和经 10、2 0、30Gy照射的人肝癌细胞不表达B7- 1分子。经 40、5 0、6 0Gy剂量照射后 ,SMMC - 772肝癌细胞表达B7- 1分子 ,最高达 6 6 .8± 1.3% ,与对照组比有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。表达时间的高峰在照射后培养 72h时 ,最低在照射后培养 2 4h时 (P <0 .0 5 )。细胞毒活性测定结果表明 ,表达B7- 1分子的SMMC - 72肝癌细胞与淋巴细胞共反应后 ,细胞毒活性明显高于未照射组 (P <0 .0 1)。结论　γ射线可诱导肝癌细胞表达B7- 1分子 ,从而增强肿瘤细胞的免疫性     

抗B7-1功能性单克隆抗体对B淋巴瘤细胞生长的抑制作用

目的　分析抗B7- 1功能性单克隆抗体对表达B7分子的人恶性淋巴瘤细胞株Raji和Daudi细胞体外生长的抑制作用及其可能机制。方法　采用免疫荧光标记和流式细胞仪分析肿瘤细胞的B7- 1分子表达 ;以不同浓度抗B7- 1功能性单克隆抗体 ,加入体外培养细胞中 ,经细胞计数和MTT法 ,观察单克隆抗体对肿瘤细胞体外生长的作用。结果　Raji和Daudi细胞均表达B7- 1分子 ,表达阳性百分率分别为 92 .7%和 89.2 % ;抗B7- 1单克隆抗体浓度在 5 μg/ml时就对这两种细胞株有显著的抑制作用 ,并随浓度增高而增强。 结论　抗B7- 1单克隆抗体对高表达B7- 1分子的人恶性淋巴瘤细胞体外生长有明显的抑制作用 ,这种抑制作用是通过诱导肿瘤细胞的凋亡所致     

B7-H1慢病毒的制备及其在B16F10细胞中的表达鉴定

目的 构建小鼠B7-H1分子慢病毒表达载体并包装成感染性病毒颗粒,获得稳定表达B7-H1的B16F10细胞.方法 以小鼠B7-H1的测序质粒为模板,PCR扩增B7-H1全长,装入pLenti6/V5-D-TOPO慢病毒表达载体,经过测序证实其序列与标准序列完全一致.将B7-H1表达载体用LipofectamineTM2000转染293FT细胞,包装成感染性病毒颗粒,感染B16F10细胞后,加入含Blasticidin(终浓度为4.0 μg/ml)的RPMI1640培养基,筛选出稳定表达B7-H1蛋白的B16F10细胞株.结果 PCR扩增得到编码小鼠B7-H1的877 bp基因片段,与预期大小一致.B7-H1重组慢病毒感染B16F10细胞后,用B7-H1单抗进行免疫组化检测,荧光显微镜观察显示B7-H1分子表达于B16F10细胞.FACS测定B16F10细胞荧光阳性率为36%.结论 成功构建了B7-H1慢病毒表达载体,包装出感染性病毒颗粒,重组慢病毒感染B16F10细胞后表达出有活性的B7-H1膜表面蛋白,为进一步研究B7-H1分子在器官移植、自身免疫性疾病以及肿瘤免疫逃逸机制中的作用奠定了基础.     

共刺激分子B7-2对小鼠肝癌治疗作用的实验研究

目的 :应用转染有小鼠B7- 2基因片段的肝癌细胞 ,建立小鼠肝癌模型 ,观察小鼠肿瘤生长和消退情况 ,研究共刺激分子B7- 2对肿瘤的免疫治疗作用。方法 :建立BALB/c小鼠转B7- 2基因肝癌细胞株H2 2 /B7- 2 ,细胞计数法测定肿瘤细胞体外增殖能力 ;BALB/c鼠皮下接种H2 2 /B7- 2及野生型H2 2细胞H2 2 /Wt,以空载体转染细胞H2 2 /neo为对照 ,建立小鼠肝癌模型 ,观察小鼠成瘤期、荷瘤小鼠存活期及肿瘤结节大小 ;同源淋巴细胞肿瘤细胞混合培养 (MTLCs)后测定淋巴细胞增殖指数和CTLs活性 ,同时测定培养上清IL -2、IFNγ ,研究B7- 2分子的抗肿瘤免疫效果。结果 :细胞在体外增殖能力一致 (P =0 .782 ) ;当接种不同肿瘤细胞后 ,三组动物都发生肿瘤 ,接种H2 2 /B7- 2组肿瘤形成有迟发性 ,并在接种 18d后肿瘤都开始缩小 ,但最终不会完全消失 ;接种H2 2 /Wt和H2 2 /neo组动物肿瘤呈进行性生长。H2 2 /B7- 2在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导CTLs的能力明显强于对照细胞 (P <0 .0 5 )。结论 :共刺激分子B7- 2能增强肝癌细胞的免疫原性 ,它在抗肿瘤早期发挥作用。用其治疗肝癌是有效的 ,但不能介导完全和长期的抗肿瘤效应。     

小鼠B7-1和B7-2基因转染EL4细胞瘤苗抗肿瘤免疫作用的比较研究

目的：研究冠状动脉分流（CABG）术后冠状动脉竞争血流对左乳房内动脉（LIMA）桥血流中内皮素（ET）、一氧化氮（NO）含量的影响，探讨动脉桥血管早期衰坏的分子机制。方法：建立猪CABG术后桥血管竞争血流动物模型，利用血流闭塞器造成冠状动脉不同程度狭窄，测量桥血管血流量及方向变化，并采用放射免疫分析法及硝酸还原酶法分别检测LIMA桥血流中ET、NO含量并进行对比分析。结果：冠状动脉左前降支（LAD）近端狭窄程度越轻，LIMA桥血流量越少；LAD近端未完全闭塞时，LIMA桥均出现双向血流。CABG术后LIMA桥血流ET含量明显高于移植前(P＜0.05)，NO含量明显低于移植前(P＜0.05)。LAD近端冠脉竞争血流越大，LIMA桥血流NO含量越低。LIMA桥血流NO含量与LIMA桥血流量呈正相关（r=0.957,P＜0.05）。LAD近端30％狭窄时，NO含量明显低于LAD近端90％狭窄及全部闭塞时(P＜0.05)，LAD近端50％狭窄时，NO含量明显低于LAD近端全部闭塞时(P＜0.05)。LIMA桥血流ET含量有随LAD近端冠脉竞争血流增加而升高的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：来自未完全闭塞冠状动脉的竞争血流可引起LIMA桥血流量下降，产生双向血流，并导致桥血流中NO含量显著下降。     

狼疮性肾炎外周血单个核细胞B7-1和B7-2 mRNA表达异常及其与疾病活动的关系

目的观察活动期和静止期狼疮肾炎(LN)外周血单个核细胞(PBMC)B7-1(CD80)和B7-2(CD86)mRNA表达及其与疾病活动的关系,以探讨B7-1和B7-2mRNA表达异常在LN自身免疫发生中的作用及临床意义.方法以正常人为对照,分离15例活动期和13例静止期的LN患者PBMC,采用半定量反转录PCR的方法,检测PB-MC的B7-1和B7-2mRNA表达.B7-1和B7-2mRNA表达与SLE疾病活动评分指数(SLEDAI)的相关关系用直线相关分析.结果静止期LN组B7-1和B7-2mRNA表达与正常人对照组相比无显著性差异(P＞0.05),活动期LN组B7-1mRNA有明显的上升(P＜0.05),B7-2mRNA表达增高更加显著(P＜0.01).B7-2mRNA的增高与SLEDAI呈直线正相关关系(r＝0.8641,P＜0.05).结论活动期狼疮性肾炎存在着B7mRNA表达的异常,B7-2mRNA的增高与SLEDAI呈直线正相关关系.     

B7-1基因转染对小鼠前胃癌细胞增殖活性的影响

目的 观察B7—1基因转染对小鼠前胃癌细胞(MFC)增殖活性的影响。方法 通过脂质体介导将B7—1基因转染MFC细胞，G418筛选阳性克隆后，用MTT法和流式细胞仪(FCM)分别测定转染然细胞增殖活性的变化，并以空载体pcDNA3转染MFC细胞作为对照。结果 转染B7—1基因的MFC细胞增殖活性受到抑制。结论 转染B7—1基因的MFC细胞增殖活性受到抑制，提示B7—1基因对MFC有免疫调节作用。     

Induction of anti-hepatoma immunity by recombinant retrovirus expressing B7-1 /B7-2 costimulatory molecules

The effechve activation of ttllnor-specific T cellsPlays a pivotal mle in anti-tUInor inUnwhty. As we haVeknown, T cell elevation ~ires 2 distinct signalingevents. The fial signal is derived from the binding of Tcell receptor (TCR) tO itS antigen-MHC complex, whichspeCified foe inteedon between T cells and talget cells.The seCOnd signal is delivend by accessory or costilnulatory moleCules such as CD28, LFA-l, ICAM-l, and so.Llj. The moSt ~rtant among them is CD28, whichhas been d…     

吸烟对大鼠肺组织B7-1/B7-2及其相关配体表达的影响

目的 通过研究吸烟对大鼠肺组织B7-1/B7-2及其相关配体表达的影响,探讨专职抗原提呈细胞(APC)在吸烟所致肺部慢性炎症发生发展中的作用.方法 将30只健康雄性Wistar大鼠随机分为不吸烟组、吸烟6周组和吸烟12周组,每组10只.采用免疫组化半定量法测定大鼠气道周围肺间质中慢性炎症细胞胞膜B7-1B7-2、CD28和CTLA-4的表达水平.结果 吸烟6周组与吸烟12周组大鼠肺组织B7-1、B7-2、CD28和CTLA-4表达量较不吸烟组均显著增高(P＜0.01),吸烟12周组较吸烟6周组表达量也均增高(P＜0.01),随吸烟时间的延长各指标表达量均呈上升趋势.结论 吸烟可引起大鼠肺组织B7/CD28/CTLA-4表达水平的增高,提示APC可能在吸烟所致肺部慢性炎症发生发展中起重要作用.     

B7-1基因转染抑制胃癌生长和转移的实验研究

目的:研究B7-1基因转染胃癌细胞对人胃癌生长和转移的影响.方法:将重组质粒B7-1pcDNA3.1(+)和空载体pcDNA3.1(+)分别转染SGC-7901细胞(简称S),用G418筛选分别建立稳定转染细胞株SGC-7901/B7-1pcDNA3.1(+)(简称S-B)和SGC-7901/pcDNA3.1(+)(简称S-P).RT-PCR和流式细胞术分别从mRNA和蛋白水平检测B7-1基因表达,检测细胞周期分布,计算细胞增殖指数.分离人外周血单个核细胞(PBMC),分别与S-B、S-P、S共培养,检测PBMC黏附力和杀伤力,检测胃癌细胞凋亡情况.将S-B、S-P、S分别接种于BALB/c裸鼠胃大弯侧,观察B7-1基因转染对胃癌生长及淋巴转移的影响.结果:S-B高表达B7-1基因,S-P和S不表达B7-1基因.S-B、S-P、S增殖指数无显著差异.S-B与PBMC黏附力和杀伤力均明显高于S-P和S,而S-P与s无显著差异.种植S-B小鼠成瘤率和转移率均低于S-P和S,HE染色见淋巴细胞广泛浸润于S-B种植形成肿瘤组织及转移淋巴结.结论:B7-1基因提高胃癌细胞免疫原性抑制胃癌生长和淋巴转移.     

人B7-1 cDNA的克隆及鉴定

目的:克隆人B7-1全长cDNA以构建相应腺病毒表达载体。方法:根据B7-1基因序列设计并合成可扩增B7-1 cDNA的特异性引物,用RT-PCR法从骨髓细胞总RNA中扩增B7-1 cDNA,并克隆至pGEM-T载体中,经酶切鉴定后再行序列分析。结果:逆转录多聚酶链反应扩增产物长度与预期的889 bp一致;用M13正、反向引物行序列测定,证实克隆出的序列与GenBank的B7-1 cDNA序列完全一致;人B7-1全长cDNA被成功地插入到质粒pGEM-T中。结论:克隆人B7-1全长cDNA为构建相应腺病毒表达载体及应用B7-1行肿瘤免疫基因治疗提供了可能性。