人PCK1基因克隆及其表达载体的构建

目的 构建人PCK1基因的真核表达载体.方法 以人内脏脂肪细胞cDNA为模板, 聚合酶链反应(PCR)扩增PCK1基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,并进行双酶切鉴定.结果 PCR扩增的特异性片段长度为1 972 bp,以此构建的pGEM-T-PCK1克隆载体,经限制性内切酶酶切证实载体中带有PCK1基因的目的片段,与GenBank中的人PCK1基因cDNA序列一致.重组质粒pcDNA3.1-PCK1经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切后显示5.1 kb和 2 000 bp左右的2个条带,证明PCK1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1(+) 中.结论 成功构建了野生型pcDNA3.1-PCK1重组真核表达载体.     

人PCK1基因克隆及其表达载体的构建

目的构建人PCK1基因的真核表达载体。方法以人内脏脂肪细胞cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增PCK1基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1( )中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为1 972 bp,以此构建的pGEM-T-PCK1克隆载体,经限制性内切酶酶切证实载体中带有PCK1基因的目的片段,与GenBank中的人PCK1基因cDNA序列一致。重组质粒pcDNA3.1-PCK1经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切后显示5.1 kb和2 000 bp左右的2个条带,证明PCK1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1( )中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-PCK1重组真核表达载体。     

应用AdEasy-1腺病毒系统构建含人nm23-H1基因的重组腺病毒质粒

目的应用AdEasy-1腺病毒载体系统制备含人nm23-H1基因的重组腺病毒载体。方法设计带有限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切位点的引物,利用PCR法从质粒pMD18-T-nm23-H1上克隆出nm23-H1 cDNA并定向连接至穿梭载体pShuttle-CMV上,行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定和测序。将pAdEasy-1腺病毒骨架载体电转化B J5183感受态细菌,Pm eⅠ酶线性化并去磷酸化处理重组质粒pShuttle-CMV-nm23-H1,并电转化含pAdEasy-1的B J5183感受态细菌,利用卡那霉素筛选,PacⅠ酶切鉴定,重组腺病毒质粒在XLGold-10感受态细菌中大量扩增,产物行PCR鉴定。结果经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切pShuttle-CMV-nm23质粒得到460bp的片段,该片段经测序与nm23-H1基因序列一致,重组腺病毒质粒pAdEasy-nm23-H1经PacⅠ酶切后可以得到3.0kb和4.5kb的片段,大量扩增重组腺病毒质粒后行PCR仍然得到460bp的片段。结论利用AdEasy-1腺病毒系统成功构建含人nm23-H1基因重组腺病毒质粒。     

重组Sox5蛋白cDNA克隆与真核表达载体的构建

目的 克隆人类睾丸组织特异的Sox5基因全长cDNA，构建重组Sox5真核表达载体pcDNA3-Sox5。方法 从成人睾丸组织提取总mRNA，采用RT-PCR技术扩增SoxScDNA片段，并将扩增的cDNA片段插入pcDNA3真核表达质粒，双酶切及测序鉴定重组质粒。结果 经RT-PCR获得1．1kb的产物，连接重组后经双酶切筛选阳性克隆，DNA测序验证，确定成功筛选出真核表达载体pcDNA3Sox5。结论 成功构建人Sox5基因全长cDNA真核表达载体，为进一步探索精细胞特异表达的Sox5转录因子是否参与ZNF30的转录调控打下了基础。     

1pcDNA3.1-Ercc6l真核表达载体的构建及在P19细胞内的表达

目的构建Ercc6l的正、反义真核表达载体,并在P19胚胎癌细胞内瞬时表达,在细胞学水平对基因功能进行初步研究。方法KpnⅠ/XhoⅠ双酶切pGEM-T-Ercc6l获得目的基因Ercc6l,将其克隆到同样经过双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(-)Myc His6,重组质粒pcDNA3.1(+/-)-Ercc6l经菌落PCR和双酶切鉴定;脂质体介导法体外瞬时转染正义载体至P19细胞,RT-PCR检测基因在细胞内的表达活性情况。结果重组质粒经菌落PCR和KpnⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定,表明真核表达载体构建正确;脂质体介导法瞬时转染正义载体至P19细胞后,检测表明转染细胞能够表达Ercc6l。结论成功构建了Ercc6l正、反义真核表达载体,其正义载体转染真核细胞后能在其中表达。     

FHIT基因真核细胞表达载体的构建与鉴定

目的构建人FHIT基因真核细胞表达载体.方法采用RT-PCR方法,从人新鲜甲状腺组织的总cDNA中扩增出456 bp的人FHITcDNA片段,然后用KpnⅠ和 BstX Ⅰ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用免疫细胞化学法检测FHIT基因的表达情况.结果人FHIT基因cDNA已经正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中;体外转染MM96L细胞后,可见转染细胞胞浆中有较高量的Fhit蛋白表达.结论本实验所构建的重组质粒为FHIT基因在肿瘤发病机制与防治的研究中提供了有利的分子工具.     

外源性PTEN基因转染对炎性乳腺癌MDA-MB-468细胞株体外生物学行为的影响

目的 研究外源性PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10）基因表达对炎性乳腺癌MDA-MB-468细胞株体外生物学行为的影响。方法 应用基因重组技术构建并鉴定pcDNA3．1-PTEN真核表达质粒，重组质粒被BglⅡ酶切线性化后运用脂质体介导基因转染法，将外源性PTEN基因导人乳腺癌细胞系MDA-MB-468中，经G418筛选阳性克隆，空载体pcDNA3．1（-）转染人细胞作为对照，逆转录-聚合酶链反应（RTPCR）、免疫印迹法（Western blot）分析目的基因及蛋白表达，膜联蛋白V-FITC（FITC-Annexin V）和碘化丙啶（PI）双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果 重组真核表达质粒pcDNA3．1-PTEN经限制性内切酶XbaⅠ和BamHⅠ双酶切，电泳后显示约1．4kb的PTEN目的片段和5．4kb的pcDNA3．1（-）载体片段，证明重组质粒连接正确。RT-PCR、Western blot均显示pcDNA3．1-PTEN转染组有PTEN mRNA及其蛋白表达，流式细胞分析显示恢复PTEN蛋白表达后其凋亡率较其它两组细胞凋亡率增高（均P〈0．01）。结论 成功地构建了pcDNA3．1-PTEN真核表达质粒，外源性PTEN基因可通过诱导细胞凋亡而抑制乳腺癌细胞的增殖。     

t-PA基因克隆及pcDNA3.1t-PA真核表达质粒的构建

目的利用基因工程技术克隆组织纤溶酶原激活物(t-PA)基因并构建一种无细胞毒性、不激活原癌基因的真核表达的pcDNA3.1t-PA质粒载体.方法采用高效Trizol试剂快速从人肺组织中提取RNA,RT-PCR获得t-PA cDNA,扩增、纯化、回收t-PA基因片段并将质粒pcDNA3.1和t-PA基因片段分别双酶切,前者纯化回收大片段,后者纯化回收1.9kb片段,再将回收的pcDNA3.1大片段与t-PA基因片段(1.9kb)重组.对重组pcDNA3.1t-PA质粒进行单酶切和双酶切鉴定,并测序.结果成功地从胎儿肺组织中克隆了t-PA基因,并构建了以pcDNA3.1为载体的真核表达质粒载体.结论含t-PA基因新型表达质粒构建的成功将为基因防治血管重建术中局部血栓形成奠定基础.     

人乳腺癌细胞HYAL1基因真核表达载体的构建及其在MCF-7和ZR-75-30细胞中的表达

目的 构建人乳腺癌HYAL1基因的真核表达载体并稳定转染HYAL1基因低表达的乳腺癌MCF-7和ZR-75-30细胞株,为进一步探讨HYAL1基因在乳腺癌的侵袭和转移中的作用奠定基础.方法 采用RT-PCR技术从高表达HYAL1的人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S中扩增透明质酸酶HYLAL1基因,并将其插入真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO中,构建的重组表达质粒经脂质体介导转染HYAL1基因低表达的乳腺癌MCF-7和ZR-75-30细胞.结果 用RT-PCR成功地扩增出1条1 332 bp的DNA片段,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序证明已经成功构建了人乳腺癌HY-AL1基因的真核表达载体.RT-PCR证明转染了重组质粒的乳腺癌MCF-7和ZR-75-30细胞可以高效稳定的表达HYAL1基因,且其穿透细胞外基质的能力增强.结论 成功构建了人乳腺癌HYAL1基因的真核表达载体,获得了稳定表达人HYAL1基因的MCF-7和ZR-75-30细胞克隆,且其侵袭能力增强.     

重组质粒pDNR-Dual-Rab25的构建及其在人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中的表达

目的:构建真核表达质粒pDNR-Dual-Rab25,并在人乳腺癌细胞MDA-MB-231(MM231)中表达.方法:采用DNA重组技术将Rab25cDNA片段与载体pDNR-Dual连接,转染至人乳腺癌细胞株MM231中, G418筛选细胞,RT-PCR检测MM231细胞中Rab25基因的表达, MTT法检测MM231细胞增殖活性,绘制细胞生长曲线.结果:经PCR、酶切及测序鉴定均证实重组质粒pDNR-Dual-Rab25构建成功,转染的人乳腺癌细胞株MM231中能扩增出与Rab25目的基因片段大小一致的DNA片段,说明该质粒经转染后能够在MM231细胞中稳定表达.经MTT法检测,转染重组质粒pDNR-Dual-Rab25的MM231细胞的增殖力明显增强.结论:成功构建真核表达质粒pDNR-Dual-Rab25,转染至MM231细胞后成功表达,且细胞增殖力明显增强,为研究Rab25基因对乳腺癌的影响提供了实验依据.     

人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。     

TIMP-3基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌MDA-MB-453细胞生长及侵袭的抑制作用

目的: 构建组织基质金属蛋白酶抑制剂3(TIMP-3)真核表达载体并转染乳腺癌MDA-MB-453细胞,探讨TIMP-3对MDA-MB-453细胞生长及侵袭的抑制作用。 方法: 采用RT-PCR法从人新鲜胎盘组织中获得TIMP-3 cDNA,连接至pMD18-T载体,EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切pMD18-T-TIMP3重组质粒及pcDNA3.1载体并连接,构建pcDNA-TIMP-3真核载体,酶切鉴定、测序。将乳腺癌MDA-MB-453细胞分为正常对照组、pcDNA空载体组(只转染pcDNA空载体)和pcDNA-TIMP-3组(转染pcDNA-TIMP-3)。Western blotting法测定蛋白表达,采用MTT法和Boyden小室侵袭实验测定各组细胞的增殖活性及侵袭能力。 结果: 重组载体经过EcoRⅠ 和XbaⅠ酶切后,产生633bp的TIMP-3目的片段和pcDNA3.1线性化载体,经自动测序仪测定TIMP-3序列完全正确。转染重组载体后MDA-MB-453细胞稳定表达了TIMP-3,与正常对照组和pcDNA空载体组比较,pcDNA-TIMP-3组细胞增殖活性明显降低(P<0.05),穿透以Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)、层黏连蛋白(LN)、纤维连接蛋白(FN)和玻璃连接蛋白(VN)包被的Matrigel膜的侵袭细胞数明显减少(P<0.05)。 结论: 成功构建pcDNA3.1-TIMP-3真核表达载体,可在MDA-MB-453细胞中高表达TIMP-3蛋白,并对MDA-MB-453细胞生长及侵袭性有抑制作用。     

人Fn14基因真核重组质粒的构建及其表达

目的构建人成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14（fibroblast growth factor—inducible 14，Fn14）基因真核重组质粒及其表达。方法从人肝细胞癌组织抽取总RNA，RT—PCR扩增出Fn14基因全长cDNA，经测序正确后，核酸内切酶EcoR I、Xba I酶切PCR产物，亚克隆人pcDNA3．1-Myc载体，重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经酶切及测序鉴定正确后转染COS-7细胞，通过免疫组织化学DAB法检测Myc—Fn14融合蛋白的表达。结果重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经EcoR I、Xba I酶切及测序鉴定正确，重组质粒包含人Fn14基因完整编码区。免疫组织化学检测结果显示，重组质粒转染COS-7细胞后成功表达Myc—Fn14融合蛋白，转染空载体pcD—NA3．1-Myc的COS-7细胞未见Myc—Fn14融合蛋白表达。结论构建了人Fn14基因真核表达载体，该重组质粒可表达含Myc-Fn14的融合蛋白，为研究Fn14功能奠定了基础。     

人HSP70真核载体的构建及其在胆囊癌细胞中的表达

目的构建真核表达载体pcDNA3．0-Hsp70，并在胆囊癌细胞SGC996中进行表达。方法构建真核表达载体pcDNA3．0-Hsp70，经EcoRⅠ及BarnHⅡ双酶切鉴定并测序；通过脂质体法转染SGC996胆囊癌细胞，经G418抗性筛选获得稳定表达细胞株；用流式细胞术检测其表达情况。结果酶切电泳和DNA测序证实载体构建正确；体外转染入SGC996细胞中后，可见转染细胞有Hsp70蛋白的表达。结论成功构建了pcDNA3．0-Hsp70真核表达载体，为研究Hsp70在肿瘤免治疗中的作用奠定了基础。     

恢复野生型PTEN基因表达对炎性乳腺癌MDA-MB-468体外生物学行为的影响

目的研究野生型PTEN基因转染对人炎性乳腺癌MDA—MB-468细胞体外生物学行为的影响及机制。方法应用基因重组技术构建重组质粒pcDNA3．1-PTEN，用脂质体转染乳腺癌细胞株MDA—MB-468，用RT—PCR、免疫组化及免疫印迹方法分析目的基因及其蛋白表达，并用免疫印迹方法检测转染后，在表皮生长因子的诱导下，磷酸化蛋白激酶B（PKB／Akt）的表达，四甲基唑蓝（MTT）法分析细胞增殖。Annexin V—FITC和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果RT—PCR、免疫组化及免疫印迹显示pcDNA3．1-PTEN转染组有PTEN mRNA及其蛋白表达，且显示转染组在表皮生长因子的诱导下，p-Akt蛋白表达下调。MTT检测表明pcDNA3．1-PTEN转染组活细胞数较其它各组均低（P〈0．01），流式细胞分析其凋亡率达21．68％。结论野生型PTEN基因依赖其磷酸酶活性可诱导乳腺癌MDA—MB-468细胞凋亡。     

CCNL1真核表达载体的构建及其在MDA-MB-231细胞中表达的鉴定

目的:构建pcDNA3.1(+)-CCNL1、pVAX Ⅰ -CCNL1和pEGFP-C1-CCNL1三组重组载体,鉴定其在MDA-MB-231细胞中的表达情况.方法:用PCR方法扩增得到CCNL-1基因,然后用EcoR Ⅰ、HindⅢ酶切CCNL1基因,将其分别与pcDNA3.1(+)、pVAX Ⅰ和pEGFP-C1...     

人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肺癌细胞转染

目的: 构建正义和反义人肝素酶与绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肺癌细胞株95C及高转移细胞株95D. 方法: 采用基因重组技术,用EcoRⅠ从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7 kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入 pIRES2-EGFP质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肺癌细胞株95C、反义真核表达载体转入人高转移肺癌细胞株95D,G418筛选后,荧光倒置显微镜检测转染结果. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成5.3 1.7 kb两条DNA片段,而反义重组质粒为6.5和0.5 kb两条DNA片段,与理论计算值完全一致;转染后肺癌细胞倒置荧光显微下呈绿色荧光. 结论: 成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体,并成功转染人低、高转移肺癌细胞株,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肿瘤细胞的影响奠定了基础.     

肌细胞增强因子2A基因真核表达质粒的构建及对乳腺癌细胞MCF-7增殖能力的影响

目的：构建肌细胞增强因子2A（MEF2A）基因真核表达重组质粒,并转染乳腺癌细胞株观察其对细胞增殖能力的影响。方法：实时定量聚合酶链反应（RT-QPCR）检测MCF-7、BT474及MDA-MB-231等3种乳腺癌细胞中MEF2A mRNA的表达。采用全基因合成法合成MEF2A编码区序列,克隆入pcDNA3.1（＋）-HA载体,构建重组质粒pcDNA3.1-MEF2A-HA。重组质粒转染乳腺癌细胞,采用Western blot及RT-QPCR检测MEF2A的表达效率。细胞计数实验检测细胞的增殖能力。结果：3株乳腺癌细胞中,MDA-MB-231细胞中MEF2A mRNA表达水平较低;其基因测序结果显示与预期片段大小一致,表明MEF2A重组质粒构建成功。将MEF2A重组质粒瞬时转染MDA-MB-231细胞后,MEF2A表达质粒组与对照组比较,其MEF2A表达升高,细胞增殖能力增强。结论：成功构建MEF2A过表达重组质粒,在MDA-MB-231中过表达MEF2A促进细胞的增殖能力。     

RNAi沉默IBP基因表达对乳腺癌细胞的抑制作用

目的 构建IRF-4结合蛋白(IBP)基因RNA干扰 (RNAi) 的真核表达载体,观察其对MDA-MB-231乳腺癌细胞内IBP基因表达及细胞增殖和侵袭力的影响.方法 以IBP为靶基因,以pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR质粒为载体,设计构建4对重组体,并进行DNA测序鉴定.重组载体转染MDA-MB-231细胞后,选择转染效果最好的1对重组体建立稳定转染的细胞株,经RT-PCR和Western blot检测重组表达质粒对IBP mRNA和蛋白表达的抑制效果;MTT法检测对各组细胞生长的影响;细胞体外侵袭实验测定对侵袭力的影响.结果 重组体测序结果与目的序列完全一致;重组体转染MDA-MB-231细胞后IBP的mRNA和蛋白表达降低约70%;IBP表达下调后乳腺癌细胞增殖减缓(P<0.05);同时体外侵袭实验显示转染后乳腺癌发生迁移细胞数明显低于未转染组和空质粒对照组[分别为(25±7)、(67±6)、(68±5),P<0.05].结论 下调IBP能有效降低乳腺癌细胞的增殖和侵袭力.     

HOXA5基因真核表达质粒的构建及在乳腺癌细胞中的功能研究

目的：构建HOXA5基因真核表达重组质粒,并转染乳腺癌细胞株观察其对细胞迁移能力的影响。方法：实时定量聚合酶链反应（RT-QPCR）检测MCF7、BT474及MDA-MB-231等3种乳腺癌细胞中HOXA5 mRNA的表达。采用全基因合成法合成HOXA5编码区序列,克隆入pcDNA3.1（＋）载体,构建重组质粒pcDNA3.1-HOXA5。重组质粒转染乳腺癌细胞,采用Western blot及RT-QPCR检测HOXA5的表达效率。观察细胞形态并通过细胞划痕实验检测细胞的迁移能力。结果：3株乳腺癌细胞中,MDA-MB-231细胞中HOXA5 mRNA表达水平较低。其基因测序结果显示与预期片段大小一致,表明HOXA5重组质粒构建成功。将HOXA5重组质粒瞬时转染MDA-MB-231细胞后,检测到其mRNA和蛋白表达水平均明显上调,MDA-MB-231细胞的迁移能力降低,EMT相关转录因子Twist的表达显著下调。结论：成功构建HOXA5过表达重组质粒,在MDA-MB-231中过表达HOXA5抑制乳腺癌的迁移能力。