脂质体介导的IDO基因转染未成熟树突状细胞对其成熟性及功能的影响

目的:探讨脂质体介导的IDO基因转染对未成熟树突状细胞(Immature dendritic cells,imDCs)的成熟性及功能的影响。方法:从BALB/c小鼠骨髓培养imDCs,形态学观察后用流式细胞术鉴定imDC后,将其分为IDO+-imDC组:重组pEGFP-N1-IDO质粒在脂质体介导下转染imDCs;IDO--imDC组:pEGFP-N1空质粒转染imDCs;imDCs组:imDCs不做特殊处理;mDC组:将培养的imDC用TNF-α诱导成熟。流式细胞术检测IDO基因转染imDC细胞后细胞表型是否发生变化。Western blot检测各组IDO蛋白表达。混合淋巴细胞反应检测各组在体外刺激T淋巴细胞增殖的能力。结果:BALB/c小鼠骨髓培养的细胞表面标志和细胞形态符合imDCs典型特征;Western blot结果显示IDO+-imDC组可见IDO蛋白表达;IDO+-imDC组细胞表面分子CD80、CD86、MHCⅡ表达率分别为(9.4±2.2)%、(8.7±1.1)%、(11.4±2.6)%,imDC组分别为(8.5±1.8)%、(7.5±1.6)%、(10.2±2.1)%,两组比较无显著差异(P均0.05),IDO+-imDC组在体外刺激T淋巴细胞增殖的能力明显低于imDC组(678±90.3vs1199±275.5,P0.01)。结论:脂质体介导的IDO基因转染imDCs能维持细胞于未成熟状态,在MLR中,对T细胞增殖有明显的抑制作用。     

肾癌细胞冻融抗原负载树突状细胞瘤苗的活化

目的: 探索体外诱导DCs活化的方法和制备肾癌树突状细胞(DCs)瘤苗。方法: 制备肾癌细胞冻融抗原；取健康人新鲜血分离外周血单个核细胞(PBMC),应用GM-CSF+IL-4刺激，诱导PBMC为iDCs,然后进行分组，采用不同因子刺激iDCs转化为mDCs,其中Ａ组:冻融抗原负载；Ｂ组: TNF-α+冻融抗原负载；Ｃ组: IL-1β+冻融抗原负载；Ｄ组: TNF-α+IL-1β+冻融抗原负载。 结果:各组均可诱导iDCs的成熟,并高表达CD86、CD80和HLA-DR；相对于其它组，D组DCs 更显著上调CD83和CD54表达(P<0.05)和IL-12分泌(P<0.01)，且D组mDCs更有效地刺激淋巴细胞增殖(P<0.05)。 结论: TNF-α+IL-1β与肾癌细胞冻融抗原协同可有效促进DCs成熟、增强诱导淋巴细胞活化的能力。     

IL-27促进外周血单个核细胞来源树突状细胞分化成熟

目的:研究IL-27体外对人外周血单个核细胞(PBMC)的来源树突状细胞(DC)分化、成熟及其免疫活性的影响。方法:采集健康成人外周血,密度梯度离心法获得PB-MC,给予GM-CSF、IL-4诱导DC,第5天后根据不同处理因素将DC分为3组:IL-27组、TNF-α组和阴性对照组。倒置显微镜和透射电镜下观察DC形态;流式细胞术(FCM)检测DC表面分子CD1a、CD80、CD83和CD86的表达情况;MTT法检测DC刺激T细胞增殖的能力。结果:IL-27刺激后PB-MC来源DC呈现典型的成熟DC形态学特征。IL-27组DC表面CD1a、CD80、CD83和CD86表达水平较对阴性对照组均明显上调(P<0.05),与TNF-α组DC相比无显著差异。IL-27组DC诱导T细胞增殖的能力较对照组DC明显增高(P<0.05)。结论:IL-27可刺激PBMC来源DC的成熟。     

自体肿瘤抗原致敏的树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞治疗晚期肾癌的疗效观察

目的探讨负载自体肿瘤抗原的树突状细胞(DC)联合细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)在晚期肾癌治疗中的临床疗效,并监测患者的免疫状态及不良反应。方法回顾分析2011-01/2013-12期间在我科治疗的82例晚期肾癌患者,单采其外周血单个核细胞(PBMC),其中贴壁细胞经体外诱导产生DC,并负载自体肿瘤细胞裂解物(Ag)制备Ag-DC;T淋巴细胞经体外诱导产生CIK细胞,将Ag-DC与CIK细胞共培养制备Ag-DC-CIK瘤苗,检测DC表面分子的表达及IL-12的分泌,监测CIK细胞增殖情况,并将Ag-DC-CIK分次回输给其中41名患者,以41例单纯的CIK细胞治疗作为对照,治疗2疗程后,检测患者外周血细胞因子水平及T细胞亚群变化,结合影像学等检查综合评价疗效,同时观察不良反应。结果负载肿瘤细胞冻融抗原的DC,高表达CD11c、CD83、CD86、HLA-DR表面分子,IL-12的分泌显著增加。Ag-DC与CIK细胞共培养后,可明显刺激CIK细胞的增殖,同时CD3+CD8+细胞及CD3+CD56+细胞的含量明显增加,此外,Ag-DC-CIK瘤苗的临床疗效明显高于单纯CIK细胞治疗组,2组均未发生严重的不良反应。结论晚期肾癌PBMC来源的DC负载自身肿瘤细胞冻融抗原能提高晚期肾癌患者的免疫状态。     

肝癌细胞冻融抗原负载树突状细胞瘤苗的制备与活化

目的: 探讨制备肝癌树突状细胞(DCs)瘤苗和体外诱导DCs活化的优化方法。方法: 取健康人新鲜血50mL, Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC), 制备肝癌细胞冻融抗原, 采用不同因子组合培养PBMC, 诱导和激活DCs, A组: rhGM-CSF+IL-4; B组: rhGM-CSF+IL-4+冻融抗原负载;C组:rhGM-CSF+IL-4+TNF-α; D组: rhGM-CSF+IL-4+TNF-α+冻融抗原负载。结果: 各组均诱导出DCs, 并高表达CD11c和CD54, 冻融抗原可明显上调CD86、CD80、HLA-DR表达和IL-12 p40分泌(P<0.01), TNF-α促进CD86表达的作用更显著, 但对IL-12分泌无影响, 依次用TNF-α诱导和冻融抗原负载可进一步促进CD86表达和IL12 p40分泌(P<0.05)。CD54和HLA-DR双标记免疫细胞化学染色显示, 各组DCs大多为CD54⁺。表达HLA-DR的DCs均为CD54⁺HLA-DR⁺, 其中, A组CD54⁺HLA-DR⁺细胞数量最少, D组最多, 平均每个细胞HLA-DR的表达水平也与此对应。结论: 采用rhGM-CSF、IL-4诱导的未成熟DCs, 依次使用TNF-α刺激与肝癌细胞冻融抗原修饰可有效促进DCs的活化与成熟。     

EBV-LMP2A重组腺病毒体外转染树突状细胞激发特异性CTL的研究

目的：用EBV潜伏膜蛋白2A(EBV-LMP2A)重组腺病毒转染树突状细胞(DC)激发特异性细胞毒性T细胞(CTL)，分析CTL的特性。方法：用AdS-LaMP2A重组腺病毒转染EBV健康携带者及鼻咽癌患者的DC，与自体来源的外周血单个核细胞(PBMC)混合培养，激发LMP2A特异性CIL。用LDH释放法检测CIL杀伤活性；流式细胞术(FACS)检测培养细胞群体中CD3^ 、CD4^ 、CD8^ 、CD56^ 细胞的组成；生物活性法检测细胞培养上清中IFN-γ含量；RT-PCR分析CTL的FasL mRNA表达。结果：EBV健康携带者及鼻咽癌患者的PBMC，经AdS-LMP2A转染的自体DC两次刺激后，都能诱导出显著的EBV-LMP2A特异的CIL。EBV健康携带者CTL的杀伤活性，随DC刺激次数的增加而逐渐增强，诱导的CTL细胞群体以CD^4 和CD8^ 细胞组成为主，且CD4^ 细胞比例高于CD8^ 细胞，另含少量CD56^ 细胞；在不同时段所诱导的CTL上清中，均含一定量的IFN-γ并随刺激次数和诱导时间的延长呈上升趋势；RT-PCR研究表明，所诱导的CTL有FasL mRNA的表达。结论：以腺病毒载体介导EBV-LMP2A基因转染的成熟DC，在体外能激发较强的LMP2A特异的功能性CTL，可用于EBV相关NPC的免疫治疗。     

Foxp3逆转录病毒载体的构建及其诱导的CD4~+CD25~+Foxp3~+ T细胞免疫抑制功能研究

Foxp3基因的表达与CD4+CD25+免疫调节细胞的功能密切相关。为在体外诱导具有免疫调节功能的CD4+CD25+免疫调节细胞,本文构建了带有绿色荧光蛋白(eGFP)的pMSCV-MIGR-Foxp3逆转录病毒载体及研究体外转染获得的人CD4+CD25+Foxp3+T细胞的免疫抑制功能。扩增人Foxp3编码基因,插入pMSCV-MIGR逆转录病毒载体,构建Foxp3逆转录病毒真核表达载体。磷酸钙沉淀法转染Pheonix E包装细胞。包装病毒再感染PT67细胞,获得永久产毒的PT67细胞。病毒上清感染免疫磁珠分离健康体检者PBMC中CD4+CD25-细胞,诱导CD4+CD25+Foxp3+T细胞,3H-thymidine掺入法测定其对CD4+CD25-细胞增殖的免疫抑制作用。结果显示,带有绿色荧光蛋白的pMSCV-MIGR-Foxp3逆转录病毒可以感染CD4+CD25-T细胞,使其表达Foxp3。CD4+CD25-细胞体外增殖可以被转染诱导的CD4+CD25+Foxp3+T细胞所抑制,提示转染诱导的CD4+CD25+Foxp3+T细胞具有免疫抑制功能,为进一步研究体外诱导CD4+CD25-Foxp3+调节性T细胞功能奠定基础。     

Foxp3转染对哮喘小鼠脾淋巴细胞功能的影响

目的: 转染Foxp3至哮喘小鼠脾淋巴细胞,探讨Foxp3表达对脾淋巴细胞功能的影响。方法: 卵白蛋白(OVA)致敏激发制作哮喘小鼠模型,收集培养脾脏淋巴细胞;使用电穿孔法转染真核表达载体pcDNA3.1(-)-Foxp3至脾脏淋巴细胞,并设转染空质粒组和对照组;RT-PCR和Western blotting检测Foxp3的表达;流式细胞术检测转染后CD4⁺CD25⁺ Treg细胞/CD4⁺细胞比例;MTT法检测转染后的脾脏淋巴细胞增殖反应,ELISA检测脾淋巴细胞上清中白细胞介素4(IL-4)和干扰素γ(IFN-γ)的含量。结果: 转染组Foxp3 mRNA 和蛋白的表达水平显著高于空质粒组和对照组;转染Foxp3后CD4⁺CD25⁺ Treg细胞/CD4⁺细胞比例显著高于空质粒组和对照组;与空质粒组和对照组相比,转染pcDNA3.1(-)-Foxp3质粒明显抑制了脾淋巴细胞增殖;转染组细胞上清中IL-4和IFN-γ含量低于空质粒组和对照组。结论: 转染pcDNA3.1(-)-Foxp3至哮喘小鼠脾淋巴细胞,Foxp3得到有效表达。Foxp3的高表达能增加CD4⁺CD25⁺ T细胞的数量,抑制哮喘小鼠脾淋巴细胞的增殖以及Th1和Th2细胞因子的产生。     

慢病毒介导RNA抑制黑素瘤细胞Foxp3蛋白表达

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术在体外干扰小鼠B16黑素瘤细胞Foxp3基因表达,探讨RNA干扰用于黑素瘤治疗的可行性。方法:针对Foxp3基因设计小干扰RNA(siR-NA),构建起短发夹状RNA(shRNA)慢病毒表达载体,并转染小鼠B16细胞,在体外诱导RNA干扰。分别采用Westernblot和RT-PCR检测Foxp3基因的表达情况;ELISA检测TGF-β1、TGF-β2和IL-10等细胞因子的变化;将干扰后的小鼠B16细胞与CD4+CD25-T淋巴细胞共培养,CCK8法检测CD4+CD25-T淋巴细胞增殖能力。结果:通过Foxp3 shRNA的转染,可实现对B16细胞Foxp3表达的沉默,可下调肿瘤细胞对CD4+CD25-T淋巴细胞增殖抑制的能力,并且下调TGF-β1、TGF-β2和IL-10等细胞因子的表达,尤其是TGF-β2的表达。结论:RNA干扰可抑制小鼠黑素瘤细胞靶基因Foxp3的表达及细胞增殖,并对CD4+CD25-T淋巴细胞增殖抑制的能力减弱,同时减弱抑制性细胞因子的分泌,为黑素瘤的基因治疗提供了新思路。     

不同IL-15基因转染对NCI-H446细胞诱导PBMC增殖和杀伤肿瘤细胞的影响

目的 研究不同IL-15基因转染对NCI-H446细胞诱导外周血单个核细胞(PBMC)增殖和杀伤肿瘤细胞的影响.方法 野生型NCI-H446细胞(Cw)和被3种IL-15基因分别转染的3种NCI-H446细胞(Cmp:被IL-15成熟肽基因转染;Cp:被原型IL-15基因转染;Csp:被信号肽换为IL-2信号肽的改型IL-15基因转染),用丝裂霉素(M)处理后(分别名为MCw、MCmp、MCp和MCsp)作为刺激细胞刺激健康志愿者的PBMC.对这些被刺激的PBMC,分别名为MCw-PBMC、MCmp-PBMC、MCp-PBMC和MC-sp-PBMC.台盼蓝拒染法计数细胞数,流式细胞术测定CD4 细胞和CD8 细胞百分率.在MCmp-PBMC,MCp-PBMC和MCsp-PBMC中,选择其细胞数和CD4 细胞和/或CD8 细胞百分率统计学上明显高于MCw-PBMC的作为效应细胞,MTT法测定它们对Cw的杀伤.结果 与MCw-PBMC相比,MCp-PBMC在细胞数、CD4 细胞和CD8 细胞百分率及对Cw的杀伤上,均显著提高(P＜0.05).结论 原型IL-15基因转染能提高NCI-H446细胞诱导PBMC增殖和杀伤野生型NCI-H446细胞的能力.     

肝血窦壁细胞的研究进展

肝窦壁细胞是肝脏的非实质细胞 ,对于肝脏的生理和病理都具有非常重要的作用。本文就肝窦壁细胞的形态、功能及其与肝脏的病理生理的关系进行了简要的概述 ,并就肝窦壁细胞的研究进展作一综述 ,以期为这方面的研究提供一些线索     

T cells as antigen-presenting cells

Human T cells express major histocompatability complex (MHC) class II antigens and adhesion molecules characteristics of antigen-presenting cells (APCs), and recent in vitro and in vivo evidence supports and antigen-presenting function for T cells. In this guise, T cells provide downregulatory signals for the immune response by inducing anergy in T cells that have already been activated and cytotoxicity in resting T cells. Here, Werner Pichler and Tony Wyss-Coray suggest that this may represent an important negative mechanism for T-cell homeostasis.     

Antigen-presenting cells for unprimed T cells

The triggering requirements of T cells differ for primed and unprimed cells: primed T cells can be triggered to produce lymphokines without viable antigen-presenting cells (APCs), apparently by crosslinking the T-cell receptor (TCR). Unprimed T cells do, however, require viable APCs and here Jonathan Sprent and Mary Schaefer review what type of cells can carry out this function, with particular reference to APCs for unprimed CD8+ cells.     

T cells,dendritic cells and epithelial cells in intestinal homeostasis

The mucosal immune system of the intestinal tract is continuously exposed to both potential pathogens and beneficial commensal microorganism. A variety of mechanisms contribute to the ability of the gut to either react or remain tolerant to antigen present in the intestinal lumen. Antigens of the gut commensals are not simply ignored, but rather trigger an active immunosuppressive process, which prevents the outcome of immunopathology. The aim of this review is to provide an update on the mechanism of intestinal homeostasis, with particular focus on the complex crosstalk between T cells, dendritic cells and intestinal epithelial cells.     

抗原致敏DC与CIK共培养体外抗肾癌效应的研究

目的： 探讨肾癌(RCC)抗原致敏树突状细胞(DC)与同源细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)共培养后的DC-CIK细胞对RCC的杀伤活性。 方法： 将健康成人外周血单个核细胞（PBMC）来源的DC经RCC(786-0细胞株)抗原致敏后与同源CIK细胞共培养，实验分3组：RCC抗原致敏DC与CIK共培养组（A组），未致敏DC与CIK共培养组（B组），单纯CIK组（C组）。流式细胞仪检测DC及CIK免疫表型。MTT法检测3组效应细胞对786-0细胞杀伤活性。 结果： 效靶比 20∶1 时，A、B、C组对786-0细胞杀伤活性分别为（70.64±8.26）%、（53.40±7.33）%、（46.64±6.01）%，各组比较差异显著（P<0.05）；以前列腺癌PC3细胞作靶细胞对照，A组对786-0及PC3细胞的杀伤活性有显著差异（P<0.05）。 结论： RCC抗原致敏DC与CIK共培养后的DC-CIK细胞可明显提高CIK细胞对RCC的杀伤特异性和杀伤活性。     

干细胞：许旺细胞的新来源****△

背景：许旺细胞对神经系统损伤的修复与再生有着重要作用。然而,许旺细胞不易直接获取,使其在临床上的应用受到限制。 目的：综述神经损伤及修复过程、许旺细胞的作用以及各种干细胞分化为许旺细胞的潜能。 方法：使用计算机检索Pubmed数据库2000/2011有关许旺细胞参与神经损伤的修复、干细胞分化为许旺细胞验证及应用的文献,检索词为“Schwann cells,nervous system,stem cells”。排除重复性研究,对资料进行初审,并查看每篇文献及其引文。根据纳入标准,收集到29篇相关文献。 结果与结论：许旺细胞通过分泌各种细胞因子和营养因子为受损的神经营造了适于修复与再生的微环境,从而促进轴突再生;同时通过增殖及分化等机制围绕新生轴突形成髓鞘。神经修复需要大量许旺细胞的参与,而许旺细胞不易直接获取。研究表明,各种干细胞,包括胚胎干细胞、间充质干细胞、神经嵴干细胞和嗅鞘细胞,能在一定诱导条件下分化为许旺细胞样细胞,为神经系统损伤的治疗带来了新的希望。其中,间充质干细胞的研究备受关注。 关键词：许旺细胞;神经系统;再生;修复;干细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.040