表达幽门螺杆菌UreA和KatA双价抗原的鼠伤寒菌疫苗株的初 …

目的 构建表达幽门螺杆菌（Ｈｐ）尿素酶Ａ亚单位（ＵｒｅＡ）和过氧化氢酶（ＫａｔＡ）的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,对研制抗Ｈｐ感染重组疫苗的可行性进行探讨。方法 ＰＣＲ方法从Ｈｐ基因组中扩增出ｕｒｅＡ和ｋａｔＡ片段,将其插入ｐＧＳＴａｇ表达载体中,重组质粒再转入减毒鼠伤寒沙门氏菌,结果 对重组质粒进行限制酶切分析和ＰＣＲ检测,证实两种基因已被克隆入ｐＧＳＴａｇ,并转入减毒鼠伤寒沙门氏菌。结论 本研究成     

鼠伤寒沙门氏菌疫苗株产生的重组多房棘球绦虫抗原诱导小鼠和犬的体液和细胞免疫应答

作者用DNA重组技术将多房棘球绦虫特异性抗原的基因片段转入减毒活鼠伤寒沙门氏菌疫苗LT2MIC株中复制表达,以研制能诱发中间宿主和终宿主保护性免疫应答的多价疫苗。将携带多房棘球绦虫基因片段(产生种特异性抗原Ⅱ/3—10)的重组pVM II/3-10质粒,转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗LT2MIC株虫,作为重组疫苗;将不含插入基因的pUR278质粒转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗LT2MIC     

重组幽门螺杆菌疫苗诱导小鼠产生THL型保护性应答及免疫后胃炎

目的 研究以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体构建的重组幽门螺杆素酶A亚单位及过氧化氢酶、／尿素酶A亚单位融合蛋白疫苗对小鼠的免疫保护作用及相关机制。方法 将表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)尿素酶A亚单位(UreA)、过氧化氢酶(KatA)及尿素酶A亚单位／过氧化氢酶融合蛋白(Urea／KatA)的减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)分别灌胃免疫小鼠,另设单纯减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫鼠和生理盐水免疫鼠为对照。免疫4周后以幽门螺杆菌活菌攻击,比较各组胃粘膜的幽门螺杆菌定植密度,攻击前后三清中抗幽门螺杆菌抗体IgGI,IgG2a和IgA的变化,脾脏和胃粘膜中γ干扰素(IFN-γ)和白介素4(IL-4)mRNA表达变化及胃粘膜炎症情况。结果(1)KarA及Urea／Kara组的幽门螺杆菌定植密度显下降,Urea组下降不明显。(2)和生理盐水组相比攻击前各鼠伤寒沙门氏菌免疫组IgGI,IgG2a均轻度升高而IgA无变化,攻击后各鼠伤寒沙门氏菌免疫组IgG2a升高显,KatA和Urea／KatA组尤为明显,而IgGI和IgA的升高无统计学差异。(3)胃粘膜攻击前生理盐水组无IFN-γ表达,其余各组均100％表达;攻击后生理盐水组IFN-γ轻度表达但仍明显低于各鼹伤寒沙门氏菌免疫组。IL-4在攻击前后各组均无表达。(4)脾IFN-γ和IL-4在所有组攻击前后均全部表达。(5)攻击前各组鼠胃粘膜仅有散在少量白细胞,攻击后各鼠伤寒沙门氏菌免疫组出现明显以淋巴及单核细胞浸润为特征的炎症反应。结论以减毒鼠伤察沙门氏菌为载体构建的重组幽门螺杆菌疫苗(Katk、urek/kalk)可在小鼠体内诱导出以TH1反应为主并伴随免疫后胃炎均保护性免疫应答。     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白核酸疫苗实验研究

目的 构建幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(Hp-NAP)口服DNA疫苗，初步评价其免疫治疗作用，为Hp疫苗研制奠定基础。方法 PCR扩增全长Hp-NAP基因(napA)，测序并同源性分析后，亚克隆入真核表达载体pIRES，双酶切并PCR鉴定。将重组质粒plRES-napA转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207，口服接种长期感染Hp之BALB／c小鼠，观察疗效。结果PCR扩增出-435bp产物，序列分析表明，所克隆序列与CenBank中SSl-napA核苷酸及蛋白质同源性均＞98％。PCR及双酶切证实，成功构建了携带napA的重组减毒鼠伤寒沙门菌DNA疫苗。疫苗接种后4周，治疗组3／4小鼠快速尿素酶检测阴性，对照组均阳性(P=0．0476)；治疗组血清抗Hp-NAP抗体效价明显升高。结论 成功构建了具有较好免疫治疗作用的Hp—NAP口服重组DNA疫苗，为进一步研制多价抗HpDNA疫苗奠定了基础。     

携带幽门螺杆菌hpaA基因减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建

构建携带幽门螺杆菌（H.pylori)hpaA基因的重组活减毒鼠伤沙门疫苗菌。方法：用分子生物学方法将hpaA基因克隆入原核表达质粒pTrc99A,并进行核苷酸测序,重组质粒经再导入活减毒鼠伤寒沙门菌SL3261,提取重组菌苗质粒,聚合酶链反应（PCR）和酶切鉴定,筛选目的克隆。结果：经PCR和酶切证实,构建了携带hpaA基因（560bp)的重组核表达质粒pTrc99A-hpaA,并将后者成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL3261。结论：S我建并鉴定了携带H.pylorihpaA基因的重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌,为探索制备H.ylori口服份活疫苗奠定了基础。     

表达幽门螺杆菌hpaA基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌对小鼠的免疫保护作用

目的　克隆幽门螺杆菌 (H pylori)全长hpaA基因 ,构建表达HpaA蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 ,并研究其对小鼠的免疫保护作用。方法　用PCR扩增全长hpaA基因 ,经适当的酶切 -连接反应将其连入原核表达质粒 pTrc99A ,并进行了基因测序。重组质粒经鉴定后再导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL32 6 1,提取重组菌质粒 ,PCR和酶切鉴定 ,筛选阳性克隆。用SDS -PAGE电泳和Westernblot进行HpaA表达分析和鉴定 ,用薄层扫描分析HpaA含量。重组菌 3× 10 8CFU/ 0 4ml/只免疫C5 7BL/ 6小鼠 ,4周后H pyloriSS110 5CFU/只攻击小鼠 ,再 5周后处死小鼠 ,取腺胃做快速尿素酶试验和Giemsa染色 ,以明确H pylori定植情况 ,对照观察免疫保护效果。 结果　经PCR和酶切证实 ,构建了含 783bphpaA基因的重组原核表达质粒 pTrc99A -hpaA ,并将后者成功转化了减毒鼠伤寒沙门氏菌。重组菌能表达约 30kDaHpaA蛋白 ,重组HpaA量约占全菌体蛋白量的 38 9% ,Westernblot证实其有免疫反应性。重组菌对小鼠免疫保护率为 4 3 4 8% (10 / 2 3) ,与空白对照组比统计差异显著 (P =0 0 1)。结论　构建了表达H pyloriHpaA的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 ,该菌株对C5 7BL/ 6小鼠有免疫保护作用。     

携带幽门螺杆菌热休克蛋白B亚单位基因重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建和鉴定

背景：幽门螺杆菌(h.pylori)是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的重要致病菌，以减毒鼠伤寒沙门菌为载体构建活疫苗己成为探索新型H．pylori疫苗的重要途径。目的：构建携带H．pylori热休克蛋白B亚单位(hspB)基因的重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌。方法：应用基因工程技术将1640bp的hspB基因克隆入原核表达质粒pTrc99A。对重组质粒进行序列测定，并将测序结果与基因文库中H.pylori-hspB的基因和蛋白序列进行BLAST分析，再将重组质粒导入活减毒鼠伤寒沙门菌SL3261。结果：重组质粒经聚合酶链反应(PCR)和双酶切，证实构建了携带hspB基因的重组原核表达质粒pTrc99A—hspB，后者成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL3261。所构建的重组质粒pTrc99A—hspB中所含的H.pylori-hspB与基因文库中量H.pylori-hspB基因和蛋白的同源性均为97％。结论：成功构建并鉴定了携带量H.pylori-hspB基因的重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌，为研制H.pylori口服疫苗奠定了基础。     

表达幽门螺杆菌NAP蛋白的减毒沙门疫苗菌株预防幽门螺杆菌感染

目的建立表达幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)中性粒细胞活化蛋白(Hp-NAP)的减毒沙门疫苗菌,并利用人类幽门螺杆菌感染的小鼠模型研究疫苗菌对Hp感染的免疫保护作用。方法利用分子克隆技术构建携带Hp-NAP基因的重组原核表达质粒pTrc99A-NAP,经PCR及酶切鉴定后测定其基因序列,并与美国国立医学图书馆基因文库中相关序列的同源性进行比较。重组质粒pTrc99A-NAP转化减毒伤寒沙门菌SL3261,培养后筛选阳性菌落,抽提质粒进行PCR及酶切鉴定。表达的Hp-NAP蛋白用SDS-PAGE和West-blotting进行鉴定,用薄层扫描分析蛋白含量。C57BL/6小鼠随机分成4组,分别灌胃给予生理盐水(A组)、减毒鼠伤寒沙门菌SL3261(B组)、携带pTrc99A的SL326组(C组)、携带pTrc99A-NAP的SL326组重(D组)。免疫后4周,予Hp攻击,攻击菌量107CFU/只,灌胃2次,每日1次。攻击4周后处死动物,取胃组织分别行改良Giemsa染色及定量细菌培养,观察Hp定植情况。结果核苷酸序列测定及同源性分析证实,克隆的Hp-NAP基因与GenBank中相关序列的同源性为98%(397/402),氨基酸序列的同源性为98%(131/133)。pTrc99A-NAP转化的减毒沙门菌,可表达Mr约15000的Hp-NAP蛋白,表达量约占菌体蛋白量的37·5%;表达的新生蛋白能与小鼠抗Hp血清特异性反应,具有良好的免疫原性。同空白对照组、SL3261组和SL3261(pTrc99A)组相比,表达Hp-NAP的疫苗株组实验动物的胃组织Hp定植密度明显下降(P<0·05)。结论成功构建表达Hp-NAP的减毒沙门疫苗菌;重组疫苗菌对小鼠Hp感染具有一定免疫预防作用,可作为未来多组分重组减毒沙门疫苗菌的侯选菌株之一。     

以白细胞介素-2为免疫佐剂的幽门螺杆菌尿素酶B亚单位核酸疫苗的构建及其免疫保护作用

背景：细胞因子具有免疫佐剂效应，但将其用作幽门螺杆菌（H．pylori）核酸疫苗佐剂的研究报道尚少。目的：构建同时含H．pylori尿素酶B亚单位（ureB）基因和小鼠白细胞介素-2（IL-2）基因的重组活减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗，体外鉴定其表达蛋白的免疫原性，体内检测其对H．priori感染的免疫保护作用。方法：以聚合酶链反应（PCR）扩增H．priori ureB基因和小鼠IL-2基因，分别插入pUCmT载体，测序，通过一系列酶切、连接反应分别克隆人真核表达载体pIRES，酶切、PCR鉴定；重组质粒pIRES-ureB和pIRES-ureB-IL-2分别转化减毒鼠伤寒沙门菌LB5000，抽提质粒，进一步转化终宿主菌SL7207，反复传代培养。以Lipofectamine^TM2000将重组质粒分别体外转染COS-7细胞，蛋白质印迹法检测表达蛋白的免疫原性。以疫苗菌经口接种小鼠，4周后予H．pylori攻击，攻击后4周鉴定H．pylori感染状况。结果：测序结果显示扩增出的ureB和IL-2基因序列与GenBank中的H．pylori ureB和小鼠IL-2序列一致，酶切、PCR鉴定证实ureB和IL-2基因已克隆人pIRES载体，并成功构建了稳定的含H．pylori ureB和小鼠IL-2基因的重组活减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗。蛋白质印迹法显示，pIRES-ureB-IL-2转染的COS-7细胞表达特异性UreB和IL-2蛋白。体内实验显示，疫苗接种组小鼠的免疫保护率显著高于PBS对照组（P〈0．01），其中ureB-IL-2疫苗组又显著高于ureB疫苗组（87．5％对62．5％，P〈0．05）。结论：成功构建了编码H．pylori ureB和免疫佐剂IL-2基因的重组活减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗，体外实验证实其可表达具有免疫原性的抗原蛋白和佐剂蛋白，体内实验证实其对小鼠H．pylori感染具有免疫保护性，免疫佐剂IL-2可提高核酸疫苗的免疫保护率。     

多组分重组减毒沙门疫苗菌对幽门螺杆菌感染的免疫保护作用

目的　利用人类幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)感染的小鼠模型研究多组分重组减毒沙门疫苗菌对幽门螺杆菌感染的免疫保护作用。方法　将二级C5 7BL/ 6小鼠随机分成 6组 ,通过灌胃方法分别给予生理盐水 (A组 )、PBS(B组 )、减毒鼠伤寒沙门菌SL32 6 1(C组 )、重组减毒鼠伤寒沙门菌pTrc99A -ureB +pGSTag -katA(D组 )、重组减毒鼠伤寒沙门菌pTrc99A -ureB +pTrc99A -HPaA(F组 )及重组减毒鼠伤寒沙门菌 pTrc99A -ureB +pGSTag -katA +pTrc99A -HPaA(F组 )。免疫后 4周 ,予Hp进行攻击 (A组不攻击 )。攻击菌量 10 7CFU/只 ,灌胃 2次 ,每日 1。再 4周后处死动物 ,取胃组织分别行尿素酶试验、改良Giemsa染色及定量细菌培养 ,观察Hp定植情况。行HE染色观察胃粘膜组织炎症情况。取脾组织行淋巴细胞增殖试验。结果　A组小鼠Hp定植密度为 0 ,B组为 9 4 9× 10 6CFU/ g胃组织 ,C组为 1 4 2× 10 6CFU/ g胃组织 ,D组、E组和F组小鼠分别为 2 92× 10 5CFU/g、5 5 1× 10 5CFU/g和 2 16× 10 5CFU/g胃组织 ,C组、D组、E组和F组与A组和B组相比定植密度均明显降低 (P <0 0 5 )。免疫组与对照组胃粘膜均无明显炎症反应。免疫组脾淋巴细胞增殖试验阳性。结论　口服多组分重组减毒沙门疫苗菌对小鼠Hp感染具有一定免     

表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建和鉴定

目的构建表达幽门螺杆菌(Helicobacter     

Construction of a recombinant attenuated Salmonella typhimurium DNA vaccine carrying Helicobacter pylori hpaA

AIM: To construct a recombinant attenuated Salmonella typhimurium DNA vaccine carrying Helicobacter pylori hpaA gene and to detect its immunogenicity. METHODS: Genomic DNA of the standard H pylori strain 17 874 was isolated as the template, hpaA gene fragment was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into pUCmT vector. DNA sequence of the amplified hpaA gene was assayed, then doned into the eukaryotic expression vector pIRES through enzyme digestion and ligation reactions. The recombinant plasmid was used to transform competent Escherichia coliDH5α, and the positive clones were screened by PCR and restriction enzyme digestion. Then, the recombinant pIRES-hpaA was used to transform LB5000 and the recombinant plasmid isolated from LB5000 was finally used to transform SL7207. After that, the recombinant strain was grown in vitro repeatedly. In order to identify the immunogenicity of the vaccine in vitro, the recombinant pIRES-hpaA was transfected to COS-7 cells using Lipofectamine~(TM)2000, the immunogenicity of expressed HpaA protein was detected with SDS-PAGE and Western blot. RESULTS: The 750-base pair hpaA gene fragment was amplified from the genomic DNA and was consistent with the sequence of H pylori hpaA by sequence analysis. It was confirmed by PCR and restriction enzyme digestion that H pylori hpaA gene was inserted into the eukaryotic expression vector pIRES and a stable recombinant live attenuated Salmonella typhimurium DNA vaccine carrying H pylori hpaA gene was successfully constructed and the specific strip of HpaA expressed by pIRES-hpaA was detected through Western blot. CONCLUSION: The recombinant attenuated Salmonella typhimurium DNA vaccine strain expressing HpaA protein with immunogenicity can be constructed and it may be helpful for further investigating the immune action of DNA vaccine in vivo.     

表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的减毒鼠伤寒杆菌口服疫苗的制备

目的制备抗幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)减毒鼠伤寒杆菌活菌疫苗,观察其免疫效果.方法构建表达UreB的原核表达载体PTc01-UreB并转化减毒鼠伤寒杆菌SL3261,得到重组菌SL3261/PTc01-UreB.应用抗Hp菌体蛋白兔血清行Western-blot检测UreB在SL3261中的表达.将SL3261/PTc01-UreB口服免疫Balb/c小鼠,12周后应用ELISA检测肠液和血清中的特异性抗体反应.SL3261/PTc01-UreB在Luria-Bertani培养液中连续传代60代以确定其稳定性.结果成功构建PTc01-UreB原核表达载体.Western-blot显示,其转化减毒鼠伤寒杆菌SL3261后能表达相对分子质量约61×103的蛋白,与HpUreB亚单位相符,具有抗原性.口服免疫小鼠后,在肠液和血清中可分别检测到针对UreB的特异性IgA和IgG抗体.体外连续培养60代未见PTc01-UreB质粒丢失及对宿主细胞毒性.结论表达HpUreB的减毒鼠伤寒杆菌SL3261/PTc01-UreB可用作抗Hp感染口服疫苗.     

Construction of an oral recombinant DNA vaccine from H pylori neutrophil activating protein and its immunogenicity

INTRODUCTION The discovery of H pylori has brought about a revolution in the research of etiological factors of gastrointestinal diseases[1]. It has been confirmed that H pylori is the main cause of chronic superficial gastritis, chronic active gastritis …     

Oral attenuated Salmonella typhimurium vaccine against MG7-Ag mimotope of gastric cancer

AIM: To develop an oral attenuated Salmonella typhimurium vaccine against gastric cancer and to evaluate its efficacy in mice. METHODS: A complementary sequence of Nco Ⅰ site and a sequence coding for MG7-Ag mimotope were designed at the 5'terminus of forward primer. Using p1.2 Ⅱ-HBCAg plasmid as template, PCR was performed to get a fusion gene of the mimotope and a HBcAg gene. The fusion gene was then subcloned into the plasmid pYA3341 complementary to Salmonella typhimurium X4550, and the recombinant plasmid was then transformed into attenuated Salmonella typhimurium X4550. Balb/c mice were orally immunized with the recombinant Salmonella typhimurium X4550. The mice were immunized every 2 wk to reinforce the immunity. At the 6th wk, serum titer of antibody was detected by ELISA, and at the 8th wk, cellular immunity was detected by 51Cr release test. Ehrlich ascites carcinoma cells expressing MG7-Ag were used in tumor challenge assay as a model to evaluate the protective effect of the vaccine. RESULTS: Serum titer of antibody against MG7-Ag was significantly higher in mice immunized with the vaccine than in control groups (0.9538±0.043 vs 0.6531±0.018, P<0.01; 0.9538±0.043 vs 0.6915±0.012, P<0.01), while in vitro 51Cr release assay of the splenocytes showed no statistical difference in the three groups. Two weeks after tumor challenge, 1 in 5 immunized mice was tumor free, while all the mice in the control group presented tumor. CONCLUSION: Oral attenuated Salmonella typhimurium vaccine against the MG7-Ag mimotope of gastric cancer is immunogenic. It can induce significant humoral immunity against tumors in mice, and has some protective effects.